Аннотация результатов, полученных в 2018 году
При ишемическом инсульте окклюзия мозговых артерий за несколько минут приводит к дефициту кислорода и глюкозы, истощению АТФ и инфаркту нервной ткани. Повреждение распространяется на окружающие ткани. В переходной зоне (пенумбре) клетки погибают медленней, за несколько часов, что дает время для их спасения. Но нейропротекторы, способные защитить нейроны пенумбры, пока не найдены. Глобальная регуляция транскрипции в клетке осуществляется эпигенетическими процессами, включая ковалентные модификации гистонов. Результат церебральной ишемии в значительной степени зависит от статуса ацетилирования и метилирования гистонов. Мы исследовали в коре мозга крысы метилирование и ацетилирование гистона H3 и экспрессию гистондеацетилаз HDAC1 и HDAC2, которые регулируют транскрипционную активность генома и белковый синтез, в нейронах и астроцитах пенумбры через 4 и 24 часа после фототромботического инсульта (ФТИ). ФТИ (экспериментальная модель ишемического инсульта) индуцировался в коре мозга крысы путем локального лазерного облучения после инъекции фотосенсибилизирующего красителя бенгальского розового. Благодаря гидрофильности этот краситель не проникает в клетки и остается в кровеносных сосудах. При лазерном облучении он вызывает генерацию синглетного кислорода, агрегацию тромбоцитов, окклюзию сосудов и локальный инфаркт ткани мозга. Ядро инфаркта, окружено пенумброй шириной 1.5-2 мм. С помощью вестерн блотинга и иммунофлуоресцентной микроскопии мы изучили метилирование лизинов 4 и 9 (H3K4me и H3K9diMe) и ацетилирование лизина 9 в гистоне H3 (H3K9Ac), а также экспрессию и локализацию гистондеацетилаз HDAC1 и HDAC2 через 4 и 24 часа после ФТИ в нейронах и астроцитах пенумбры в коре мозга крысы. Контроль: контралатеральная кора тех же крыс и кора мозга ложнооперированных животных. Метилирование лизина 4 в гистоне H3, как известно, стимулирует процессы транскрипции и белковый синтез. По данным вестерн блотинга, через 4 и 24 часа после ФТИ уровень H3K4me в пенумбре повышался на 60-70%. Иммунофлуоресцентная микроскопия подтвердила эти данные. Иммунофлуоресценция H3K4me в пенумбре после ФТИ превышала таковую в необлученной контралатеральной коре или в коре мозга ложнооперированных крыс на 60-100% через 4 и 24 часа после ФТИ. При этом более, чем вдвое увеличивался коэффициент колокализации H3K4me c маркером нейронов NSE или маркером астроцитов GFAP. Повышение уровня H3K4me происходило и в нейронах, и в астроцитах. Коэффициент колокализации H3K4me и апоптоза, выявляемого по методу TUNEL, втрое повышался в пенумбре через 24 (но не 4) часа после ФТИ. Это свидетельствует связи апоптоза клеток пенумбры с метилированием гистона H3. Активация биосинтеза ряда белков, ранее наблюдавшаяся в ФТИ-индуцированной пенумбре, и апоптоз клеток пенумбры могут быть опосредованы метилированием лизина 4 в гистоне H3. В отличие от лизина 4, метилирование лизина 9 в гистоне H3 (Н3К9diМе), наоборот, подавляет транскрипцию и белковый синтез. Экспрессия Н3К9diМе наблюдалась в ядрах нейронов и небольшого количества астроцитов коры мозга крыс. Вестерн блотинг и иммунофлуоресцентная микроскопия не выявили изменений уровня Н3К9diМе в пенумбре через 4 или 24 часа после ФТИ. Колокализация белка с клеточными маркерами и с маркерами апоптоза в пенумбре не менялась по сравнению с контрольными группами. Таким образом, уровень Н3К9diМе не изменялся в пенумбре после ФТИ, и он не участвовал в апоптозе, индуцированном ФТИ. Ацетилирование гистона H3 стимулирует превращение неактивного конденсированного гетерохроматина в транскрипционно-активный эухроматин, в котором факторы транскрипции и РНК-полимераза II получают доступ к генам. Это стимулирует синтез мРНК и белков. Напротив, деацетилирование гистонов приводит к более плотной упаковке ДНК и конденсации хроматина, что подавляет транскрипцию и синтез белка в клетке. Как показал вестерн блотинг, через 24 часа после ФТИ уровень гистона 3, ацетилированного по лизину 9 (H3K9Ac), уменьшался в пенумбре в 2-3 раза относительно контрольных групп. Иммунофлуоресцентное исследование также показало достоверное снижение H3K9Ac в пенумбре на 50-70% через 4 или 24 часа после ФТИ. H3K9Ac локализовался в ядрах нейронов. Коэффициент колокализации H3K9Ac с маркером нейронов NSE