Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Подобраны условия электроспиннинга (ЭС), изготовлены и исследованы 3Д матриксы из растворов поликапролактона (ПКЛ), ПКЛ с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), ПКЛ с желатином из кожи свиньи (Жл), ПКЛ с гепарином (Геп), а также матриксы, содержащие диклофенак (ДФ), паклитаксель (ПТХ) и диметилсульфоксид (ДМСО). Все матриксы изготавливались из растворов полимеров и лекарственных препаратов в гексафторизопропаноле (ГФИП). ГФИП был использован в качестве растворителя, покольку в этом случае ЭС выполняется из истиных растворов полимеров и низкомолекулярных веществ. Показано, что все матриксы состоят из волокон диаметром от 0,16 до 1 мкм, диаметром пор от 1 до 6 мкм, с разной гидрофильностью поверхности. В некоторых матриксах распределение элементов в составе волокон исследовано методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС). Показано, что матриксы на основе ПКЛ обладают приемлимыми механическими характеристиками (прочность в диапазоне 3-6 МПа, максимальное удлинение не менее 290±16 %) для изготовления покрытий стентов, измерение остаточного напряжения влажных матриксов после двукратного удлинения показало, что усилие, оказываемое такими матриксами на балки установленного в артерию стента, составляет не более 4 % от нагрузки, оказываемой стенками артерии. Т.е. с точки зрения механического воздействия на стент покрытие на основе ПКЛ не привносит дополнительной существенной нагрузки на стент и может быть использовано для решения поставленных задач. Для исследования цитотоксичности планируемых к использованию лекарственных средств получены и охарактеризованы первичные клетки, которые могут принимать участие в развитие неоинтимы и рестеноза. Эндотелиоциты выделяли из пупочной вены человека (ПЭПВЧ) и характризовали по экспрессии CD31, VEGF-A, VE-Cadherin и фактора Фон Виллибранда (vWF). Гладкомышечные клетки сосудистой стенки (ГМК) – основной источник клеток неоинтимы – выделяли из внутренней сонной артерии человека и характеризовали по экспрессии α- актина (α-SMA) и десмина. Для выделения клеток внутренней массы атером был разработан собственный протокол, основанный на лизисе клеток поверхности атеросклеротической бляшки (АБ). Были получены культуры клеток стабильных и нестабильных АБ, которые были охарактеризованы по экспресии 8 антигенов (белков, экспрессированных в клетках, которые по литературным данным могут быть предшественниками клеток атером). Показно, что клетки обоих типов АБ экспрессируют α-SMA, аггрекан, CD14, CD34, VEGF-A, CD31, CD105 и фибронектин. В клетках нестабильных АБ лучше экспрессирован CD34, VEGF-A, в то время как в клетках стабильных АБ лучше экспрессирован CD31 и фибронектин. Показано, что цитотоксическая концентрация ДФ против исследуемых клеток близка к ранее описанной: при концентрации более 40 мкг/мл ДФ замедляет пролиферацию клеток. Цитотоксичность ПТХ против ПЭПВЧ и ГМК существенно выше описанной (~10 нМ, Axel D.I., et al, Circulation, 1997) и зависит от скорости пролиферации клеток – чем медленнее пролиферируют клетки, тем выше для них цитотоксическая концентрация ПТХ. Цитотоксическая концентрация ПТХ для ГМК как минимум в 50 раз выше, чем было описано ранее. Поскольку клетки АБ пролиферируют еще медленнее, чем ГМК или ПЭПВЧ нам не удалось зафиксировать цитотоксические концентрации ДФ и ПТХ против этих клеток. Показано, что все матриксы, за исключением матриксов с ПТХ нетоксичны для клеток. При этом ГМК прикрепляются к матриксам ПКЛ-ЧСА, а эндотелиоциты к матриксам с Жл даже в присутствии клеток крови. В рамках разарботки атромбогенных поверхностей предложен новый протокол подготовки матриксов с клетками для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). При помощи флуоресцентной и СЭМ исследовано связывание с матриксами ПЭПВЧ и клеток крови. ПЭПВЧ практически не связываются с поверхностью матриксов из ПКЛ с ЧСА, однако хорошо прикрепляются к матрисам с Жл даже в присутствии клеток крови. Показано, что введение триэтиламмонийной соли гепарина в состав раствора для ЭС позволяет получить матриксы, к которым хуже прикрепляются клетки крови. Методом введения термоактививрованного трития препараты 3Н-ПТХ и 3H-ДФ с удельной радиоактивностью ~0.3 Ки/мМ и ~0.9 Ки/мМ, соответственно. Для работы по исследлванию высвобождения лекарств их матирксов использовали матриксы, содержащие ~89 мкг/см2 ДФ, ~0,46 мкг/см2 ПТХ и 15-30.000 имп/мин/см2 радиактивномеченых лекарств. Высвобождение ДФ из матриксов ПКЛ-ДФ и ПКЛ-ЧСА-ДФ в ФБР имеет характер близкий к описанному ранее (Kanawung K., et al, Polymer Journal. 