Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проект посвящен исследованию механизма клеточной смерти при фотодинамическом воздействии на клетки злокачественных опухолей головного мозга (глиомы) и оценка её иммуногенности. Основанием для разработки подходов к более широкому применению фотодинамической терапии (ФДТ) в нейроонкологии являются результаты экспериментальных и первых клинических исследований, которые показывают значительное увеличение выживаемости пациентов и удлинение безрецидивного интервала, а также уменьшение риска тяжелых неврологических осложнений. Последние исследования в данной области показали, что при проведении лечения регулируемые программы гибели злокачественных клеток могут либо подавлять, либо увеличивать их иммуногенный потенциал. Поэтому чрезвычайно важно охарактеризовать не только токсичность фотосенсибилизаторов при различных режимах проведения ФДТ и тип клеточной гибели, но и молекулярные и иммунологические аспекты гибели клеток опухолей. Одной из ключевых задач первого этапа выполнения проекта являлся выбор фотодинамических агентов, вызывающих эффективную гибель опухолевых клеток глиомы при фотодинамическом воздействии, но обладающих при этом низкой токсичностью для нормальных клеток головного мозга. В качестве фотодинамических агентов были использованы следующие соединения: 1. фотосенсибилизаторы, широко применяемые в настоящее время в клинической практике в России – фотосенс (смесь ди-, три- и тетразамещенных фракций фталоцианина алюминия с числом сульфо-групп 3,4), фотодитазин (N-диметилглюкаминовая соль хлорина e6); 2. фотосенсибилизатор, широко применяемый в клинической практике в европейских странах, в отношении которого ранее была показана индукция иммуногенной клеточной смерти – гиперицин; 3. соединения собственной разработки из группы тетра(арил)тетрацианопорфиразинов с различными арильными группами в качестве боковых заместителей: фенантреном (Pz I), бифенилом (Pz II), фторбензил-О-фенилом (Pz III) и диэтил-N-фенилом (Pz IV) Общее количество соединений составило 7. Для всех исследованных соединений получены спектры поглощения и флуоресценции. Были исследованы особенности скорости поступления и внутриклеточной локализации тестируемых фотосенсибилизаторов в отношении постоянной клеточной линии глиомы мыши GL261. Показано, что накопление значимого количества всех тестируемых фотосенсибилизаторов в клетках глиомы наблюдалось уже через несколько часов инкубации. Среди порфиразинов наибольшую скорость интернализации показал Pz I, среди коммерческих фотосенсибилизаторов - гиперицин. Наименьшая скорость показана для фотосенса, наиболее гидрофильного соединения из всех исследуемых. Установлено, что исследуемые фотосенсибилизаторы существенно отличаются по внутриклеточной локализации (лизосомы, ЭПР и аппарат Гольджи). Ранее, на примере гиперицин-опосредованной фотодинамической гибели клеток при непосредственном участии руководителя Проекта было показано, что возможность развития иммуногенной клеточной гибели связана с локализацией фотосенсибилизатора в ЭПР и его способностью индуцировать так называемый ЭПР-стресс. В связи с этим, можно предполагать, что исследуемые фотосенсибилизаторы различаются по потенциальной способности к индукции иммуногенного типа клеточной смерти. Данный вопрос будет исследован на последующих этапах проекта. Для всех исследуемых фотосенсибилизаторов была проанализирована возможность индукции смерти клеток глиомы мыши GL261 при краткосрочной инкубации в темноте, а также при облучении в дозе 20 Дж/см2. При инкубации в темноте не было выявлено негативного влияния фотосенса в концентрациях до 100 мкМ. Использование фотодитазина и соединений Pz I-III в концентрациях более 30 мкМ существенно снижало жизнеспособность культуры. Наиболее выражена способность индуцировать клеточную смерть для Pz IV и гиперицина, при их использовании эффект наблюдался при превышении концентрации 10 мМ. Облучение в дозе 20 Дж/см2 приводило к гибели клеток при концентрациях фотосенсибилизаторов, не превышающих ~1 мкМ. Были рассчитаны значения IC50, соответствующие концентрации