вдвое снижался в пенумбре после ФТИ. Колокализации H3K9Ac с апоптотическими ядрами, окрашенными TUNEL, не наблюдалось. Следовательно, апоптоз клеток пенумбры не был связан с наблюдавшимся снижением ацетилирования лизина 9 в гистоне H3 и последующим нарушением белкового синтеза. Гистондеацетилазы убирают ацетильную группу с гистонов, что приводит к конденсации хроматина и затруднению доступа факторов транскрипции и РНК полимеразы II к промоторным участкам ДНК, а в итоге - к снижению белкового синтеза. Некоторые гистондеацетилазы также деацетилируют ряд цитоплазматических белков. Их функции многообразны. Они участвуют как в выживании клеток и выполнении различных физиологических функций, включая развитие мозга и формирование памяти, так и в нейродегенеративных болезнях Альцгеймера, Паркинсона и др. или в шизофрении. Гистондеацетилазы HDAC1 и HDAC2 изобилуют в мозге. С помощью вестерн блотинга мы исследовали экспрессию HDAC1 в ядерной и цитоплазматической фракциях пенумбры и контрольных образцов коры мозга крыс после ФТИ. В ядерной фракции ткани пенумбры экспрессия HDAC1 повышалась в 1.7-1.8 раз через 4 или 24 часа после ФТИ, а в цитоплазматической фракции ее уровень повышался в 2.4-3.5 раз относительно ложнооперированных крыс или контралатерального полушария тех же животных. Иммунофлуоресцентное исследование подтвердило повышение уровня HDAC1 в пенумбре через 4 и 24 часа после ФТИ. Через 4 или 24 часа после ФТИ интенсивность флуоресценции HDAC1-позитивных клеток в пенумбре достоверно повышалась. HDAC1 локализовался и в ядрах, и в цитоплазме нейронов. Коэффициент колокализации HDAC1 с маркером нейронов NSE достоверно увеличивался после ФТИ. Доля клеток с цитоплазматической локализацией HDAC1 не изменялась в первые 4 часа после ФТИ, но увеличивалась втрое через 24 часа, а коэффициент колокализации HDAC1 с маркером клеточных ядер Hoechst 33342 уменьшался вдвое через 24 часа после ФТИ. Следовательно, происходило перераспределение HDAC1 из ядер в цитоплазму. Локализация HDAC1 в астроцитах существенно не менялась через 4 - 24 часа после ФТИ. Гистондеацетилаза HDAC2 в нейронах была локализована исключительно в ядрах, но в некоторых астроцитах она также локализовалась в отростках. По данным вестерн блотинга, экспрессия HDAC2 в цитоплазматической фракции пенумбры и в контрольных образцах была незначительна. Экспрессия HDAC2 в ядерной фракции была значительно выше, и именно она определяла общий уровень HDAC2 в нейронах пенумбры. Через 4 и, особенно, через 24 часа после ФТИ экспрессия HDAC2 в ядерной фракции пенумбры достоверно повышалась относительно контроля. Это согласуется с данными иммунофлуоресцентной микроскопии. Коэффициент колокализации HDAC2 с маркером нейронов NSE не изменялся по сравнению с контрольными образцами через 4 часа после ФТИ, но повышался более, чем вдвое через 24 часа. При этом HDAC2 не перераспределялась в цитоплазму нейронов. Коэффициент колокализации HDAC2 и маркера астроцитов GFAP также значительно увеличивался через 4 и 24 часа после ФТИ. В некоторых астроцитах ФТИ вызывал появление HDAC2 в отростках. Фототромботический инсульт значительно, в 11-13 раз, увеличивал процент апоптозных клеток в пенумбре через 24, но не 4 часа после воздействия. В ряде источников предполагается, что HDAC1 является молекулярным переключателем между выживаемостью и смертью нейронов. Но наши данные показывают, что особенно важную роль в регуляции апоптоза в ФТИ-индуцированной пенумбре играет HDAC2. Действительно, апоптотические ядра, меченные TUNEL, локализовались вместе с HDAC2, но не с HDAC1. Экспрессия HDAC2 в ядрах нейронов возрастала после ФТИ соответственно повышению процента апоптотических клеток, тогда как HDAC1, который не локализовался вместе с апоптотическими ядрами, перераспределялась из ядер нейронов в цитоплазму. Следовательно, апоптоз клеток пенумбры в коре мозга крысы был связан скорее с повышенной экспрессией HDAC2, чем с HDAC1. Точные причины повышения экспрессии HDAC1 и HDAC2 в пенумбре неизвестны. Но есть основания предполагать, что повышение экспрессии HDAC2 и, возможно, HDAC1 в ишемической пенумбре после ФТИ может стимулироваться фактором транскрипции c-Myc, уровень которого также увеличивается (Demyanenko, Uzdensky, 2017). Вышеприведенные данные по иммунофлуоресцентной микроскопии