Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном году в качестве основных экспериментальных моделей использованы эндометриальные мезенхимные стволовые клетки (эМСК) человека и мезенхимные стволовые клетки (МСК), полученные из периренального жира крыс. С помощью метода патч-кламп изучена активность ионных каналов в составе механочувствительных сигнальных комплексов в мембране эМСК человека. С использованием методов иммуноцитохимии и проточной цитометрии выявлена связь функциональной экспрессии кальций-зависимых калиевых BK-каналов в мембране эМСК с фазами клеточного цикла. Обнаружено, что уровень экспрессии ВК каналов минимален в G2M-фазе, что соответствует ожидаемым изменениям калиевой проницаемости и мембранного потенциала. Оказалось, однако, что селективные ингибиторы BK-каналов ибериотоксин и харибдотоксин не влияют на динамику прохождения цикла эМСК. С помощью методов ПЦР и иммунофлуоресценции впервые показана экспрессия каналов Piezo1 в эМСК. Экспрессия Piezo2 показана только на уровне мРНК. Совокупность полученных данных позволяет считать Piezo1/2 наиболее вероятными молекулярными коррелятами стретч-активируемых катионных каналов в мембране стволовых клеток. Локальный вход кальция через исследуемые каналы обеспечивает сопряженную активацию колокализованных калиевых ВК каналов в эМСК. В экспериментах по измерению уровня внутриклеточного кальция впервые показано, что селективный активатор каналов Piezo1 Yoda1 вызывает вход кальция, включающий, по крайней мере, две фазы – быструю и медленную. Быстрая фаза может быть обусловлена синергетическим действием Yoda1 и протока (shear stress) при смене раствора; медленная фаза отражает вход кальция при действии Yoda1. Таким образом, продемонстрировано, что один из основных механосенсорных путей в эМСК формируется при участии белка Piezo1. Разработаны и апробированы оптимальные подходы к прижизненному наблюдению и количественной оценке подвижности и миграции стволовых клеток. На модели «зарастания раны» (wound healing assay) с использованием цейтраферной сьемки впервые показано снижение скорости миграции эМСК человека после экстракции мембранного холестерина. Проанализированы возможности ингибиторного анализа роли ионных каналов в подвижности мезенхимных стволовых клеток (МСК) различного происхождения. Специального внимания заслуживает поиск путей повышения миграционного потенциала МСК с помощью эндогенных биологически активных веществ. В ходе работы по проекту были выделены и охарактеризованы МСК из периренального жира крысы. Мультипотентный статус полученных МСК был подтвержден при индукции адипогенной и остеогенной дифференцировки клеток in vitro. Обнаружено, что добавление в питательную среду предсердного натрийуретического пептида (ПНП, 10 нМ) существенно ускоряло зарастание экспериментальной раны. Результаты свидетельствуют, что ПНП повышает подвижность исследуемых МСК и таким образом может усиливать их миграционный потенциал. Повышение клеточной подвижности при действии ПНП сопровождалось частичной разборкой (disassembly) актинового цитоскелета. В рамках задач по идентификации нативных каналов, связанных с механотрансдукцией, проведены эксперименты по выявлению электровозбудимых натриевых каналов в эМСК человека. В ПЦР экспериментах обнаружена экспрессия генов SCN1B, SCN3B и SCN4B, кодирующих ß1-, ß3- и ß4-субъединицы электровозбудимых натриевых каналов. Методом патч-кламп в клетках эМСК зарегистрированы тетродотоксин-чувствительные ионные токи, обладающие кинетикой, характерной для электровозбудимых натриевых каналов. Полученные приоритетные данные дают стимул к развитию исследований, направленных на выявление неканонической роли электроуправляемых натриевых каналов в том числе, участия в передаче механических сигналов в стволовых клетках. Сообщается, что АТФ-индуцированная пуринергическая передача сигналов влияет на пролиферацию стволовых клеток, миграцию и дифференцировку в условиях in vitro и in vivo. В эМСК человека нами впервые показана, на уровне мРНК, экспрессия генов, кодирующих пуринэргические рецепторы Р2Х7 и Р2Х4 типа. С использованием кальций-связывающего зонда FURA-2АM показан вход кальция в эМСК при действии АТФ. Кроме того, вход Са2+ в эМСК зарегистрирован при активации рецептора Р2Х7. Полученные данные вкупе с литературными источниками обусловили наш интерес к дальнейшему поисковому исследованию в рамках проекта функциональной роли пуриноцепторов в мезенхимных стволовых клетках человека на модели эМСК.