2007). Из ПКЛ-ДФ за первые 3 час инкубации с ФБР высвобождается 16 % ДФ, что составляет почти 85 % от того количества, которое высвобождается из матрикса за 27 дней (19 %). Из матрикса ПКЛ-ЧСА-ДФ диклофенак высвобождается существенно быстрее – за первые 3 час высвобождается 23 % ДФ, а за 27 суток – 65 %. По-видимому, ЧСА в составе волокон гидратируется, тем самым увеличивая площадь раздела фаз и облегчая выход из волокон хорошо растворимого в воде ДФ. Следует отметить, что связывание с ЧСА, по-видимому, не играет существенной роли в «удержании» ДФ в волокне, константа распределения ДФ свободного и связанного ДФ составляет 0,19 и 0,75 для матрикса ПКЛ-ДФ и ПКЛ-ЧСА-ДФ, соответственно. В случае, когда ФБР заменяется на свежий после каждой временной точки (имитация обмена биологической среды), кинетика высвобождения меняется принципиально. За первые 3 часа из ПКЛ-ДФ высвобождается уже 54 % ДФ и еще 21 % высвобождается в течение последующих 27 суток (всего 75 %). Из ПКЛ-ЧСА-ДФ за 3 часа высвобождается уже 63 % ДФ и еще 23 % высвобождается в течение последующих 27 суток (всего 86 %), т.е. из обоих типов матриксов ДФ высвобождается приблизительно одинаково, но не так, как описанно ранее (Kanawung K., et al, Polymer Journal. 2007). Эти данные демонстрируют, что высвобождение ДФ определяется не только его диффузией из волокна, но и концентрацией ДФ во внешней среде, т.е. взаимодействие ДФ с элементами матрикса вносит существенный вклад в высвобождение ДФ. Кроме того, оказывается, что практически весь ДФ может «покинуть» матрикс. По-видимому, в процессе высыхания растворителя при ЭС остаются нанопоры, через которые свободно диффундирует ДФ. Кинетика высвобождения ДФ в плазму человека в целом похожа на описанную для высвобождения ДФ в ФБР, за исключением того, что высвобождение идет быстрее и полнее. Из ПКЛ-ДФ за первые 3 часа высвобождается уже не 16, а 32%, а всего не 19, а 50%. Аналогично, из ПКЛ-ЧСА-ДФ за первые 3 часа высвобождается не 23, а 32 %, и уже за 9 суток высвобождается весь ДФ. Следует отметить, что инкубация матриксов с плазмой в течение 27 суток практически не влияет на их структуру. Концентрация ЧСА в плазме составляет приблизительно 1 мМ, концентрация ДФ после высвобождения 50 % ДФ составляет 0,47 мМ, константа ассоциации ДФ-ЧСА Kа = 5×105 M-1 (Yamasaki K., et al, AAPS Pharm Sci Tech. 2000). Таким образом, 99 % высвобожденного ДФ связано с ЧСА, т.е. не может повторно взаимодействовать с волокном так, как это было в случае с ФБР. Смена плазмы на свежую после каждой временной точки, ускоряет высвобождение ДФ на первой фазе выделения и приводит к более полному (78 % за 27 суток из ПКЛ-ДФ, или 100 % за 9 суток из ПКЛ-ЧСА-ДФ) высвобождению ДФ. Таким образом, имитирование «обмена среды», которое всегда имеет место в биологических системах, как в случае непосредственного контакта матрикса с кровью, так и в случае контакта с тканью (обмен тканевой жидкости), оказывает серьезное влияние на скрость и эффективность высвобождения ДФ. Двухфазная кинетика высвобождения ДФ позволяет предотвратить развитие воспалительной реакции как на острой фазе восстановления поврежденного во время установки стента сосуда (высокая доза ДФ), так и на фазе хронического воспаления (низкая доза ДФ). Кинетика высвобождения ПТХ из матриксов ПКЛ-ПТХ и ПКЛ-ЧСА-ПТХ в ФБР в целом соответствует описанной ранее (Srikar R., et al, Langmuir 2008) и характерной для ДФ. В условиях замены среды ПТХ высвобождается из волокон после первых 3-х дней, а в течение 27 дней высвобождается приблизительно в 2 раза больше ПТХ, чем при инкубации в стационарных условиях. Можно предположить, что в течение первых 3-х дней наступает равновесие между ПТХ, экспонированным на поверхности волокна, и ПТХ в растворе. Поскольку