описывают эпигенетические процессы в участках пенумбры, расположенных вблизи от ядра инфаркта, на расстоянии 50-100 мкм. На периферии пенумбры, на расстоянии около 1.5-2 мм от границы ядра инфаркта морфология и ультраструктура пенумбры выглядела более сохранной, чем на расстоянии 50-100 мкм (Uzdensky et al., 2017). Этому соответствуют настоящие данные о меньших изменениях экспрессии изученных эпигенетических белков на периферии пенумбры. На расстоянии 1.2-1.5 мм от ядра инфаркта уровень H3K4Me повышался на 60-90% через 4-24 часа после ФТИ относительно контралатеральной коры мозга. Но изменения относительно ложнооперированных животных не были достоверными. Существенных изменений уровня H3K9diMe не наблюдалось. Снижение ацетилирования гистона Н3 примерно на 50% было достоверно только относительно коры мозга ложнооперированных животных, но не контралатеральной коры. Экспрессия HDAC1 повышалась примерно на 80% через 4 или 24 часа относительно контралатеральной коры, но не коры мозга ложнооперированных животных. Более выраженными были изменения экспрессии HDAC2 через 24 часа после ФТИ на 160-170% относительно и контралатеральной коры, и коры мозга ложнооперированных животных. Таким образом, через 4 и 24 часа после ФТИ в нейронах и астроцитах пенумбры по сравнению с контралатеральной корой тех же животных или с корой мозга ложнооперированных крыс повышался уровень метилирования лизина 4 в гистоне H3, что способствует активации белкового синтеза. Колокализация H3K4me-позитивных и апоптотических клеток свидетельствует о связи H3K4me с апоптозом клеток пенумбры. Уровень диметилирования лизина 9 в гистоне H3 и его локализация в ядрах нейронов и астроцитов пенумбры не изменялись, что свидетельствует о неучастии H3K9diM в апоптозе клеток пенумбры. Уровень ацетилирования лизина 9 в гистоне H3 в нейронах и астроцитах снижался, что могло приводить к снижению белкового синтеза. Вероятной причиной снижения уровня H3K9Ac в пенумбре через 4 и 24 часа после ФТИ была повышенная экспрессия гистондеацетилаз HDAC1 и HDAC2. HDAC1 локализовался в ядрах и цитоплазме нейронов и астроцитов. После ФТИ часть HDAC1 перераспределялась в цитоплазму нейронов. В нейронах HDAC2 локализовалась исключительно в ядрах, а в некоторых астроцитах также и в отростках. ФТИ значительно увеличивал апоптоз клеток пенумбры через 24, но не 4 часа. Апоптоз в ФТИ-индуцированной пенумбре, вероятно был связан с повышением уровня H3K4me и HDAC2. Изменения эпигенетических процессов на периферии пенумбры были подобны изменениям вблизи ядра инфаркта, но менее выражены. HDAC2 может являться потенциальной мишенью для противоинсультной терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Инсульт - одна из главных причин смерти и инвалидности людей, а в России в последние годы он опередил инфаркт миокарда и рак. Однако обширные исследования предполагаемого защитного действия антиапоптотических агентов, блокаторов кальциевых каналов, антиоксидантов и т.д. не выявили нейропротекторов, способных защитить мозг человека от инсульта без неприемлемых побочных явлений. Как показано ранее, после инсульта в ишемической пенумбре синтезируется ряд белков, регулирующих смерть и выживание клеток. Но молекулярные механизмы, регулирующие экспрессию белков в пенумбре, пока слабо изучены. Глобальная регуляция транскрипционной активности в клетке осуществляется эпигенетическими процессами. Гистонацетилтрансферазы (HAT) ацетилируют гистоны, что вызывает деконденсацию хроматина и способствует транскрипции и синтезу белков в клетке. Гистондеацетилазы (HDAC), наоборот, стимулируют конденсацию хроматина, что подавляет белковый синтез. Транскрипционная активность генома при ишемии регулируется ацетилированием гистонов, которое поддерживается балансом HAT/HDAC. Ранее нами изучены метилирование и ацетилирование гистона H3, а также экспрессия гистондеацетилаз HDAC1 и HDAC2 в нейронах и астроцитах пенумбры через 4 часа («терапевтическое окно») и 24 часа после фототромботического инсульта (ФТИ, модель ишемического инсульта). Также исследованы изменения уровня апоптоза и колокализация апоптотических клеток с HDAC1 и HDAC2. В настоящей работе мы изучили изменения экспрессии и локализации гистондеацетилаз HDAC3, HDAC4 и HDAC6, а также гистонацетилтрансфераз HAT1 и PCAF в пенумбре и ее ядерной