Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение первого года выполнения проекта «Неивазивная визуализация естественного и индуцированного нейрогенеза» были проведены теоретические и экспериментальные исследования по следующим направлениям: - теоретические исследования по проектированию и выбору различных вариантов вирусных векторов, - постановка и оптимизация новой для лаборатории технике интрацеребральных микроинъекций, - эксперименты по введению вирусных векторов в мозг, - иммуногистохимическое исследование экспрессии белков генов-репортеров для сравнения эффективности и специфичности разных типов вирусных векторов. В рамках задачи 1 «Проектирования и синтеза различных вариантов вирусного вектора, предназначенного для маркирования новых нейронов in vivo» выполнен большой объём теоретических исследований по проектированию генетические вектора, которые при введении в мозг будут вызывать синтез ферритина только в молодых нейронах, присутствие которого можно будет выявить при помощи МРТ-сканирования. Теоретические задачи, которые были решены на этом этапе работ, включали подбор конкретных ДНК последовательностей для вставки в генетический вектор (промотор даблкортина, ген ферритина, ген зеленого флуоресцентного белка для дополнительного контроля специфичности), выбор типа вирусов для получения генетических векторов, их конструирование с учетом предельного размера вставки. В результате на основе лентивирусов и аденоассоциированных вирусов были спроектированы следующие генетические вектора: LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH, AAV(2-9)-DCX-FerrH, AAV(2-9)-DCX-eGFР. Для решения задачи 2 «Оптимизация процедуры введения вирусного вектора в мозг экспериментальных животных» научным коллективом была проведена большая работа по постановке методики процедуры введения вирусных векторов в мозг для эффективного заражения клеток в субвентрикулярной зоне вблизи боковых желудочков, являющейся основной зоной нейрогенеза в мозге. Для этого была модернизирована имеющаяся стереотаксическая установка, отработаны процедуры определения стереотаксических координат микроинъекции. Наиболее точное попадание произошло при выборе следующих координат: расстояние от Брегма 0.0 мм, латерально от срединного шва 3.5 мм, угол наклона 18.7о, глубина введения 4.67 мм. Экспериментально были определен объём вводимого раствора вирусных частиц, который не должен отрицательно повлиять на состояние тканей и в тоже время должен обеспечить успешную работу вирусных частиц. Экспериментально установлено, что при используемой нами концентрации вируса (примерно 10^8 частиц на 1 миллилитр) объём в 1 микролитр, вводимый в течение 10 минут, достаточен для высокоэффективного заражения клеток субвентрикулярной зоны (до 40%) и одновременно вызывает наименьшие повреждения мозговой ткани. В результате проведения экспериментов был создан и оптимизирован протокол интрацеребральной инъекции вирусного вектора в субвентрикулярную зону. Для решения задачи 3 «Сравнение различных вирусов в отношении эффективности и специфичности заражения молодых нейронов» были проведены серии микроиньекций с векторами на основе различных типов вирусов - лентивируса и аденоассоциированного вируса. Нами были использованы векторы: - аденоассоциированный вирус 2/9 серотипа, несущий ген eGFP под контролем промотора CAG (концентрация 9*10^8 в 1 миллилитре) - AAV2/9-CMV-eGFP; - лентивирус, несущий ген eGFP под контролем промотора FUGW (концентрация 9*10^8 в 1 миллилитре) - LV-FUGW-eGFP; - лентивирус, несущий ген TagGFP2 под контролем промотора CMV (концентрация 9*10^6 в 1 миллилитре) - LV-CMV-TagGFP2; - лентивирус, несущий ген тяжёлой цепи человеческого ферритина под контролем неспецифического вирусного промотора CMV (концентрация 9*10^8 в 1 миллилитре) - LV-CMV-FerrH. В результате обработки экспериментальных данных и валидации проведенных микроиньекций мы получили разный уровень экспрессии трансгенов. Предварительные исследования in vitro показали хороший уровень экспрессии TagGFP2, однако в исследованиях in vivo вектор, несущий ген TagGFP2, показал наименее выраженный уровень экспрессии зеленого флюоресцентного белка. В то же время остальные векторы, несущие трансгены eGFP или Ferr, показали высокий уровень экспрессии. Как и ожидалось, поскольку вирусные вектора содержали неспецифические промоторы, они активно заражали не только молодые нейроны, но и другие типы клеток. Для исследования эффективности и специфичности заражения молодых нейронов в субвентрикулярной