растворимость ПТХ невысока (растворимость ПТХ менее 0.3 mg/L или 3.5 мкМ в воде), скорость установления равновесия определяется десорбцией ПТХ с поверхности волокна. При удалении среды удаляется раствореный ПТХ, что приводит к высвобождению дополнительной порции ПТХ. В случае матриксов ПТХ-ЧСА-ПТХ связывание/десорбция с поверхности волокон сопровождается и связыванием ПТХ с ЧСА (Kа = 1.43 × 104 M–1, Purcell M., et al, Biochim. Biophys. Acta 2000). При инкубации ПКЛ-ПТХ и ПКЛ-ЧСА-ПТХ с плазмой закономерность высвобождения ПТХ сохраняется, однако кинетические кривые выходят на плато дольше - за 5-7 дней и из матриксов высвобождается значительно больше ПТХ (55-65 % против 45 %). При инкубации этих матриксов в условиях замены плазмы весь ПТХ высвобождается за 3 дня. Очевидно, что высвобождение всего ПТХ в течение 3-х дней не позволяет использовать такие матриксы в качестве покрытий стентов, для которых требуется двухфазная кинетика высвобождения с длительной второй фазой. При помощи РФЭС было обнаружено, что поверхность матриксов переобогащена как ЧСА, так и ПТХ, причем на поверхности находится практически весь ПТХ, который, по-видимому, попадает на поверхность с током растворителя. Для того чтобы «удержать» ПТХ во внутреннем объеме волокна, в состав раствора для ЭС был введен высококипящий растворитель ДМСО. Обнаружено, что введение в состав раствора для ЭС 6 % ДМСО (ПКЛ-ПТХ-6%ДМСО) существенно уменьшает скорость высвобождения ПТХ в течение первых нескольких суток, что коррелирует с данными РФЭС о экспонировании ПТХ на поверхности волокон. Матриксы, изготовленные из растворов с ДМСО и ЧСА, еще дольше удерживают ПТХ: высвобождение ПТХ из таких матриксов имеет двухфазный характер. Из матрикса ПКЛ-ЧСА-ПТХ-3%ДМСО даже в условиях замены плазмы за 27 суток высвобождается менее 60 % от введенного ПТХ. В условиях замены плазмы из этого матрикса за первые сутки высвобождается ~45 % а за последние (день 28) - 0,26 % ПТХ. Учитывая коэффициент диффузии ПТХ в артериальной стенке (от 1×10−8 cm2/s до 4.87×10−6 cm2/s, Levin A.D., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 2004), токсическую концентрацию ПТХ против ГМК (10 нМ, Axel D.I., et al, Circulation 1997), исходное содержание ПТХ в матриксе (0.46 µg/cm2), низкую растворимость ПТХ и его сродство к мембранным структурам, эластину и ЧСА, а также интенсивное высвобождение ПТХ на начальной стадии имплантации стента с покрытием, можно предположить, что субоптимальная концентрация ПТХ может поддерживаться в сосудистой стенке на протяжении 3 мес. Т.е. покрытие стентов матриксом ПКЛ-ЧСА-ПТХ-3%ДМСО позволяет реализовать бустерную доставку препарата сразу после имплантации и длительное поддержание его цитотоксичной концентрации в сосудистой стенке. Была отработана технология нанесения покрытия на металлические стенты и установки покрытых 3Д матриксами стентов на баллоны доставляющего устройства. Стенты прочно охватывали баллон, не меняли позиции в процессе установки в животных. Были выполнены пробные имплантации 3-х стентов в общую подвздошную артерию кроликов. Все животные пережили операцию и были выведены из эксперимента спустя 2 недели после имплантации стента. В результате выполнения этого блока, были отработаны все необходимые стадии имплантации покрытых стентов в общую подвздошную артерию кроликов для последующего исследования их функционирования in vivo. Таким образом, все запланированные работы выполнены. Кроме того выполнены 2 пункта плана на 2019 г.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Учитывая двукратное удлинение матриксов, покрывающитх стенты имеющее место при установке стентов исследовано влияние деформации на высвобождение лекарственных препаратов из 3Д матриксов, изготовленных методом ЭС. При помощи СЭМ показано, что двукратное удлинение матриксов не приводит к нарушению структуры волокон хотя и сопровождается ориентацией волокон вдоль вектора силы и уплотнением укладки волокон. Линейные размеры матриксов после двукратного удлинения матриксов и снятия нагрузки уменьшаются на 10-17% в зависимости от типа матрикса. Данные о высвобождении сиролимуса из матриксов, демонстрируют, что характер высвобождения лекарственных