и цитоплазматической фракциях через 4 и 24 часа после ФТИ. Также изучалось влияние ряда ингибиторов гистондеацетилаз на объем инфаркта и апоптоз в пенумбре через 24 часа после ФТИ в коре мозга мышей. Методы исследования подробно описаны в предыдущем отчете по гранту РНФ № 18-15-00110 за 2018 г. Опыты проводили на взрослых самцах крыс и мышей, содержащихся в стандартных условиях. Фототромботический инсульт в коре мозга крыс индуцировался лазерным облучением после инъекции бенгальского розового. Контроль: контралатеральная кора тех же крыс или ложнооперированные животные, подвергавшиеся тем же операциям, но без введения фотосенсибилизатора. Для иммунофлуоресцентной микроскопии через 4 или 24 ч после ФТИ крыс подвергали эвтаназии. Мозг экстрагировали и фиксировали в формалине. Фронтальные срезы (20 мкм) инкубировали с первичными кроличьими антителами: анти-HDAC3; анти-HDAC4, анти-HDAC6, анти-HAT1, анти-PCAF и мышиным антителом к маркеру нейронов анти-NeuN или маркеру астроцитов анти-GFAP. На флуоресцентных изображениях измеряли интенсивность флуоресценции, пропорциональная уровню белка и ее изменения относительно контрольных групп. Колокализацию белков с маркером нейронов NSE или маркером астроцитов GFAP оценивали с помощью коэффициента Мандерса M1. Визуализацию апоптотических клеток проводили по методу TUNEL. Апоптотический индекс AI рассчитывался как отношение числа TUNEL-позитивных клеток к общему числу клеток, окрашенных маркером ядер Hoechst 33342. С помощью иммуноблоттинга определяли уровни белков HAT1, PCAF, HDAC3, HDAC4 и в цитоплазматической и ядерной фракциях пенумбры. Для определения объема инфаркта через 5 или 7 дней после ФТИ срезы мозга мышей (2 мм) окрашивали 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом, измеряли площади зон инфаркта, суммировали их и умножали на толщину среза. Изучалось нейропротекторное влияние вальпроата натрия, неспецифического ингибитора гистондеацетилаз; α-фенилтрополона, ингибитора HDAC2/8, BRD3308, селективного ингибитора HDAC3, LMK235 селективного ингибитора HDAC4/5 и HPOB, селективного ингибитора HDAC6 на объем ФТИ-индуцированного инфаркта и апоптоз в коре мозга мышей. По данным иммунофлуоресцентной микроскопии, в нейронах и астроцитах контрольной коры мозга отмечены низкие исходные уровни гистонацетилтрансфераз HAT1 и PCAF, Их величины не различались между контрольными группами. То есть, оба контроля равнозначны. Во контрольных образцах HAT1 в основном локализовалась в ядрах нейронов. Коэффициент M1 колокализации HAT1 с нейронами составлял 0,5-0,6, тогда как для астроцитов M1 был ниже: 0,2-0,4. Через 4 часа после ФТИ уровень HAT1 увеличивался с 25% у ложнооперированных крыс до 150% в нейронах и астроцитах ФТИ-индуцированной пенумбры, а через 24 часа – до 235%. При этом коэффициент M1 колокализации HAT1 с маркером нейронов NeuN не изменялся, но ее колокализация с маркером астроцитов GFAP заметно увеличилась с 0,2-0,3 до 0.6-0.7, что говорит о ее повышенной экспрессии в астроцитах. Иммуноблоттинг показал повышение экспрессии HAT1 как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях пенумбры через 4 и 24 ч после ФТИ относительно обеих контрольных групп. Гистонацетилтрансфераза PCAF также локализовалась в основном в ядрах корковых нейронов и астроцитов и меньше в цитоплазме нейронов. Коэффициент колокализации PCAF с маркером нейронов NeuN в контроле составлял 0,6-0,7, а с маркером астроцитов GFAP - около 0,3. Через 4-24 часа после ФТИ уровень PCAF в пенумбре увеличивался почти вдвое. Коэффициент колокализации PCAF с NeuN не изменялся, но с астроцитами - увеличивался. Увеличивался и процент клеток с ядерной локализацией PCAF пенумбре. PCAF также появлялся в отростках астроцитов. Однако, опыты по иммуноблоттингу показали, что после ФТИ уровень PCAF в ядерной фракции пенумбры не изменялся, но увеличивался в цитоплазматической фракции. Возможно, это происходило за счет повышения уровня белка в отростках астроцитов. Флуоресценция астроцитов в пенумбре почти в десять раз увеличивалась через 24 часа после фототромботического инсульта. Это свидетельствует об увеличении их числа, т.