зоне вирусными частицами мы провели иммуногистохимическое исследование, маркировав срезы мозга антителами к даблкортину. Сравнение эффективности и специфичности разных типов вирусов в отношении молодых нейронов показало, что лентивирусный и адено-ассоциированный вирусный векторы различаются как по эффективности, так и по специфичности заражения молодых нейронов. Оказалось, что лентивирусный вектор имеет более высокую эффективность, но меньшую специфичность заражения, по сравнению с адено-ассоциированным. Дополнительно, мы провели сравнение специфичности экспрессии в молодых нейронах двух разных генов-репортеров: ферритина и eGFP. Проведенный анализ показал, что, хотя оба лентивируса с одинаковой эффективностью заражали молодые нейроны, экспрессия гена ферритина в молодых нейронах была существенно выше экспрессии eGFP. Этот результат дополнительно подтверждает правильность выбора гена ферритина, как гена-репортера для прижизненной визуализации нейрогенеза в мозге. Задача 4 состояла в общении полученных данных и выборе наиболее подходящего вектора для детекции молодых нейронов in vivo. Исходя из полученных нами предварительных результатов относительно эффективности и специфичности протестированных векторов, нельзя сделать однозначный вывод о преимуществе одного из двух типов вирусов. Поэтому в 2019 году будут протестированы оба типа векторов, как на основе лентивирусов, так и на основе адено-ассоциированных вирусов, уже содержащие промотор даблкортина, специфичный в отношении молодых нейронов. Результаты проекта были представлены на 143-й Ежегодной Конференции Американской Неврологической Ассоциации (The American Neurological Association's 143rd Annual Meeting) в г. Атланта (США), с публикацией тезисов доклада в журнале Annals of Neurology (IF = 10.244), и крупнейшей международной конференции Общества Нейронаук (Society for Neuroscience) “Neuroscience 2018” в г. Сан Диего (США).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение второго года выполнения проекта «Неивазивная визуализация естественного и индуцированного нейрогенеза», в соответствии с планом работ на 2019 год, была проведена апробация методики визуализации нейрогенеза в мозге взрослых животных ex vivo и in vivo с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), проведены исследования специфичности генетических векторов в отношении молодых нейронов и перекрестной специфичности с нервными клетками других фенотипов (взрослых нейронов, астроцитов, микроглии), а также сопоставление результатов МРТ и иммуногистохимических исследований. В рамках задачи 1 «Разработка МРТ протокола для визуализации ферритина, экспрессируемого вирусными векторами» были разработаны протоколы сканирования для визуализации экспрессии ферритина в мозге грызунов. На первом этапе для исследований ex vivo использовался клинический томограф Philips 1.5 T (МРТ Лидер, Томск). Протокол включал Т2- и Т2*-взвешенные импульсные последовательности, которые были оптимизированы с целью повышения чувствительности скана к ферритину, улучшения соотношении сигнал-шум и пространственного разрешения изображений, и сокращения времени сканирования. Время сканирования мозга ex vivo после оптимизации составило 75 минут. Hам удалось получить приемлемое качество изображения на клиническом томографе, что позволило детектировать эксперссию ферритина и нейрогенез в мозге крыс. На втором этапе для визуализации ферритина в мозге грызунов in vivo использовался сверхвысокопольный томограф Bruker Biospec 11.7Т (ИЦиГ, г.Новосибирск). Из-за неисправности томографа эксперименты были начаты только в ноябре 2019 года и продолжаются в настоящее время. На начальном этапе экспериментов количество первоначально выбранных импульсных последовательностей было сокращено с 5 до 3, оптимизированы их параметры для получения изображений более высокого качества. Оптимизированный протокол включал в себя следующие импульсные последовательности: 1) T2-MSME-PD – Т2-взвешенная последовательность множественное эхо. 2) T2 TURBO RARE – T2-взвешенная последовательность турбо спин-эхо. 3) T2* MGE – T2*-взвешенная последовательность множественное градиентное эхо. В рамках задачи 2 «Проведение МРТ исследований для визуализации ферритина у здоровых лабораторных крыс» лабораторным животным проводилось внутримозговое введение вирусных векторов, сконструированных в первый год работы над проектом. В частности, 1) Аденоассоциированный вирус, несущий кодирующую последовательность ферритина под контролем промотора даблкортина (AAV-DCX-FerrH) 