фотосенсибилизатора, индуцирующие смерть клеток с 50%-эффективностью. С целью предварительного установления типа клеточной смерти, индуцируемой при фотодинамическом воздействии с тем или иным фотосенсибилизатором, был проведен ингибиторный анализ. В работе были использованы ингибиторы, селективно блокирующие развитие апоптоза (панкаспазный ингибитор zVAD-fmk), некроптоза (ингибитор киназы RIP1 некростатин-1s) или ферроптоза (ловушка липидных радикалов ферростатин-1 и хелатор железа дефероксамин). Показано, что в случае всех исследованных фотосенсибилизаторов через 2 часа после облучения эффект ингибиторов был статистически незначим. При увеличении времени инкубации ответы клеток на фотодинамическое воздействие с исследуемыми соединениями различались, что подтверждает предположение, согласно которому тип индуцируемой клеточной гибели может различаться в зависимости от физико-химических свойств фотодинамического агента и его локализации в клетке. Для оценки возможных побочных эффектов, оказываемых фотодинамическими агентами на нормальные (неопухолевые) нервные клетки был проведен анализ отсроченной токсичности исследуемых фотосенсибилизаторов для первичных культур клеток головного мозга. Проведенный анализ позволил выявить, что несмотря на схожесть химической природы, все порфиразины (Pz I-IV) имеют разный уровень цитотоксичности. Наименьший цитотоксический эффект установлен для PzI и PzII. Ярко выраженный цитотоксический эффект показан для PzIII, а также для коммерческого фотосенсибилизатора фотодитазина. Фотодинамические агенты гиперицин и фотосенс обладают низкой темновой токсичностью по отношению к нормальным (неопухолевым) клеткам головного мозга. Анализ скорости накопления исследуемых фотосенсибилизаторов позволил установить, что коммерческие фотосенсибилизаторы гиперицин и фотодитазин, а также все порфиразины PzI, PzII, PzIII и PzIV активно накапливаются как в телах и отростках нейронов, так и глиальных клетках уже через несколько часов после начала инкубации. Наименьшей скоростью накопления в клетках нервной системы обладает фотосенсибилизатор фотосенс. На основании полученнных в ходе выполнения первого этапа проекта результатов были выбраны соединения для послеющих исследований. Основным критерием отбора являлась отсутствие выраженной токсичности для нормальных клеток головного мозга, поскольку наличие значительной токсичности ограничит практическое использование соответствующего соединения. На следующем этапе работ будут использоваться следующие фотосенсибилизаторы: гиперицин, фотосенс, PZ I/II.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект посвящен исследованию механизма клеточной смерти при фотодинамическом воздействии на клетки злокачественных опухолей головного мозга (глиомы) и оценка её иммуногенности. Основанием для разработки подходов к более широкому применению фотодинамической терапии (ФДТ) в нейроонкологии являются результаты экспериментальных и первых клинических исследований, которые показывают значительное увеличение выживаемости пациентов и удлинение безрецидивного интервала, а также уменьшение риска тяжелых неврологических осложнений. Последние исследования в данной области показали, что при проведении лечения регулируемые программы гибели злокачественных клеток могут либо подавлять, либо увеличивать их иммуногенный потенциал. Поэтому чрезвычайно важно охарактеризовать молекулярные и иммунологические аспекты гибели опухолевых клеток. На втором этапе выполнения проекта был проведен детальный анализ возможности гибели клеток глиомы GL261, подверженных фотодинамическому воздействию с применением коммерческих фотосенсибилизаторов фотосенс и фотодитазин, по механизмам иммуногенной клеточной смерти. Поскольку данные фотоагенты в настоящее время широко применяются в клинической практике, понимание иммуногенного потенциала фотосенсибилизаторов в перспективе позволит скорректировать тактику лечения и повысить эффективность противоопухолевой терапии на основе ФДТ. Для подтверждения универсальности выявляемых закономерностей, были оценены эффекты ФДТ с применением исследуемых фотосенсибилизаторов