средств из матриксов не изменяется (при нормировке на линейные/весовые/объемные характеристики матриксов). Тем не менее, следует учитывать изменение площади матриксов при установке стентов, рассчитывая дозу лекарственного препарата, вводимого в состав матриксов. Исследовано влияние артериальной стенки (подвздошной артерии кролика) на скорость высвобождения паклитакселя из покрытий стентов. Обнаружено, что артериальная стенка замедляет высвобождение паклитакселя в раствор в 3-4 раза в течение первого часа и в 2-2,5 раза в течение суток (Рисунок 4). После 24 часов инкубации артериальной стенкой удерживается более половины высвобождающегося из покрытия ПТХ. Отработана технология гистологического исследования стентов с покрытием, нанесенным методом ЭС после их эксплантации из лабораторных животных. Поскольку механические свойства металлического стента, 3Д матрикса и биологической ткани не позволяют использовать для приготовления гистологических образцов общепринятые гистологические методы (заливка в парафин) для подготовки гистологических блоков была использована заливка в акрилатную смолу LR White Resign¸ Hard grade (London Resign Company Ltd, Великобритания). Были отработаны температурные режимы полимеризации и количество катализатора полимеризации необходимые для получения блоков с требуемой жесткостью/вязкостью. Была изготовлена оснастка (переходная плита и блок фиксации цилиндрических образцов) и отработаны условия приготовления гистологических срезов с использованием микротомных ножей из карбида вольфрама (вертикальный угол резания 11-12°). Была отработана процедура фиксации срезов на покровных стеклах основанная на использовании стекол, модифицированных 3-(аминопропил)триэтоксисиланом и формировании кросс-сшивок при помощи глутарового альдегида и полилизина. Отработаны условия депластификации срезов с использованием 2-метоксиэтил ацетата и их окрашивания Гематоксилин-Эозином. Все протоколы в последующем использовали для гистологического исследования эксплантированных из кроликов стентов с участком подвздошной артерии. Выполнено сравнительное исследование металлических стентов (МС) и таких стентов с покрытием (ПМС). Покрытие наносили на стенты методом ЭС из растворов ПКЛ с ЧСА и ПТХ в ГФИП с 3% ДМСО как описано в отчете за 2018 г. Физико-химические свойства таких 3Д матриксов, их способность высвобождать ПТХ были исследованы в 2018 г. (Kuznetsov K., et all., Materials, 2018). Механические свойства материала покрытия (эластическая деформация 7-10%) позволяет прочно осадить покрытый стент на баллоне; в процессе доставки в подвздошную артерию все стенты были легко позиционированы в требуемом месте (рис. 17 и 18 отчета за 2018 г.). После имплантации контрольных (МС) и экспериментальных (ПМС) стентов, не было выявлено гангрены конечностей и/или признаков их трофического нарушения, нарушения кровотока. Проходимость контрольных и экспериментальных стентов за весь период наблюдения составила 100%. Данные обзорной микроскопии демонстрируют (Рисунок 7), что после установки голометаллических стентов их балки со временем углубляются в интиму стенки сосуда, в то время как в покрытых стентах нагрузка более равномерно распределяется по покрытию и такого процесса не наблюдается. В группе МС в период 6 месяцев линейная скорость кровотока (ЛСК) составил 0,69 ± 0,01, а в группе ПМС ЛСК составил 0,42± 0,0. Средняя линейная скорость кровотока (сразу после установки стентов) составляла 0,3 ± 0,01 м/с. Таким образом, скорость кровотока в сосудах с ГМС выросла спустя месяц от времени имплантации на 25%, спустя еще 2 месяца еще на 20% и после следующих 3 месяцев еще на 27%. Таким образом, интегрально скорость кровотока в МС за 6 месяцев выросла более, чем в 2 раза, сохраняя тенденцию к линейному росту. В сосудах с ПМС спустя 1 месяц от времени установки стента не было обнаружено роста скорости кровотока, за последующие 2 месяца она выросла приблизительно на 23%, а спустя еще 3 месяца всего на 7%. Т.