е. об астроглиозе. Видимо, наблюдавшаяся сверхэкспрессия HAT1 и PCAF в астроцитах была связана с астроглиозом в пенумбре. Через 24 часа после ФТИ в пенумбре повышалось число TUNEL-позитивных апоптотических клеток. Но колокализации PCAF и HAT1 с апоптотическими клетками не наблюдалось, что свидетельствует о неучастии данных гистонацетилтрансфераз в апоптозе клеток пенумбры. Деацетилирование гистонов вызывает конденсацию хроматина и подавляет процессы транскрипции и белкового синтеза. Гистондеацетилазы I класса HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC8 обильны в мозге и локализуются, в основном, в клеточных ядрах. Гистондеацетилазы II класса HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9 и HDAC12 в ответ на физиологические сигналы или патологические воздействия могут курсировать между цитозолем и ядрами клеток мозга. Изменения экспрессии HDAC1 и HDAC2 в ФТИ-индуцированной пенумбре в первые сутки после инсульта изучались нами в 2018 г. В настоящей работе мы изучали изменения экспрессии HDAC3, HDAC4 и HDAC6 в пенумбре через 4 и 24 часа после инсульта. Уровень HDAC3 в коре мозга контрольных крыс был невелик. Она локализовалась в ядрах немногих нейронов и астроцитов, о чем свидетельствовал низкий коэффициент колокализации М1: около 0,2. Коэффициент колокализации HDAC3 с астроцитами был ниже 0,10. Фототромботический инсульт не влиял на экспрессию и колокализацию HDAC3 с нейронами и астроцитами в пенумбре в течение первых 24 часов после воздействия. Иммуноблоттинг также показал низкий уровень HDAC3 в ядерной фракции ФТИ-индуцированной пенумбры и еще меньший – в цитоплазматической фракции, которые не менялись после фототромботического инсульта. Это свидетельствует о неучастии HDAC3 в реакциях клеток коры мозга крысы на фототромботическое воздействие. В контрольных образцах HDAC4 был найден преимущественно в цитоплазме нейронов коры мозга крысы. По данным иммуноблоттинга, уровень HDAC4 в цитоплазматической фракции коры мозга крысы примерно вдвое превышал уровень в ядерной фракции. Поэтому небольшая доля HDAC4 могла находиться в клеточных ядрах. Иммунофлуоресцентная микроскопия не выявила достоверных изменений уровня HDAC4 в ткани пенумбры по сравнению с корой контрольных животных через 4 и 24 часа после фототромботического инсульта. Но иммуноблоттинг показал снижение уровня HDAC4 в цитоплазматической, но не ядерной фракции пенумбры. Иммунофлуоресцентная микроскопия показала повышение колокализации HDAC4 с маркерами нейронов NeuN и клеточных ядер Hoechst 33342 через 4 и 24 часа после ФТИ. Также повышалась доля клеток с ядерной локализацией HDAC4. То есть, наблюдалась некоторая релокализация HDAC4 в ядра клеток. Эти изменения происходили в нейронах, но не в астроцитах, поскольку коэффициент колокализации HDAC4 с астроцитами в пенумбре не изменялся после ФТИ. Возможно, в вестерн-блот анализе не проявлялось небольшое повышение экспрессии HDAC4 в нейрональных ядрах на фоне более значительного снижения ее уровня в цитоплазматической фракции. Гистондеацетилаза HDAC6 также локализовалась в немногих нейронах и астроцитах коры мозга контрольных крыс, что отражалось в низких коэффициентах колокализации с маркерами этих клеток. Но через 4 и 24 часа после фототромботического инсульта уровень HDAC6 в пенумбре повышался почти вдвое относительно контрольных образцов. Это повышение происходило и в нейронах, и в астроцитах, о чем свидетельствует увеличение коэффициентов колокализации HDAC6 с маркерами нейронов NeuN и астроцитов GFAP. Внутри клеток HDAC6 локализовалась как в клеточных ядрах, так и в цитоплазме. Но иммуноблоттинг показал, что уровень HDAC6 значимо повышался только в ядерной, но не цитоплазматической фракции ткани пенумбры. В экспериментах с выявлением апоптоза по методу TUNEL через 24 часа после фототромботического инсульта в ишемической пенумбре наблюдался апоптоз нейронов и астроцитов. Но колокализация HDAC3 и HDAC4 с TUNEL-позитивными апоптотическими клетками не наблюдалась. Это свидетельствует о неучастии данных гистондеацетилаз в ФТИ-индуцированном апоптозе клеток пенумбры. Вместе с тем, наблюдалась колокализация ряда клеток, содержащих HDAC6, с некоторыми TUNEL-позитивными апоптотическими клетками, что указывает на возможное участие HDAC6 в апоптозе в ФТИ-индуцированной пенумбре. Это подтверждается тем, что ее ингибирование способствовало снижению уровня апоптоза в пенумбре и сохранению нервной ткани после ФТИ. Мы изучили возможное противоишемическое