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. В соответствии с планом работы в отчетном году был расширен круг экспериментальных объектов: в исследованиях использованы мезенхимные стволовые клетки различного происхождения, а также культивируемые клетки линии К562, имеющие свойства мультипотентного предшественника клеток крови. Одним из основных объектов изучения механозависимых катионных каналов и их комплексов оставались мезенхимные стволовые клетки эндометрия человека (эМСК). Проведены сравнительные исследования механотрансдукции и клеточной подвижности на культурах эМСК, полученных от здоровых доноров и от пациентов с аденомиозом. Новым объектом исследования были мезенхимные стволовые клетки линии FetMSC, полученные из костного мозга 5-6 недельного эмбриона человека (Коллекция клеточных культур ИНЦ РАН). 2. С использованием метода патч-кламп исследовали механизмы, обеспечивающие согласованное функционирование ионных каналов в составе механочувствительных сигнальных комплексов, выявленных нами ранее в плазматической мембране эМСК. В опытах на клетках, инкубированных с акцептором стеролов метил-бета-циклодекстрином, проверена гипотеза относительно роли мембранного холестерина и рафтов в работе механозависимых кластеров каналов в эМСК. 3. В клетках линии К562 выявлена сопряженная механозависимая активация кальций-проводящих каналов и кальций-зависимых каналов. Впервые показано, что поступление кальция из внеклеточной среды в цитоплазму через механо-управляемые каналы в мембране клеток К562 активирует колокализованные с ними калиевые каналы малой проводимости (SK), которые не имеют собственной механочувствительности. Показано сохранение функционального сопряжения каналов в процессе механозависимой активации после инкубации клеток с деструктором актинового цитоскелета цитохалазином Д. Результаты позволяют полагать, что в плазматической мембране клеток К562 функционируют кластеры, включающие калиевые SK-каналы и белки Piezo1/2, формирующие стретч-активируемые катионные каналы (Чубинский-Надеждин и др., 2019, Цитология 61(7): 580-588). 4. С использованием селективного химического активатора катионных каналов Piezo1 продемонстрировано их участие в механозависимом кальциевом ответе и подвижности эМСК. В опытах, базирующихся на использовании методов прижизненной микроскопии, впервые показано, что повышение активности каналов Piezo1 приводит к снижению скорости миграции эМСК. (Chubinskiy-Nadezhdin et al, 2019, Eur.Biophys.J. 48: S98). 5. В ходе проведенного сравнительного исследования установлено, что при аденомиозе эМСК обладают повышенным миграционным потенциалом по сравнению с клеточными линиями, полученными от здоровых доноров. Однако при переводе клеток на среду без сыворотки клетки от донора с аденомиозом мигрировали медленнее нормальных клеток. Полученные данные важны в нескольких аспектах, в частности, позволяют использовать культуры эМСК как модель для выяснения механизмов, лежащих в основе изменений клеточной механики и подвижности при различных патологиях, включая аденомиоз (Сударикова и др., 2019, Цитология 61(12): 964-970). 6. На мезенхимных стволовых клетках линии FetMSC показаны новые возможности направленного изменения клеточной механики, подвижности и структур цитоскелета при действии эндогенного модулятора - предсердного натрийуретического пептида (ПНП). В клетках FetMSC обнаружена экспрессия рецепторов ПНП (тип А и С). На модели «зарастания раны» (wound healing assay) оценены изменения миграционных характеристик клеток при действии ПНП в широком диапазоне концентраций; с помощью окрашивания родамин-фаллоидином визуализированы сопутствующие изменения актиновых структур. Обнаруженные эффекты могут быть связаны с ранее неизвестными функциями каналов семейства ENaC в стволовых клетках (Ревитцер и др., 2019, Гены и Клетки 11(3):46; Ревитцер и др., 2019, Цитология 10(61):817-822). 7. Недавно возникли предположения о том, что механический стимул и активация каналов Piezo в мезенхимных стволовых клетках может индуцировать выброс АТФ во внеклеточную среду (ATP release). В наших исследованиях получены новые данные о влиянии внеклеточного АТФ на миграционную способность и пролиферативную активность эМСК, показана функциональная экспрессия рецептора P2X7 и проанализирована степень его участия в обнаруженных эффектах (статья на рецензии, J.Cell.Mol.Med). 