е. в сосудах с покрытыми стентами наблюдается тенденция стабилизации скорости кровотока после 3 месяцев функционирования стента. Поскольку скорость кровотока отражает эффективное сечение просвета сосуда, данные о ЛСК демонстрируют быстрое уменьшение эффективного сечения просвета после установки МС и существенно более медленное (с тенденцией к стабилизации) уменьшение эффективного сечения в сосудах с ПМС. Эти данные подтверждаются данными гистологического исследования: уже через 3 месяца в сосудах с МС наблюдается рост рыхлой неоинтимы, которая еще более выражена на сроке 6 месяцев. В сосудах с ПМС на сроке 3 месяца наблюдается слабая пенетрация балок в интиму, а на сроке 6 месяцев формирование плотного слоя ткани, обращенной в кровоток. При более высоком разрешении в этой ткани можно идентифицировать фибробласты и поверхностных слой клеток, похожих на клетки эндотелия. Полученные данные хорошо согласуются с данными по высвобождению паклитакселя (Kuznetsov K., et all., Materials, 2018) в соответствие с которыми в течение 1 месяца в стенке сосуда поддерживается цитотоксическая концентрация паклитакселя (нет изменений стенки), поддержание субоптимальной концентрации паклитакселя на протяжении еще 2-3 месяцев (небольшой рост неоинтимы) и после завершения высвобождения цитостатика рост новообразованной ткани. В целом полученные результаты демонстрируют явное преимущество стентов с покрытием, нанесенным методом электроспиннинга и высвобождающим ПТХ перед МС. Исследована цитотоксичность сиролимуса против первичных эндотелиоцитов из пупочной вены человека, гладкомышечных клеток из внутренней сонной артерии человека, фибробластов из ткани десны человека, и трансформированных клеток линий HeLa и HepG2; повторены эксперименты по цитотокичности диклофенака и паклитакселя. Обнаружено, что в дозе до 1 мкг/мл СРЛ не токсичен для SMC и клеток лини HepG2. Начиная с концентрации 10 нг/мл СРЛ проявляет способность ингибировать пролиферацию первичных эндотелиоцитов человека, первичных фибробластов и клеток линии HeLa. Основываясь на этих данных нами был спланирован дизайн матриксов для покрытия стентов, а именно содерждание СРЛ в матриксах будет составлять 0,92 мкг/см2. Уточнены данные о цитотоксичность ДФ и ПТХ. На рисунке 11 представлены данные токсичности исследуемых матриксов против фибробластов человека, клеток линии HeLa и HepG2 в соответствие с ГОСТ ISO 10993-5-2011. Оказалось, что все матриксы, за исключением 3Д матрикса с ПТХ, могут быть признаны нетоксичными. Методом введения термоактивированного трития получены препараты 3Н-СРЛ. Препараты очищены обращеннофазовой хроматографией на колонке ProntoSIL-120-5-C18, объемная радиоактивность препаратов ~0,03 mCi/ml (~120 Ci/mM). Методом электроспиннинга изготовлено 3 типа матриксов с СРЛ из растворов базового полимера ПКЛ в ГФИП: 5%ПКЛ, 5%ПКЛ с ЧСА и 5%ПКЛ с ЧСА и 3%ДМСО. Матриксы охарактеризованы СЭМ (Рисунок 13), исследована кинетическая зависимость высвобождения СРЛ из матриксов (Рисунок 14). Показано, что скорости высвобождения СРЛ их разных матриксов близки к таковым для ДФ и ПТХ (данные 2018 г. ; Kuznetsov K.A., all., International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials 2019; Kuznetsov K., et all., Materials, 2018). СРЛ быстрее высвобождается в сыворотку крови, чем в физраствор и быстрее при инкубации в динамических условиях. Скорость высвобождения, определяется так же как и в случае ДФ и ПТХ десорбцией СРЛ с поверхности волокна. Для связывания лекарственных препаратов с целью векторизации доставки препаратов в стенку артерий и уменьшения их транспорта в кровь предложено использовать адсорбцию препаратов на угольных сорбентах. Поскольку такие сорбенты используются в качестве прероральных прапаратов и в гемодиализе (Анисимова Н.Ю., Громова Е.Г. Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2011; Sandeman S, et al. J Biomater Tissue Eng. 2012) нет препятствий для их использования и в составе имплантируемых изделий. Исследовано связывание ДФ с выбранными в пилотных экспериментах наиболее эффективно связывающими ДФ 2-я сорбентами – сажа KetjenBlack 600 DJ и активный уголь Anderson AX-21 (ДФ был выбран из за доступности по цене и количеству). Емкость обоих адсорбентов и эффективность связывания ДФ из физиологического раствора практически не отличаются и составляют приблизительно ¼ веса адсорбента. Костанта адсорбционного равновесия для сажи КВ-600 составляет ~0,14 л/мг а для активного угля Anderson AX-21 ~0,13. Сажа с более высокой селективностью связывает ДФ из сыворотки крови, особенно в области низких концентраций. Исследованы особенности десорбции ДФ из сажи после сорбции из раствора ДФ в ФБР или в сыворотке крови. При сорбции из сыворотки ДФ быстро десорбируется как в статических, так и в динамических условиях, в то время как сорбция из ФБР приводит к длительному удержанию ДФ, т.