нейропротекторное действие ингибиторов различных гистондеацетилаз: вальпроата натрия (V.A.), неспецифического ингибитора различных гистондеацетилаз; α-фенилтрополона (α-Ph.t), ингибитора HDAC2 и HDAC8; BRD3308, селективного ингибитора HDAC3; LMK235, ингибитора HDAC4 и HDAC5, и HPOB, селективного ингибитора HDAC6 на мозг мышей, подвергнутых фототромботическому воздействию. Из них только α-фенилтрополон, HPOB и вальпроат натрия оказывали защитное действие. Все они через 5 дней на 40% снижали объем инфаркта, вызванного в мозге крысы фототромботическим воздействием, и примерно на 50% через 7 дней. Эти ингибиторы примерно вдвое снижали уровень апоптоза в пенумбре на 7 день после ФТИ. Эти данные показывают участие гистондеацетилаз HDAC2/HDAC8 и HDAC6, но не HDAC3 и HDAC4/5 в нейродегенеративных процессах в ФТИ-индуцированной пенумбре. Недавно мы наблюдали нейропротекторный эффект MI192, ингибитора гистондеацетилаз HDAC2 и HDAC3. Так как BRD3308, селективный ингибитор HDAC3, не оказывал защитного действия на ФТИ-индуцированную пенумбру, то вероятно, именно ингибирование HDAC2, но не HDAC3 играло нейропротекторную роль. Это согласуется с проапоптозной ролью HDAC2, продемонстрированной нами в отчете за 2018 г. Таким образом, гистондеацетилазы HDAC2 и HDAC6 представляют собой возможные молекулярные мишени для противоишемической терапии, а их ингибиторы, такие как α-фенилтрополон, MI192 и HBOP, могут служить потенциальными нейропротекторами. Но неясно, какие сигнальные пути и факторы транскрипции стимулируют экспрессию этих эпигенетических белков? Это задачи будущих исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Инсульт - одна из главных причин смерти и инвалидности людей, а в России в последние годы он опередил инфаркт миокарда и онкологические заболевания. Закупорка мозговых сосудов за минуты нарушает кровоток и снабжение ткани мозга кислородом и глюкозой. В последующие часы токсические факторы распространяются и повреждают окружающие ткани. За это время можно спасти нейроны в переходной зоне (пенумбре) и ограничить повреждение мозга. Но пока не найдены нейропротекторы, способные защитить мозг человека от инсульта без неприемлемых побочных явлений. Ранее показано, что после инсульта в пенумбре синтезируются белки, регулирующих смерть и выживание клеток. Но механизмы, регулирующие их экспрессию, пока недостаточно изучены. Глобальная регуляция транскрипционной активности и белкового синтеза в клетках осуществляется эпигенетическими процессами, такими как метилирование ДНК, метилирование и ацетилирование гистонов. Роль разных гистонацетилтрансфераз и гистондеацетилаз в ишемической пенумбре после фототромботического инсульта (ФТИ, простая и воспроизводимая модель ишемического инсульта) детально изучена нами ранее. В 2018 г. нами изучены метилирование и ацетилирование гистона H3, а также экспрессия гистондеацетилаз HDAC1 и HDAC2 в нейронах и астроцитах пенумбры через 4 часа («терапевтическое окно») и 24 часа после ФТИ. В 2019 г исследованы изменения экспрессии и локализации гистонацетилтрансфераз HAT1 и PCAF и гистондеацетилаз HDAC3, HDAC4 и HDAC6 в пенумбре и ее ядерной и цитоплазматической фракциях. Также изучено влияние ингибиторов этих гистондеацетилаз на объем инфаркта и апоптоз в коре мозга мышей после ФТИ и показано защитное действие некоторых из них. В 2020 г с помощью иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентной микроскопии мы изучили изменения экспрессии и локализации ДНК-метилтрансферазы DNMT1, гистонметилтрансфераз SUV39H1 и G9a, сиртуинов SIRT1 и SIRT2 в нейронах и астроцитах пенумбры через 4 и 24 часа после фототромботического инсульта. Также изучено влияние ингибиторов этих белков на объем ФТИ-индуцированного инфаркта и апоптоз клеток пенумбры в коре мозга мышей. Методы исследования подробно описаны в отчетах по гранту РНФ № 18-15-00110 за 2018-2019 гг. Кратко о методах: Опыты проводили на взрослых самцах крыс или мышей, содержащихся в стандартных условиях при соблюдении международных, национальных и институтских принципов ухода и проведения экспериментов на животных. Фототромботический инсульт в коре мозга животных индуцировался лазерным облучением после инъекции гидрофильного фотосенсибилизатора бенгальского розового, который не проникает в клетки и остается в сосудистом русле. При лазерном облучении он генерирует синглетный кислород, индуцирующий окислительный стресс, агрегацию тромбоцитов и закупорку сосудов. Контроль: контралатеральная кора тех же животных или ложнооперированные животные, подвергавшиеся тем же операциям, но без введения фотосенсибилизатора. Для иммунофлуоресцентной микроскопии через 4 или 24 часа после ФТИ крыс подвергали эвтаназии. Мозг экстрагировали и фиксировали формалином. 