2) Аденоассоциированный вирус, несущий кодирующую последовательность зеленого флюоресцентного протеина eGFP под контролем промотора даблкортина (AAV-DCX-eGFP) 3) Лентивирус, несущий кодирующие последовательности ферритина и eGFP под контролем промотора даблкортина (LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH) 4) Лентивирус, несущий кодирующие последовательности ферритина и eGFP под контролем цитомегаловирусного промотора (LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH) 5) Лентивирус, не несущий генов для экспрессии («пустой вектор», LV-empty). Используемые нами вирусные вектора на основе лентивирусов (LV) и аденоассоциированных вирусов (AAV) содержат кодирующую последовательность белка ферритина (Ferr), накапливающего железо, что делает возможным визуализацию генетически-модифицированных клеток при помощи МРТ и иммуногистохимическим методом, с помощью антител к ферритину. Дополнительным контролем экспрессии генов является встроенная последовательность зеленого флюоресцентного белка (еGFP), который хорошо визуализируется флуоресцентной микроскопией без окрашивания. Генетический вектор каждого типа вводили в перивентрикулярную зону мозга крыс в объеме 2 мкл с концентрацией порядка 10^8 вирусных частиц на 1 мл. МРТ сканирование ex vivo проводилось на 14 день после введения векторов. Для визуализации ферритина in vivo в мозге крыс МРТ сканирование проводилось до введения векторов, а также на 1-й, 3-й, 7-й, 14-й, 21-й и 30-й день после интрацеребральной инъекции. В настоящее время этот эксперимент продолжается, животные будут выведены из эксперимента 15 декабря 2019 года. В результате ex vivo и in vivo МРТ исследований мы получили изображения, на которых хорошо визуализируется место инъекции вирусного вектора на уровне коры мозга. На изображениях T2, полученных ex vivo, заметно снижение интенсивности МРТ сигнала в нейрогенной субвентрикулярной зоне обоих полушарий на 14-й день после введения AAV-DCX-Ferr, а также в субвентрикулярной зоне полушария, ипсилатерального относительно микроинъекции, после введения LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH. Это свидетельствует об экспрессии ферритина после введения вирусных векторов AAV-DCX-Ferr и LV- CMV-eGFP-T2A-FerrH. Однако качество изображения Т2*, основного с точки зрения детектирования накопления железа, получаемое на томографе Philips Acheiva 1.5T, было недостаточно для получения четкого сигнала ферритина. Повышение напряженности магнитного поля с 1.5Т до 11.7Т и более высокий градиент магнитного поля приводили к значительному улучшению качества изображений, повышению отношения сигнал-шум, улучшению пространственного и временного разрешения изображений и, самое важное, позволяло проводить неинвазивные исследования мозга крыс во множественных временных точках после введения вирусных векторов и отслеживать динамику изменения МРТ сигнала вследствие распространения и миграции экспрессируемых репортеров. На всех полученных изображениях in vivo хорошо визуализируется место инъекции вирусного вектора в правом полушарии на уровне коры мозга, а также, в ряде случаев, в месте предполагаемом сверэкспрессии ферритина в нейрогенной субвентрикулярной зоне. Использование Т2-взвешенных импульсных последовательностей позволяет визуализировать зону воспаления, прилегающую к месту инъекции. По результатам экспериментов на томографе Bruker Biospec 11.7Т наиболее четкая картина экспрессии гена-репортера ферритина наблюдается после введения аденоассоциированного вектора с промотером DCX (AAV-DCX-Ferr). Так, на изображениях T2-MSME-PD и Т2*-MGE визуализируется гипоинтенсивность сигнала непосредственно над мозолистым телом, в нейрогенной субвентрикулярной зоне. Зоны гипоинтенсивности МРТ сигнала также наблюдаются в зоне стриатума непосредственно под местом инъекции. Эта картина полностью согласуется с результатами исследований на томографе Philips Achieva 1.5T. После введения лентивирусного вектора LV-DCX-GFP-Ferr также наблюдалось снижение интенсивности МРТ сигнала на Т2 и Т2* взвешенных изображениях в зоне мозолистого тела, расположенного непосредственно под местом инъекции. При введении контрольного вектора ААV-DCX-GFP затемнения зоны стриатума не наблюдалось, что подтверждает специфичность гипоинтенсивного (темного) сигнала, связанного именно с накоплением ферритина в зоне нейрогенеза. После введения лентивируса с промотером CMV, не специфичному к молодым нейронам (LV-CMV-GFP-Ferr), зоны затемнения наблюдались в подкорковой области над