е. для реализации векторной доставки необходимо формировать комплексы ДФ с адсорбентами в отсутствие белков. Такие условия можно получить, если изготовить методом ЭС волокна с сажей, поскольку, как мы показали ранее, в результате высыхания растворителя в процессе ЭС в волокнах формируются поры, через которые легко диффундируют лекарственные препараты, но не белок. Исходя из условий ЭС необходимо, чтобы сопротивление волокна должно составлять менее 200 МОм. Мы исследовали предел перколляции суспензий адсорбентов в растворах для ЭС и сопротивление наливных пленок. Сопротивление 10% супензии угля АХ-21 и угольной пленки, полученной из этой суспензии больше 2 МОм/см (т.е. сопротивление волокна >20.000 МОм) следовательно, такие суспензии могут быть использованы для получения волокнистых адсорбентов методом ЭС. Исследована возможность улучшения селективного связывания эндотелиоцитов с поверхностью матриксов при использовании ковалентных коньюгатов циклического RGDfC пептида с ЧСА и введении этих коньюгатов в процессе ЭС. Такой подход позволяет управлять плотностью RGD-экспонирующих участков и обеспечить достаточное количество контактов для связывания крупных эндотелиальных клеток. Используя реакцию сопряженного присоединения по Михаэлю были синтезированы ковалентеные коньюгаты цикло(RGDfC) с ЧСА, преварительно модифицированным 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновой кислотой. Методом ЭС изготовлены и охарактеризованы матриксы с разным содерджанием цикло(RGDfC)-ЧСА. Показано, что эффективность связывания первичных эндотелиоцитов человека с такими матриксами определяется концентрацией экспонированного RGD-пептида, а подход может быть использован для эндотелизации поверхностей, котрактирующих с кровью. Таким образом, все запланированные работы выполнены с существенным превышением планов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Поскольку при установке и раскрывании стента в стенозированной артерии его диаметр увеличивается в среднем в 2 раза, высвобождение лекарственных препаратов из растянутых покрытий имеет принципиальное значение для функционирования таких покрытий. На этапе 2020 г. были уточнены данные о влиянии деформации на высвобождение лекарственных препаратов из покрытий разного состава. При этом была смоделирована двухосная деформация матриксов, оценено изменение площади матриксов в разных местах деформируемого матрикса и получен большой массив экспериментальных данных о высвобождении лекарств из матриксов состава: 5%ПКЛ/ПТХ, 5%ПКЛ/10%ЧСА/ПТХ, 5%ПКЛ/10%ЧСА/3%ДМСО/ПТХ. Моделирование показало, что несмотря на существенную неоднородность деформации матрикса из-за краевых эффектов, изменение площади в контрольных точках варьирует от +37,3% до +43,7%, т.е. в пределах не более 6,4%. Таким образом, можно не учитывать эффект положения при экспериментальной работе. Полученные данные продемонстрировали, что деформация практически не влияет на кинетику и полноту высвобождения лекарственных препаратов из матриксов. Характер кинетических кривых и конечные точки совпадают с хорошей точностью. Наиболее принципиальным является то, что матрикс состава 5%ПКЛ/10%ЧСА/3%ДМСО/ПТХ, который оптимально подходит для изготовления покрытий голометаллических стентов (Kuznetsov K.A., et al., Materials. 2018) не изменяет свойств, т.