20-мкм срезы мозга инкубировали с кроличьими антителами против ДНК-метилтрансферазы DNMT1, гистонметилтрансфераз SUV39H1 и G9a или сиртуинов SIRT1 и SIRT2. Затем их инкубировали с флуоресцентно-мечеными вторичными противокроличьими антителами CF488A или противомышиными антителами CF555. Срезы анализировали на микроскопе Eclipse FN1 (Nikon). Колокализацию исследуемых белков с маркерами нейронов (NeuN), астроцитов (GFAP) оценивали по Мандерсу. Визуализацию апоптотических клеток проводили по методу TUNEL. Для иммуноблоттинга через 4 или 24 часа после ФТИ крыс подвергали эвтаназии и на льду цилиндрическими ножами Ø3 и Ø7мм вырезали 2-мм кольцо вокруг зоны облучения, примерно соответствующие ткани пенумбры. С помощью набора CelLytic NuCLEAR Extraction Kit из гомогенатов пенумбры выделяли ядерную фракцию. Цитоплазматическая фракция - супернатант, не содержащий ядерный белок гистон Н3. В экспериментах использовали те же первичные антитела против DNMT1, SUV39H1, G9a, SIRT1 или SIRT2. Для определения объема инфаркта через 4 или 7 дней после ФТИ 2-мм фронтальные срезы мозга мышей окрашивали 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом, измеряли площади зон инфаркта, их суммировали и умножали на толщину среза. Также изучали действие ингибиторов DNMT1 (5-аза-2’-деоксицитидина); G9a (А-366 и BIX01294), Sirt1 (EX-527), Sirt2 (SirReal2) и Sirt1/2 (салермида). ДНК-метилтрансфераза DNMT1 присоединяет метильные группы к одной из цепей ДНК там, где комплементарная цепь метилирована после репарации или деления клеток. Методом вестерн-блот показано, что уровень DNMT1 в ядерной, и в цитоплазматической фракциях ткани пенумбры не изменялся через 4 часа после ФТИ в коре мозга крыс, но увеличивался через 24 часа. Иммунофлуоресцентная микроскопия подтвердила повышение уровня DNMT1 в пенумбре через 24 часа после ФТИ. При этом повышалась колокализация DNMT1 с маркерами нейронов (NeuN) и астроцитов (GFAP). Так как NeuN избирательно метит ядра нейронов, а GFAP окрашивает тела астроцитов, включая отростки, то эти данные объясняют результаты иммуноблоттинга. Вероятно, повышение уровня DNMT1 в ядерной фракции пенумбры обусловлено повышенной экспрессией в ядрах нейронов, в увеличение уровня DNMT1 в цитоплазматической фракции – экспрессией этого белка в теле и отростках астроцитов. Мы показали колокализацию DNMT1 с ядрами апоптотических клеток в ФТИ-индуцированной пенумбре. Ингибирование DNMT1 5-аза-2’-деоксицитидином защищало клетки ФТИ-индуцированной пенумбры от апоптоза. Это предполагает участие DNMT1 в апоптозе клеток пенумбры после ишемического инсульта. Можно предполагать, что ингибирование DNMT1 перспективно для терапии инсульта. Гистонметилтрансферазы SUV39H1 и G9a локализуются в клеточных ядрах, где метилируют лизины и аргинины в гистонах Н3 и Н4. Известно, что метилирование лизинов 9 и 27 в гистоне Н3, а также лизина 20 в гистоне Н4 глобально подавляет транскрипцию, а метилирование лизина 4 в гистоне Н3, напротив, активирует экспрессию генов. В контрольных образцах SUV39H1 обнаруживалась иммуноблоттингом в ядерной фракции коры мозга крысы, а в цитоплазме клеток она практически отсутствовала. Иммуноблоттинг и иммунофлуоресцентная микроскопия показали достоверное увеличение уровня SUV39H1 в ядерной фракции пенумбры через 24, но не через 4 часа после ФТИ. Колокализация SUV39H1 с нейрональными ядрами также возрастала через 24 после ФТИ. Однако ФТИ не влиял на колокализацию SUV39H1 с маркером астроцитов GFAP. Уровень гистонметилтрансферазы G9a в ядерной фракции контрольных образцов коры мозга крыс был также низок, а в цитоплазматической фракции не определялся. Но через 4 и 24 часа после ФТИ уровень G9a в пенумбре существенно увеличивался. Иммунофлуоресцентная микроскопия выявила ядерную локализацию G9a в нейронах, но не астроцитах пенумбры. В эти моменты так же повышался коэффициент