мозолистым телом, причем в как в правом полушарии, куда производилась инъекция, так и в коллатеральном левом полушарии. Планируемые иммуногистохимические исследования мозга помогут определить, связано ли это изменения МРТ сигнала в данных зонах мозга с экспрессией ферритина. Для решения задач 3 и 4 было сделано 24 операции по ведению вирусных векторов для оценки их специфичности к молодым нейронам и перекрестной специфичности в отношении других нервных клеток. Для этого на срезах мозга экспериментальных животных была исследована колокализация eGFP и ферритина с маркером молодых нейронов белком даблкортином (DCX), а также c маркерами зрелых нейронов (маркер NeuN), астроцитов (маркер GFAP) и микроглии (маркер Iba1). Иммуноокрашивание белков ферритина и флуоресценция eGFP на срезах мозга показало, что инъекция всех векторов вызывает в нейрогенной субвентрикулярной зоне вблизи бокового желудочка экспрессию соответствующих генов-репортеров. Анализ колокализации ферритина с даблкортином показал, что после заражения вектором AAV-DCX-FerrH доля молодых нейронов, экспрессирующих ферритин, высока и составляет в среднем 90,7% на третьи сутки и 93.5% на 14 сутки после введения вектора. Для векторов LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH доля молодых нейронов составляет 63,3% и 62,9% на третьи сутки и 63,8% и 63,2% на 14 сутки соответственно. В тоже время для вектора AAV-DCX-FerrH на 14 сутки после введения наблюдается значительное количество астроцитов, экспрессирующих ферритин. Таким образом, эффективность аденоассоциированного вируса AAV-DCX-FerrH была выше как в целом, так и с точки зрения синтеза белка ферритина в молодых нейронах. Однако специфичность в отношении молодых нейронов выше для лентивирусов. Кроме того, индукция синтеза ферритина лентивирусными векторами не изменяется в зависимости от используемого промотора. Вероятно, полученный эффект связан с тем, что лентивирус включается только в делящиеся клетки, к которым относятся молодые нейроны, в то время как аденоассоциированый вирус заражает все клетки, в том числе неделящиеся. Доля зараженных векторами зрелых нейронов, астроцитов и микроглиальных клеток в целом очень небольшая (около 10-15%). Учитывая площадь субвентрикулярной зоны на срезах и относительно остальных структур мозга, плотность экспрессирующих ферритин нейронов, астроцитов и микроглиальных клеток меньше плотности ферритина в субвентрикулярной зоне в десятки раз. По результатам проведенных исследований, а также в качестве заключения в задаче 5, «Сопоставление МРТ и иммуногистохимических экспериментальных данных», приводим результаты линейного регрессионного анализа данных, полученных ex vivo на томографе Philips Achieva 1.5T. Значимая корреляция между изменением интенсивности МРТ сигнала и плотностью экспрессирующих ферритин клеток в этой зоне (r = 0.75, p = 0.02, R^2 = 0.56) позволяет гистологически валидировать выявленную гипоинтенсивность сигнала на T2-взвешенных изображениях. По результатам второго года выполнения проекта можно сформулировать ряд заключений: 1) Визуализирован и гистологически валидирован нейрогенез после внутримозгового введения генетических векторов AAV-DCX-Ferr и LV-CMV-eGFP-Ferr в исследованиях ex vivo на основе Т2-взвешенных изображений, полученных на томографе Philips 1.5T. 2) Предварительные результаты, полученные в МРТ исследовании на сверхвысокопольном томографе Bruker BioSpec 11.7T при использовании Т2*-взвешенных импульсных последовательностей показали четкую визуализацию экспрессии ферритина в нейрогенных зонах мозга крыс при введении AAV-DCX-Ferr. 3) Введение аденоассоциированного вирусного вектора со специфическим промотером DCX вызывает эффективное заражение субвентрикулярной зоны, что дает четко визуализируемый сигнал ферритина на МРТ изображениях. Однако ферритин также экспрессируется и в других типах нервных клеток, включая астроциты, что снижает специфичность данного вектора. 4) Для визуализации нейрогенеза с помощью введения векторов на основе лентивируса необходимо точное попадание вектора в субвентрикулярную зону и решение проблемы с раздельной экспрессией eGFP и ферритина. 5) Длительности наблюдения 14 суток недостаточно для визуализации всего пути миграции молодых нейронов в обонятельную луковицу. Неинвазивные исследования с использованием сверхвысокопольного сканера 11.7Т будут подолжены до 30 суток наблюдения с последующим иммуногистохимическим анализом срезов мозга.