на клетки постоянной клеточной линии фибросаркомы мыши МСА205, широко используемой в экспериментальных исследованиях механизмов иммуногенной клеточной смерти. Нами были исследованы ответы опухолевых клеток на индукцию исследуемыми фотоагентами при фотодинамическом воздействии. Показано, что клетки, индуцированные ФДТ с применением как фотосенса, так и фотодитазина, вызывают активацию молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPs), являющихся маркерами активации иммуногенной клеточной смерти. Нами было зарегистрировано значимое повышение уровня поверхностного кальретикулина, активный выброс АТФ и HMGB1, что указывает на иммуногенную природу гибели опухолевых клеток. Помимо этого, оценена фагоцитирующая активность и фенотипические изменения антиген-презентирующих клеток в присутствии ФДТ-индуцированных опухолевых клеток. Установлено, что ФДТ-индуцируемые опухолевые клетки являются мощными индукторами фагоцитирующей активности дендритных клеток и обеспечивают их фенотипическое созревание (повышение экспрессии маркеров дифференцировки CD40, CD86). На модели профилактической противоопухолевой вакцинации in vivo наблюдались ярко выраженные признаки активации адаптивной иммунной системы. Установлено значимое снижение интенсивности/торможения развития опухолевых процессов после применения противоопухолевой вакцины на основе ФДТ-индуцированных опухолевых клеток. Проведенные in vitro и in vivo исследования показали, что индукция гибели опухолевых клеток посредством ФДТ с применением фотосенсибилизаторов фотосенс и фотодитазин активирует адаптивный иммунный ответ, что является одним из важных свойств иммуногенной клеточной смерти. По завершении 2-го этапа выполнения проекта опубликовано 2 статьи в изданиях, индексируемых базами данных WoS и Scopus, 1 из которых входит в первый квартиль (Q1). Также принята в печать экспериментальная статья в журнал Journal for ImmunoTherapy of Cancer (импакт фактор по WoS = 8.728, Q1), входящий в топ 10% журналов в областях «immunology» (12/158) и «oncology» (19/230). Результаты исследований были представлены на 4-х международных, включая 2 зарубежные (Бельгия, США), и 2-х российских конференциях. Устный доклад Турубановой М.Д. на 72-й всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» был отмечен дипломом I степени.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект посвящен исследованию механизма клеточной смерти при фотодинамическом воздействии на клетки злокачественных опухолей головного мозга (глиомы) и оценка её иммуногенности. На третьем этапе проекта исследованы иммуногенные свойства фотосенсибилизаторов собственной разработки из группы тетра(арил)тетрацианопорфиразинов с различными арильными группами в качестве боковых заместителей. Для подтверждения универсальности выявляемых закономерностей, были оценены эффекты фотодинамической терапии (ФДТ) с применением фотосенсибилизаторов pz I и pz III на клетки постоянной клеточной линии фибросаркомы мыши МСА205, широко применяемой в экспериментальных исследованиях механизмов иммуногенной клеточной смерти. Для клеточной линии МСА205 установлена скорость накопления и локализации фотосенсибилизаторов в опухолевых клетках, схожих с клетками глиомы GL261, а также тип клеточной смерти при проведении ФДТ. Проанализирована темновая токсичность и фотодинамическая активность (облучение в дозе 20 Дж/см2) фотосенсибилизаторов pz I и pz III в отношении клеток фибросаркомы МСА205. Проведение ингибиторного анализа позволило установить, что применение pz I при ФДТ индуцирует гибель клеток по апоптотическому пути, в то время как pz III-ФДТ активирует смешанный вид клеточной смерти, сочетающий черты апоптотической и некроптотической гибели. Фотодинамическое воздействие с применением pz I и pz III приводит к многократному повышению HMGB1 и свободного АТФ во внеклеточной среде, что предполагает их участие в роли DAMPs, обеспечивающих реализацию гибели клеток по иммуногенному пути. Показана высокая фагоцитирующая активность первичных культур дендритных клеток костного мозга мыши (ДК) в присутствии клеток фибросаркомы МСА205, погибающих в