8. Выявлена и изучена связь активности механочувствительных кальций-проницаемых каналов Piezo и калиевых ВК-каналов с пролиферацией и клеточным циклом эМСК (Chubinskiy-Nadezhdin et al, 2019, Acta Naturae, Спецвыпуск т.1,с.113). Полученные данные позволяют рассматривать динамику функциональной экспрессии BK-каналов на плазматической мембране эМСК как новый маркер клеточной пролиферации. BK-каналы, входящие в состав механозависимых сигнальных кластеров, могут оказывать существенное влияние на сигнальные процессы в эМСК путем модуляции мембранного потенциала, который динамически меняется в ходе клеточного цикла. Однако введение в среду селективных поровых блокаторов BK-каналов не влияло на скорость пролиферации и распределение эМСК по фазам цикла. Полученные данные указывают, что BK-опосредованный транспорт калия не является критическим регулятором прохождения клеток по клеточному циклу (Chubinskiy-Nadezhdin et al, 2019, Scientific Reports 9: 4595).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. В результате выполнения проекта установлено, что внеклеточный АТФ подавляет пролиферативный и миграционный потенциал мезенхимных стволовых клеток эндометрия человека (эМСК); эффект не связан с активацией P2X7R. Известно, что внутриклеточный АТФ попадает во внеклеточную среду в ответ на воспалительный стимул или после гибели клеток. Внеклеточный АТФ действует как воспалительный медиатор и через активацию пуринергических рецепторов (P2X и P2Y) влияет на миграцию, пролиферацию и дифференцировку различных типов клеток, в том числе, стволовых клеток человека. эМСК обладают высокой пластичностью, низкой иммуногенностью и способностью к направленной миграции, что позволяют считать их важным инструментом регенеративной медицины. В работе исследовали роль внеклеточного АТФ в пролиферации и миграции эМСК. Обнаружено, что АТФ-индуцированная активация пуринергических рецепторов подавляет миграционную способность эМСК. В ходе поиска мишени действия АТФ в эМСК была обнаружена экспрессия одного из наиболее распространенных пуринорецепторов, P2X7R. Тем не менее, действие специфического агониста P2X7R, 2′,3′-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP) не влияло на скорость миграции клеток. Присутствие в среде ингибитора рецептора P2X7, реагента AZ10606120, также не предотвращало индуцированное АТФ подавление миграции эМСК, что доказывало непричастность рецептора P2X7 к регуляции подвижности этих клеток. Было обнаружено, что, не являясь токсичным для клеток, внеклеточный АТФ индуцировал остановку клеточного цикла, подавляя пролиферацию, миграционный и соответственно регенеративный потенциал стволовых клеток эндометрия (Semenova et al., 2020. J. Cell. Mol. Med.). 2. Получены новые данные о сопряженной механозависимой активации Са-переносящих и Са-управляемых катионных каналов в мезенхимных стволовых клетках человека. C использованием метода патч-кламп в режиме регистрации одиночных каналов от участка клеточной мембраны (cell-attached) показано сохранение функционального сопряжения механочувствительных каналов (МЧК/Piezo) и кальций-активируемых калиевых каналов высокой проводимости (BK) после разрушения богатых холестерином липидных микродоменов (рафтов). В ходе работы были выявлены ограничения традиционного подхода для оценки целостности рафтов в плазматической мембране путем визуализации маркерного ганглиозида GM1. Впервые показана зависимость содержания кластеризованных молекул GM1 в мембране эМСК от фазы клеточного цикла. Результаты свидетельствуют о функциональной связи GM1-содержащих рафтов с клеточным циклом эМСК, а также о вероятных изменениях механических свойств мембраны при подготовке клеток к делению (Чубинский-Надеждин и др, 2020, Цитология). 3. В рамках развития новых численных методов оценки изменений внутриклеточных структур, лежащих в основе клеточной подвижности и механотрансдукции, описаны изменения организации фибриллярного актина в мезенхимных стволовых клетках линий FRSN и FetMSC в терминах фрактальной размерности Минковского в контроле и после действия ингибитора полимеризации актина латрункулина Б (Ревитцер и др., Гены и Клетки, 2020). 4. С помощью комплексного подхода, включающего электрофизиологический анализ ионных токов, показана экспрессия потенциал-зависимых натриевых каналов Nav в невозбудимых клетках, в том числе, линии эМСК. В ряде опытов с применением прижизненной микроскопии получены интересные данные, свидетельствующие о возможном ускорении миграции клеток при действии TTX (Шаматова и др., Гены и Клетки, 2020).