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 отчетном году перед проведением основной запланированной масштабной серии экспериментов, посвященной МРТ визуализации нейрогенеза в условиях локальной ишемии мозга, мы детально проанализировали данные проведенной в 2019 году серии экспериментов с введением генетических векторов интактным животным. Результаты МРТ исследований, полученных на сверхвысокопольном сканере 11.7Т, показали перспективность введения векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV-DCX-eGFP и AAV-DCX-FerrH), предназначенных для экспрессии генов-репортеров ферритина и eGFP в молодых нейронах. Максимальное изменение интенсивности МРТ сигнала, связанное с введением генетических векторов, наблюдалось на Т2*-взвешенных изображениях, что в дальнейшем подтвердили и иммуногистохимические исследования. Основная масса клеток, экспрессирующих ферритин и eGFP наблюдалась в непосредственной близости от нейрогенной субвентрикулярной зоны мозга (SVZ). Локализация клеток четко соответствовала гипоинтенсивности Т2* сигнала на МРТ. Значительная часть клеток, экспрессирующих ферритин и eGFP, также экспрессировала даблкортин (DCX), маркер молодых нейронов. Внутримозговое введение лентивирусных векторов также вызывало выраженные изменения сигнала Т2* и статистически значимо отличалось от эффекта введения векторов на основе аденоассоциированных вирусов. Статистически значимая гипоинтенсивность сигнала на этом этапе была обнаружена только для введения интактным животным вектора LV-pCMV-eGFP-T2a-FerrH. Интенсивность флуоресценции для векторов на основе аденоассоциированных вирусов также была значимо выше, чем для векторов на основе лентивирусов. Неожиданным результатом стало подтверждение высокого уровня экспрессии eGFP и вызываемая им гипоинтенсивность МРТ сигнала на Т2*-взвешенных изображениях для вектора AAV-pDCX-eGFP, не несущего ферритина в качестве трансгена. Необходимо было дальнейшее исследование данного феномена. На основе полученных результатов было заключено, что длительности наблюдения 14 суток, особенно в отношении лентивирусов, недостаточно для визуализации динамики изменений экспрессии генов-репортеров и миграции молодых нейронов. Поэтому для следующей серии МРТ исследований срок наблюдения был увеличен до 28 суток после введения векторов. Дополнительно, для подтверждения экспрессии ферритина методом RT-PCR, в 2020 году была проведена серия исследований (n=20) с введением в мозг векторов на основе аденоассоциированных вирусов и лентивирусов. Данные RT-PCR показали значимо более высокую экспрессию ферритина в corpus callosum и caudoputamen в левом полушарии головного мозга крысы на 7-й день после интрацеребрального введения AAV-pDCX-FerrH. Экспрессия ферритина увеличена в более чем 100 раз по сравнению в теми же структурами колатерального полушария мозга, а также в сравнении с контрольной (интактной) группой. В то же время введение LV-pDCX-eGFP-T2a-FerrH не вызывало значимое повышение экспрессии ферритина в ипсилатеральном полушарии по сравнению с контралатеральном на этих сроках наблюдения. Эти результаты согласуются с данными МРТ и иммуногистохимии: области гипоинтенсивности сигнала Т2* и экспрессии ферритина на флуоресцентно окрашенных микрофотографиях у крыс, которым вводили AAV-pDCX-FerrH, располагались в caudoputamen вблизи corpus callosum и зоны SVZ левого полушария. Для основной серии экспериментов, запланированных на 2020 год, первоначально была проведена оптимизация параметров монофиламента для достижения нужного объема ишемического очага в стандартной модели инсульта – временной окклюзии средней мозговой артерии (MCAO). Исследование показало, что длина силиконового наконечника монофиламента при моделировании локальной ишемии у крыс существенно влияет на объем ишемического поражения, выживаемость животных и выраженность неврологического дефицита. Объем ишемического очага оценивался на МРТ по Т2-взвешенным изображениям, восстановление кровотока – с помощью МР ангиографии. Было показано, что сочетание MCAO с другими процедурами, включая интрацеребральные инъекции и наркотизацию при МРТ сканировании, возможно при моделировании подкоркового ишемического поражения среднего объема, с использованием наконечника филамента 5 мм для животных весом 360-490 г. По результатам опубликована научная статья (Кудабаева М.С., Акулов А.Е., Пищелко А.О., Светлик М.В., Ходанович М.