результате ФДТ с применением фотосенсибилизаторов pz I и pz III. Кроме того, ФДТ-индуцируемые опухолевые клетки обеспечивают фенотипическое созревание ДК, характеризующееся повышением экспрессии маркеров дифференцировки CD80, CD86. На модели профилактической противоопухолевой вакцинации in vivo наблюдались ярко выраженные признаки активации адаптивной иммунной системы. Установлено значимое снижение интенсивности/торможения развития опухолевых процессов после применения противоопухолевой вакцины на основе pz I-ФДТ и pz III-ФДТ. Проведение вакцинации ФДТ-индуцированными клетками фибросаркомы МСА205 иммунодефицитных мышей линии Nude подтвердило значимый вклад адаптивной иммунной системы в реализацию противоопухолевого ответа. По завершении 3-го этапа проекта опубликована экспериментальная статья в журнале Journal for ImmunoTherapy of Cancer (импакт фактор по WoS = 10.252, Q1), входящий в топ 6% журналов в областях «immunology» (10/159) и «oncology» (16/244). В статье Efimova Iu. et al. J ImmunoТher Cancer. 2020 впервые показаны выраженные иммуногенные свойства ранней ферроптотической гибели опухолевых клеток. Согласно Altmetric Attention Score (https://bmj.altmetric.com/details/94389453#score) данная статья имеет оценку 37 и входит в топ 5% наиболее часто отслеживаемых в Altmetric публикаций. Ранее на втором этапе проекта было показано, что ФДТ с применением коммерческого фотосенсибилизатора фотосенса активирует смешанный вид смерти клеток глиомы GL261, сочетающий черты апоптотической и ферроптотической гибели, для которого был установлен выраженный иммуногенный эффект (выход DAMPs, активация фагоцитоза и фенотипического созревания ДК, значимое торможение опухолевого роста в модели профилактической противоопухолевой вакцинации in vivo) (Turubanova et al. J ImmunoТher Cancer. 2019, 14 цитирований согласно WoS). Согласно Altmetric Attention Score (https://bmj.altmetric.com/details/73159302#score) эта статья имеет оценку 130 и входит в топ 5% наиболее часто отслеживаемых в Altmetric публикаций. Дополнительный анализ литературы и собственные экспериментальные данные позволили проследить, что реакции ферроптоза и фотодинамического воздействия могут работать в тонком синергизме друг с другом, поэтому справедливо предположить, что индукция ферроптоза при ФДТ является мощной альтернативной стратегией повышения эффективности проводимой противоопухолевой терапии, в частности опухолей резистентных к апоптозу и некроптозу. Выдвинутая нами гипотеза вынесена на обсуждение научному сообществу в виде статьи (тип Forum article) Mishchenko T.A., Balalaeva I.V., Vedunova M.V., Krysko D.V. New insights into effective anti-cancer strategy: a synergistic action of ferroptosis and photodynamic therapy в журнал Trends in Cancer (импакт фактор по WoS = 11.592, Q1) входящий в топ 6% журналов в области «oncology» (13/244). Эта статья находится на повторном рецензировании. Также в журнал Journal for ImmunoTherapy of Cancer принята в печать статья типа обзор Alzeibak R., Mishchenko T.A., Shilyagina N.Yu., Balalaeva I.V., Vedunova M.V., Krysko D.V. Targeting immunogenic cell death by photodynamic therapy: past, present and future (решение редактора о принятии статьи в печать от 02.12.2020 http://dx.doi.org/10.1136/jitc-2020-001926) (импакт фактор по WoS = 10.252, Q1, входящий в топ 6% журналов в областях «immunology» (10/159) и «oncology» (16/244)). Экспериментальная статья по результатам 3-го этапа проекта Turubanova V., Mishchenko T., Balalaeva I., Efimova Iu., Peskova N., Klapshina L., Lermontova S., Bachert C., Krysko O., Vedunova M., Krysko D.V. Novel porphyrazine-based photodynamic anti-cancer therapy induces immunogenic cell death находится на повторном рецензировании в журнале Scientific reports (Импакт фактор журнала WoS 4.576 Q1). Результаты исследований также были представлены на 3-х международных, включая 1 зарубежную (Швейцария), и 3-х российских конференциях. 3 устных доклада Турубановой В.Д. на всероссийских конференциях отмечены дипломами I степени. Результаты проекта регулярно освещались в российских и международных СМИ по всему миру.