е. кинетика высвобождения ПТХ из растянутого матрикса идентична таковой для исходного матрикса. Уточнены данные относительно транспорта лекарственных препаратов через артериальную стенку из матриксов/покрытий стентов 2-х типов - 5%ПКЛ/10%ЧСА/3%ДМСО/ПТХ и 5%ПКЛ/10%ЧСА/3%ДМСО/СРЛ с паклитакселем и сиролимусом, в дозах 0,46 и 0,9 мкг/см2. Показано, что артериальная стенка эффективно удерживает лекарственные средства. Например, только 12,5% из потенциально высвобождаемого из матрикса в плазму крови сиролимуса, диффундирует через стенку подвздошной артерии, в то время как остальной препарат задерживается в стенке. При этом высвобождение лекарственного средства в плазму крови (имитация тканевой жидкости) идет медленнее (для ПТХ) чем в физраствор или со сравнимой скоростью (для СРЛ). Эти данные позволяют надеяться на длительное поддержание субцитотоксических концентраций лекарств в артериальной стенке и позволяют уменьшить дозу вводимых в покрытие препаратов. Основная часть проекта работ в 2020 г. была направлена на решение проблемы направленной доставки препаратов в артериальную стенку при минимизации их высвобождения в кровь. Для этого было предложено использовать матриксы, изготовленные методом электроспиннинга и наполненные углем – адсорбентом лекарственных препаратов. Такой подход позволяет зафиксировать частицы угля, предотвратить взаимодействие с углем биомолекул плазмы крови, увеличить его емкость и прочность удержания лекарств. Однако, для его реализации требуется мелкодисперсный уголь с частицами много меньше, чем диаметр получаемых методом электроспиннинга волокон. При помощи двухстадийного размола исходного угля АХ-21 на шаровой и, затем, бусинковой мельницах такой уголь был получен и охарактеризован при помощи СЭМ. Была получена супензия угля в воде и стабилизированная суспензия угля в растворе поливинилпирролидона. Были подобраны системы растворителей, в которых удалось получить стабильные суспензии угля, были отработаны способы приготовления суспензий, практически не содержащих крупных аггрегатов угольных частиц (при помощи центрифугирования суспензий). Было показано, что такие суспензии имеют достаточно высокое сопротивление (минимальное у раствора 2,5%У/5%ПКЛ/0,1мМТЕА составляет 860 кОМ, у наливной пленки из этого раствора – 10 кОм) и могут быть использованы в качестве растворов для электроспиннинга без опасности электрического замыкания между электродами. В экспериментах по оценке емкости углей по СРЛ было обнаружено, что емкость угля в плазме составляет 13,5±1,5 мкг СРЛ на 100 мкг угля, в ФБР – 33,5±2,7 мкг СРЛ на 100 мкг угля. Емкость размолотого угля несколько выше, чем неразмолотого при связывании лекарств в ФБР (по данным предыдущего этапа она составляет 25%) и приблизительно сравнима при связывании лекарств из плазмы крови ( емкость неразмолотого угля в этом случае составляет 0,16 мкг/мкг). Однако кинетики десорбции лекарственных средств из размолотого угля отличаются от неразмолотого принципиальным образом. Если после связывания с неразмолотым углем диклофенак быстро высвобождался в плазму крови вне зависимости от условий сорбции лекарства на уголь и более половины связанного препарата десорбируется уже в течение первых трех часов (см. отчет за 2019 г), то с размолотым углем СРЛ связан существенно прочнее. Через 3 часа десорбируется не более 3% от сорбированного лекарства, а через сутки не более 7-8% вне зависимости от варианта исследуемого угля. При этом оказалось, что перемол угля в растворах ПВП (эффективных для стабилизации суспензии) не приводит к изменению его взаимодействия с СРЛ и, таким образом, суспензии угля в ПВП могут быть использованы и для приготовления сорбентов. Для изготовления наполненных углем матирксов на предварительном этапе работы было изготовлено более 32 вариантов разных матриксов как с коаксиальными так и с некоаксиальными, волокнами. Матриксы 13 типов были исследованы на предмет связывания/высвобождения ПТХ и СРЛ. Для основного исследования были выбраны матриксы с гомогенными волокнами состава 2,5%У/5%ПКЛ/0,1мМТЕА и матрикс с коаксиальными волокнами состава 5%У/5%ПВП/7%ПКЛ. Структура матриксов была охарактеризована при помощи СЭМ и световой микроскопии (коаксиальные волокна хорошо видны на световой микроскопии с иммерсией). Было показано, что матриксы не отличаются от матриксов без угля по максимальному удлинению и прочности и могут быть использованы в качестве удерживающего слоя в составе многослойных матриксов – лекарственно-наполненных покрытий металлических стентов. Исследование связывания СРЛ с матриксами продемонстрировало, что