Ю. Оптимизация параметров монофиламента при моделировании локальной ишемии мозга у крыс. В сборнике: Высокие технологии и инновации в науке. Сборник избранных статей Международной научной конференции. Санкт-Петербург, 2020. С. 17-19. doi: 10.37539/VT187.2020.38.57.004). Основной эксперимент был проведен на 42 взрослых крысах-самцах линии Sprague-Dawley (300–350 г), полученных из SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Часть экспериментальных животных (n=21) подверглись временной ишемии головного мозга с использованием модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO); часть животных (n=21) составили группу ложнооперированного контроля. Локальная ишемия головного мозга достигалась путем временной окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) У всех животных, подвергнутых MCAO, развивались обширные поражения мозга в областях, кровоснабжаемых средней мозговой артерией. Ишемический очаг, расположенный в caudoputamen и neocortex, четко идентифицировался как области повышения интенсивности МРТ сигнала на T2-, T2*- и диффузионно-взвешенных изображениях (DWI). После введения вирусных векторов для экспрессии генов-репортеров наблюдалось выраженное снижение интенсивности МРТ сигнала в зоне, расположенной около левого бокового желудочка и SVZ, начиная с 7-го дня после инъекции векторов. Эта гипоинтенсивность стала более выраженной на 14, 21 и 28 день после введения. Инъекция PBS не вызвала изменений МРТ сигнала. В группах FerrH-MCAO и eGFP-MCAO были отчетливо видны две зоны гипоинтенсивности в мозге крыс: одна зона рядом с левым боковым желудочком и SVZ, другая - внутри ишемического очага. Иммуногистохимическое исследование классифицировало клетки, экспрессирующие ферритин и eGFP вблизи бокового желудочка и SVZ как молодые и зрелые нейроны, а в районе ишемического очага – как макрофаги либо активированную микроглию. Количественная оценка МРТ сигнала в зонах гипоинтенсивности вблизи SVZ показала различия в динамике сигнала между ишемическим (ипсилатеральным) и неповрежденным (контралатеральным) полушариями на Т2- и Т2*-взвешенных изображениях. Значения Т2 в ипсилатеральном полушарии значимо не изменились в течение всего периода наблюдений (1 месяц) в группах FerrH-MCAO и eGFP-MCAО. Напротив, интенсивность сигнала вблизи SVZ на T2*-взвешенных изображениях значимо снижались, начиная с 7-го дня после инъекции AAV-pDCX-eGFP и с 14-го дня после инъекции AAV-pDCX-FerrH, что говорит о накоплении генов-репортеров вблизи нейрогенной зоны после МСАО. Снижение интенсивности T2* в зоне около бокового желудочка составило 21,06 ± 2,65 % (группа FerrH-MCAO) и 17,70 ± 1,64 % (группа eGFP-MCAO) на 28-е сутки после инъекции вируса после ишемии и 19,93 ± 5,94 %. (группа FerrH-Sham) и 21,53 ± 7,07 % (группа eGFP-Sham) после ложной операции в группе контроля без ишемии. Интенсивность сигнала в контралатеральном полушарии значимо не изменилась. Иммуногистохимическое исследование мозга после последнего МРТ сканирования и окрашивание по Перлсу выявило зоны накопления железа в области ишемического поражения во всех группах, независимо от типа инъекции, FerrH, eGFP и PBS. Клетки, накапливающие железо, были колокализованы с зонами накопления макрофагов в ишемическом очаге. За пределами области ишемического очага накопление железа было обнаружено около бокового желудочка и SVZ, но только у животных, которым вводили AAV-pDCX-FerrH. Клетки с накоплением железа в этой зоне были слегка вытянутой формы и в дальнейшем были идентифицированы как нейроны последующим иммуногистохимическим исследованием. В других исследуемых группах накопление железа вне ишемического очага не наблюдалось. У животных в группе FerrH-MCAO основная часть ферритин-экспрессирующих нейронов располагалась вблизи бокового желудочка и SVZ, и только небольшое количество нейронов было обнаружено внутри ишемического поражения. В контрольной группе PBS-MCAO также наблюдалась зона гипоинтенсивности МРТ сигнала в ишемическом очаге и было обнаружено накопление макрофагов в области поражения. Количество зрелых нейронов, экспрессирующих ферритин, в зоне, прилегающей к SVZ, была ниже по сравнению с плотностью зрелых нейронов, экспрессирующих eGFP. eGFP-положительные нейроны образовывали большие сети около бокового желудочка и SVZ, небольшое количество eGFP-положительных зрелых нейронов было также обнаружено внутри зоны ишемического поражения. Важно, что значительное количество eGFP-положительных зрелых нейронов было обнаружено в обонятельной луковице как у животных после MCAO, так и у животных с ложной операцией, что указывает на их миграцию в эту зону по известному ростральному миграционному пути (RMS) и подтверждает, что наше исследование