колокализации G9a с маркером нейрональных ядер NeuN, а колокализация с маркером астроцитов GFAP не изменялась. Мы наблюдали колокализацию G9a с ядрами апоптотических клеток в ФТИ-индуцированной пенумбре. Введение мышам А-366 или BIX01294, ингибиторов G9a, защищало клетки пенумбры от апоптоза и снижало объем ФТИ-индуцированного инфаркта мозговой ткани. Это предполагает участие G9a в апоптозе клеток пенумбры после ишемического инсульта. Сиртуины SIRT1 и SIRT2 – NAD+-зависимые гистондеацетилазы III класса. Иммуноблоттинг показал, что SIRT1 локализуется преимущественно в клеточных ядрах, а в цитоплазме его уровень мал. Через 24 часа после ФТИ уровень SIRT1 в ядерной фракции пенумбры снижался более, чем вдвое, но соответственно повышался в цитоплазматической фракции. Причем повышение уровня SIRT1 в цитоплазме отмечалось уже через 4 часа после ФТИ. Это свидетельствует о перераспределении SIRT1 из ядра в цитоплазму клеток пенумбры. Иммунофлуоресцентная микроскопия также показала увеличение уровня SIRT1 в цитоплазме нейронов через 4 и 24 часа после ФТИ. При этом коэффициенты колокализации SIRT1 с маркерами нейрональных ядер NeuN через 24 часа после ФТИ снижались. Эти данные также свидетельствуют о перераспределении SIRT1 из ядер в цитоплазму в клетках ишемической пенумбры после фототромботического инсульта. В ядрах некоторых астроцитов отмечено присутствие SIRT1. Через 4 и 24 часа после ФТИ коэффициент колокализации SIRT1 с маркером астроцитов GFAP повышался, причем SIRT1 наблюдался и в цитоплазме этих клеток. В отличие от SIRT1, сиртуин SIRT2 локализовался преимущественно в цитоплазматической фракции пенумбры, а в ядерной фракции не определялся. ФТИ резко увеличивал уровень SIRT2 в цитоплазматической фракции пенумбры через 4 и 24 часа. Иммунофлуоресцентная микроскопия подтвердила эти данные, но достоверное повышение уровня SIRT2 наблюдалось только через 24 часа. В этот момент времени также повышалась колокализация SIRT2 с маркером нейрональных ядер NeuN, что говорит о появлении SIRT2 в ядрах нейронов. SIRT2 практически не экспрессировалась в астроцитах пенумбры, как в контроле, так и после ФТИ. На периферии пенумбры ФТИ-индуцированные изменения уровня исследованных белков были намного меньше и зачастую недостоверны. Двойное флуоресцентное окрашивание срезов ткани пенумбры антителами против исследуемых белков и маркером апоптоза TUNEL показало, что через 24 часа после ФТИ только антитела против DNMT1 и G9a колокализуются с ядрами апоптотических клеток, а SUV39H1, SIRT1 и SIRT2 – нет. Это свидетельствует о возможном участии DNMT1 и G9a в ФТИ-индуцированном апоптозе. Данные об участии эпигенетических белков в реакциях клеток пенумбры побудили нас изучить влияние их ингибиторов для того, чтобы выявить потенциальные нейропротекторы, способные защитить клетки мозга от последствий ишемического инсульта. С этой целью мышам вводили 5-аза-2’-деоксицитидин, ингибитор ДНК метилтрансферазы DNMT1; A-366 или BIX01294, ингибиторы гистонметилтрансферазы G9a; EX-527, ингибитор SIRT1; SirReal2, ингибитор SIRT2, или салермид, который ингибирует и SIRT1, и SIRT2. Через 4 суток после ФТИ 5-аза-2’-деоксицитидин, A-366 или BIX01294 почти вдвое снижали процент апоптотических клеток в пенумбре. Через 7 суток этот эффект сохранялся только в случае A-366. В остальных вариантах апоптотический индекс не отличался от контрольного (ФТИ без ингибиторов). Введение мышам ингибиторов изученных эпигенетических белков не влияло на объем инфаркта нервной ткани в мозге мышей через 4 суток после ФТИ. Однако через 7 суток в группе мышей, которым вводили А-366 (но не другие ингибиторы), объем инфаркта был вдвое меньше, чем в контрольной группе (ФТИ без ингибитора). Таким образом, ДНК метилтрансфераза DNMT1 и гистонметилтрансфераза G9a могут являться потенциальными белковыми мишенями в клетках ишемической пенумбры, а их ингибиторы 5-аза-2’-деоксицитидин, A-366 или BIX01294 - потенциальными нейропротекторами, способными защитить клетки пенумбры от постишемического повреждения коры мозга. Защитное действие этих веществ следует подробнее изучить в дальнейшем. Наиболее стойкое защитное действие на кору мозга мыши после фототромботического инсульта оказывало соединение A-366. Его можно рекомендовать как перспективный противоишемический нейропротектор.