матриксы с гомогенными волокнами существенно более эффективно связывают СРЛ из ФБР по сравнению с матриксами из коаксиальных волокон (70-80% против 50%, соответственно), В плазме крови такой разницы не наблюдается. Насыщение связывания в физрастворе наблюдается уже спустя 3 часа от начала процесса, в то время как насыщение связывания в плазме достигается только спустя 8 часов от начала инкубации. Матриксы с ЧСА менее эффективно связывают СРЛ по сравнению с матриксами без ЧСА. Кинетика десорбции СРЛ в ФБР в целом похожа для разных матриксов и достигает насыщения после 8 часов инкубации. При этом матриксы с ЧСА более эффективно удерживают СРЛ в физрастворе. Напротив, при инкубации в плазме крови из таких матриксов СРЛ десорбируется быстрее, чем из аналогов без ЧСА. При этом матриксы с гомогенными волокнами существенно более эффективно удерживают СРЛ и не более 3,5 – 4,5% связанного с ними СРЛ высвобождается из таких матриксов в течение суток. Матриксы с коаксиальными волокнами быстрее и в большем количестве высвобождают СРЛ, хотя и в этом случае количество высвобожденного СРЛ через сутки не превышает 13% от связанного. Следует отметить, что исследуемые матриксы характеризуются разным удельным содержанием угля – в коаксиальных его как минимум в 3-5 раз меньше. В целом, упаковка угля в волокна практически не влияет на связывание СРЛ с углем, 70-80% СРЛ связывается с углем в суспензии или в составе волокон из ФБР и 30-40% из плазмы крови через 24 часа. В ФБР из угля упакованного в волона высвобождается несколько больше СРЛ чем из угля в суспензии (40% против 25%), однако при инкубации с плазмой закономерность меняется и из волокон СРЛ высвобождается в 2 раза медленнее (из однородных волокон). При этом из коаксиальных волокон высвобождение идет существенно быстрее и более эффективно. Механизм такого процесса не совсем понятен, однако полученные данные могут быть использованы не только в контексте решаемой задачи, но и возможно, для прогнозируемой, пролонгированной доставки лекарственных препаратов. Была исследована способность матриксов, содержащих слой наполненных углем волокон к направленной доставке препаратов. Для этого, матрикс, состоящий из трех слоев внутренний 5%ПКЛ/10%ЧСА/3%ДМСО (10-15% от общей толщины), средний слой с уголь-наполнеными волокнами (20% от общей толщины) и внешний слой из 5%ПКЛ/10%ЧСА/3%ДМСО с сиролимусом (65-70% от общей толщины) устанавливали в двухобъемные планшеты (Transwell®, Corning Inc, США) и оценивали скорость высвобождения 3Н-СРЛ в нижнюю и верхнюю лунки. В качестве контроля был изготовлен матрикс, не содержащий слоя волокон с углем. Было показано, что слой с наполненными углем волокнами действительно адсорбирует значительную часть СРЛ (за 24 часа в ФБР в верхнюю камеру высвобождается менее 5% от общего количества, в плазме менее 12%), что позволит замедлить его высвобождение в кровь, компенсируя быстрое высвобождение препарата на первой стадии выхода препарата из матрикса. Таким образом, такой подход может быть использован для векторизации доставки препаратов из матриксов, изготовленных методом электроспиннинга. Данные по токсичности матриксов с наполненными углем волокнами, полученные в соответствии с ГОСТ ISO 10993-5-2011, позволяют заключить, что данные матриксы не являются токсичными для клеток исследуемых типов. Таким образом, уголь наполненные матриксы могут быть использованы для изготовления имплантируемых изделий. Завершен первый этап исследования по оценке эффективности функционирования стентов с покрытием, высвобождающим сиролимус (Nazarkina Zh. K., et al. Materials 2020) и стентов с покрытием, не содержащим сиролимус, in vivo. Изготовлены, установлены на устройства доставки и имплантированы в кроликов на срок 3 и 6 месяцев стенты с покрытиями которые содержат сиролимус и с покрытиями без сиролимуса. Все процедуры по оценке проходимости стентированных участков и постэксплантационнное исследование будут выполнены так же как описано нами ранее в отчетах за прошлые этапы и в статье Кузнецова К.А. (Kuznetsov K.A., et al. Polymers 2020). Задержка в плане выполнения работ возникла по независящим от исполнителей причинам (эпидемиологические ограничения).