визуализирует известные процессы миграции молодых нейронов с помощью МРТ. Взаимосвязь между изменением интенсивности T2* сигнала и нормированной интенсивности флуоресценции (IF) ферритина и eGFP в одних и тех же областях мозга крыс оценивалась с помощью линейного регрессионного анализа. Статистически значимая корреляция между интенсивностью T2* сигнала и IF FerrH была обнаружена для зоны вблизи SVZ (r = 0.83, r2 = 0.70, p = 0.04) и ишемического очага (r = 0.79, r2 = 0.62, p = 0.01). Корреляция между процентными изменениями интенсивности сигнала T2* и IF eGFP была близка к значимой (r = 0.75, r2 = 0.57, p = 0.08). Введение векторов на основе лентивирусов, LV-pDCX-eGFP-T2a-FerrH, LV-pCMV-eGFP-T2a-FerrH и LV-pCMVeGFP также вызывало выраженную гипоинтенсивность на Т2*-взвешенных изображениях (до 60 % в зоне около SVZ и до 40 % в зоне ишемического очага). Однако, как прояснили последующие иммуногистохимические исследования, большую часть клеток, экспрессирующих ферритин и eGFP составляет активированная микроглия\макрофаги (от 60 до 85 %), причем, даже в нейрогенной зоне вблизи SVZ, как в группах с моделированием ишемии, так и у ложнооперированных животных. Процент зараженных молодых и зрелых нейронов в этой зоне был значимо меньше (в среднем 25-30 %), чем процент макрофагов. В то же время мы обнаружили, что количество колокализованных с ферритином и eGFP молодых нейронов при введении тканеспецифического вектора LV-pDCX-eGFP-T2a-FerrH значимо выше в сравнении с введением векторов с неспецифическим промотором во всех исследуемых группах и зонах, что подтверждает специфичность заражения молодых нейронов данным генетическим вектором. Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало возможность долговременной визуализации естественного и индуцированного ишемией нейрогенеза in vivo с помощью МРТ с применением генов-репортеров, экспрессируемых под промотором даблкортина. Уникальной особенностью настоящего исследования является комбинация МРТ маркеров и флуоресцентной визуализации молодых нейронов. Основные выводы настоящего исследования приведены ниже. 1. Наши результаты показали, что мозг крысы можно успешно инфицировать вирусными векторами AAV-pDCX-FerrH и AAV-pDCX-eGFP для экспрессии ферритина или eGFP. Оба вектора вызывали 20%-ное снижение интенсивности сигнала в областях около SVZ на T2*-взвешенных МРТ изображениях через месяц после внутричерепной инъекции вирусных векторов. 2. Расположение областей гипоинтенсивности сигнала, вызванного введением AAV-pDCX-FerrH и AAV-pDCX-eGFP, совпадает с зонами накопления ферритина и eGFP на иммунохистохимических препаратах и зонами накопления железа при окрашивании по Перлсу через месяц после введения вирусов. Данные RT-PCR подтвердили повышенную экспрессию ферритина в corpus callosum и caudoputamen в ипсилатеральном полушарии мозга крысы на 7-й день после внутримозгового введения векторов на основе аденоассоциированных вирусов. 3. Введение векторов на основе лентивирусов LV-pDCX-eGFP-T2a-FerrH, LV-pCMV-eGFP-T2a-FerrH и LV-pCMV-eGFP также вызывает гипоинтенсивность сигнала Т2* на МРТ и экспрессию ферритина и eGFP согласно иммуногистохимическим исследованиям. Эта экспрессия менее выражена по сравнению с векторами на основе аденоассоциированных вирусов, поскольку RT-ПЦР анализ ее не зафиксировал, и наблюдается на фоне воспалительного ответа. 4. Генетический вектор LV-pDCX-eGFP-T2a-FerrH с тканеспецифическим промотором показывает значимо большую экспрессию ферритина и eGFP в молодых нейронах по сравнению с лентивирусными векторами с неспецифическим цитомегаловирусным промотором, в особенности, в условиях усиленного нейрогенеза при ишемическом поражении. 5. Основным источником гипоинтенсивности сигнала вблизи зон SVZ в группах AAV-pDCX-FerrH и AAV-pDCX-eGFP являются молодые и зрелые нейроны. Основным источником гипоинтенсивности сигнала вблизи зон SVZ в группах LV-pDCX-eGFP-T2a-FerrH, LV-pCMV-eGFP-T2a-FerrH и LV-pCMVeGFP являются макрофаги. 6. Основным источником гипоинтенсивности сигнала Т2* в области ишемического поражения во всех группах, которым вводили вирусные вектора или PBS, являются макрофаги. Результаты данного исследования были опубликованы в специальном выпуске журнала International Journal of Molecular Science, посвященному нейрогенезу (Khodanvich MY, et al. Tissue-specific ferritin- and GFP-based genetic vectors visualize neurons by MRI in the intact and post-ischemic rat brain. Int J Mol Sci. 2020;21(23):E8951. doi: 10.3390/ijms21238951. PMID: 33255702). Исследование выявило также ряд вопросов, требующих дальнейших исследований. Первый вопрос - специфичность сигнала МРТ для молодых нейронов. Несмотря на первоначальное намерение маркировать молодые нейроны с помощью промотора DCX, процент молодых нейронов, меченных FerrH или eGFP, обнаруженных вблизи бокового желудочка (зона SVZ головного мозга крысы), был небольшим по сравнению с гораздо большим количеством зрелых нейронов в здоровом мозге. Было показано увеличение процента молодых нейронов у животных после MCAO, что согласуется с результатами других исследований, показывающих увеличение продукции новых нейронов после ишемии. Другое объяснение может заключаться в пластичности нейронов. Существует вероятность, что молодые нейроны, которые изначально были инфицированы трансгенами ферритина или eGFP, непрерывно экспрессировали эти белки даже после созревания. Кроме того, нельзя исключить возможность вторичной трансфекции зрелых клеток. Во-вторых, зоны гипоинтенсивности были обнаружены не только вблизи SVZ в головном мозге крысы, но и внутри ишемического очага, что связано с накоплением макрофагов в области поражения. Окрашивание по Перлсу показало накопление железа в макрофагах, что подтверждается литературыми данными, показывающими, что ключевыми метаболическими задачами макрофагов являются утилизация фрагментов погибших клеток и детоксикация свободного железа. Это вызывает дополнительные вопросы относительно специфичности гипоинтенсивности МРТ сигнала и дифференциация сигнала от живых клеток, экспрессирующих гены-репортеры от макрофагов, метаболизирующих богатые железом клетки. Выявленная нами специфичность Т2* (в отличие от Т2) для визуализации макрофагов в ишемическом очаге может быть использована в клинике для детекции воспаления. В-третьих, неожиданным результатом стала гипоинтенсивность МРТ сигнала на T2*-взвешенных изображениях от клеток, экспрессирующих eGFP, причем величина изменения сигнала была сравнима с векторами, вызывающими экспрессию ферритина. eGFP - широко используемый флуоресцентный маркер, который легко идентифицировать на тканевых слайдах ex vivo или в живых клетках, однако экспрессия eGFP никогда не рассматривалась в качестве МРТ маркера. Необходимы дальнейшие исследования eGFP в качестве МРТ репортера. В текущем году в СМИ были представлены следующие материалы, посвященные проекту: 1. пресс-служба ТГУ (tsu.ru) «Ученые ТГУ разработали способ мониторинга миграции молодых нейронов», 20 октября 2020, URL: http://www.tsu.ru/news/uchenye-tgu-razrabotali-sposob-monitoringa-migrats/ 2. Сетевое издание -Научно-информационный портал “Поиск” (poisknews.ru) «Ученые ТГУ разработали способ мониторинга миграции молодых нейронов», 21 Октября 2020, URL: https://poisknews.ru/themes/medicine/uchenye-tgu-razrabotali-sposob-monitoringa-migraczii-molodyh-nejronov/ 3. ИНТЕРФАКС-СИБИРЬ (interfax-russia.ru) «Ученые разработали первый в мире неинвазивный способ мониторинга молодых нейронов», 20 Октября 2020, URL: https://www.interfax-russia.ru/siberia/news/uchenye-razrabotali-pervyy-v-mire-neinvazivnyy-sposob-monitoringa-molodyh-neyronov 4. Академия ИНТЕРФАКС (academia.interfax.ru) «Первый в мире неинвазивный инструмент для мониторинга молодых нейронов создали в ТПУ», 20 Октября 2020, URL: https://academia.interfax.ru/ru/news/articles/5485/ 5. РИА Томск (riatomsk.ru) «Ученые ТГУ создали инструмент для слежки за молодыми нейронами в мозге», 20 Октября 2020, URL: https://www.riatomsk.ru/article/20201020/47577/ 6. БезФормата. Томск (tomsk.bezformata.com) «Ученые ТГУ разработали способ мониторинга миграции молодых нейронов», 20 Октября 2020, URL: https://tomsk.bezformata.com/listnews/monitoringa-migratcii-molodih-neyronov/88124535/ 7. Научная Россия (scientificrussia.ru) «Нейробиологи ТГУ, Бельгии и США разработали способ отслеживать передвижение молодых нейронов», 27 Октября 2020, URL: https://scientificrussia.ru/news/nejrobiologi-tgu-belgii-i-ssha-razrabotali-sposob-otslezhivat-peredvizhenie-molodyh-nejronov 8. 123ru.net «Ученые ТГУ создали инструмент для слежки за молодыми нейронами в мозге», 20 Октября 2020, URL: https://123ru.net/novosibirsk/262748015/ 9. Новости Сибирской науки (sib-science.info) «Ученые разработали способ мониторинга миграции молодых нейронов», 20 Октября 2020, URL: http://www.sib-science.info/ru/news/neironov-20102020 10. РИА Сибирь (ria-sibir.ru) «Томские и зарубежные ученые нашли способ мониторинга миграции молодых нейронов», 21 Октября 2020, URL: http://www.ria-sibir.ru/viewnews/74970.html