Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Было проведено сравнение тяжести ОПП при моделировании ишемии почки у молодых, и старых крыс. Оценено повышение в крови и моче маркера NGAL, проведено сравнение их с креатинином и мочевиной крови. Отработаны схемы создания ограничения по калориям у молодых и старых крыс, и эти схемы были применены к описанным моделям ОПП. Получены данные о защитном действии ограничения по калориям для ОПП. На молодых и старых крысах были проанализированы разные схемы ограничение калорийности питания (ОКП). Уменьшение количества корма до 65% (ОКП35%) и 75% (ОКП25%) от дневной нормы значимо уменьшало концентрацию мочевины в сыворотке крови молодых крыс после И/Р. Однако, у старых крыс (24 мес), в отличие от молодых животных, ОКП35% в течение 4 недель не обладало значимым нефропротекторным эффектом. У взрослых крыс возрастом 12 месяцев еще сохранялся некоторых защитный эффект ограничения питания, однако он был менее выражен, чем у молодых крыс. Интересно, что голодание в течение 3 дней (ОКП100%) не вызывало значимого изменения тяжести почечного повреждения у молодых крыс. Стоит отметить, что уровни мочевины в сыворотке крови у интактных крыс разных возрастных групп статистически не отличались, то есть тяжесть ОПП практически не зависела от возраста животных. У молодых крыс при ограничении питания было выявлено увеличение соотношения LC3 II/LC3 I в ткани почек, что указывает на активацию аутофагии. В то же время у старых крыс, в отличие от молодых, ОКП35% не вызывало увеличения соотношения LC3 II/LC3 I. Таким образом, можно заключить что активацию процессов аутофагии ограничение питания вызывает только у молодых животных, а у старых крыс механизмы аутофагии в этом случае не активируются. Анализ активации аутофагии с помощью ингибитора mTOR рапамицина показал, что в клетках, полученных из почек молодых крыс, рапамицин в концентрациях 100 нМ и 500 нМ приводил к увеличению количества аутофагосом, оцененного по интенсивности флуоресценции специфического зонда Cyto-ID. У старых крыс отсутствовало повышение флуоресценции Cyto-ID в клетках канальцевого эпителия в ответ на инкубацию с рапамицином. Стоит отметить, что клетки старых крыс изначально показывали меньшую интенсивность флуоресценции Cyto-ID, чем клетки, полученные из молодых крыс. Можно заключить, что у старых крыс количество аутофагосом в клетках почек изначально находится на более низком уровне, чем у молодых, и не увеличивается при действии рапамицина, то есть сигнальные пути аутофагии ингибированы. Интересные результаты получены при анализе активности лизосом в переживающих срезах почки с помощью конфокальной микроскопии. У молодых крыс, получавших в течение 4 недель ограниченное количество корма, было отмечено увеличение интенсивности флуоресценции зонда LysoTracker Green по сравнению с контрольной группой. Однако, на витальных срезах почек старых крыс из группы ОКП35% увеличения интенсивности флуоресценции LysoTracker Green выявлено не было. Кроме средней интенсивности изменялись также показатель куртозиса, который характеризует меру остроты пика распределения и косвенно может говорить о гетерогенности канальцев на срезе. У молодых крыс значения куртозиса были на низком уровне, т.е. можно отметить, что интенсивность флуоресценции канальцев на срезах была распределена равномерно. У старых крыс показатели куртозиса возрастали, особенно сильно в группе ОКП35%, что указывает на повышение гетерогенности канальцев. Важно отметить, что, в отличие от количества аутофагосом, количество лизосом у молодых и старых крыс (не подвергавшихся ограничению питания) не отличалось. У молодых и старых крыс изучали функцию митохондрий и интенсивность процессов митофагии. Одним из маркеров, характеризующих митофагию, является белок PTEN-induced putative kinase 1 (PINK-1). Было показано, что содержание PINK-1 уменьшается в митохондриях молодых крыс после ОКП35%, что может свидетельствовать об элиминации популяции плохо функционирующих митохондрий (с низким трансмембранным потенциалом) за 4 недели проведения ОКП. Также в гомогенатах почек молодых и старых крыс было проанализировано содержание митохондриальной деацетилазы SIRT-3. У молодых крыс после ОКП35%, наблюдалось возрастание количества данной деацетилазы. У старых крыс, питавшихся без ограничений, уровень SIRT-3 изначально был значительно ниже, чем у молодых животных, однако, после 4 недель на ОКП35% уровень SIRT-3 резко возрастал. На первичных культурах клеток почечного эпителия, выделенных из почек крыс разного возраста, показано, что клетки, выделенные из почек молодых крыс, характеризуются более интенсивной скоростью роста, превышающей рост старых клеток более чем в 4 раза. Оказалось также, что клетки, полученные из почек старых крыс, после повреждающего действия ишемии пролиферируют примерно в 3 раза медленнее, чем клетки из молодых животных. В отдельном исследовании определено влияние пола животного и беременности на развитие ОПП после ишемии почки. Беременность крыс оказывала значительный нефропротекторный эффект, снижая концентрацию креатинина в сыворотке крови в 2 раза по сравнению с небеременными самками. Маркер раннего повреждения почек, нейтрофильный желатиназа-ассоциированный липокалин (NGAL) через 48 часов после ишемии/реперфузии почки увеличивался более чем в 7 раз у небеременных самок, тогда как в крови у беременных животных после ишемии наблюдалось вдвое меньшее количество NGAL. Появление маркеров повреждения почек в крови было ассоциировано с повышенным уровнем продукта перекисного окисления липидов, малонового диальдегида (МДА) в ткани почек. Таким образом, основываясь на маркерах ОПП и окислительного стресса можно заключить, что беременность снижает тяжесть ишемической ОПП. Для более подробного анализа влияния беременности на острое почечное повреждение было изучено развитие острого тубулярного некроза. Зоны некроза канальцев после ишемии занимали большие участки ткани коры почки. Кроме того, во многих канальцах имелись десквамированные или дегенерированные эпителиоциты. Обнаруживались также множественные гиалиновые цилиндры в просвете канальцев, что указывает на возможную окклюзию нижележащих сегментов нефрона и нарушение тока первичной мочи. Беременность приводила к снижению гистопатологических показателей у крыс, перенесших ишемию почек. Еще одним изученным маркером ишемического повреждения клеток является фиброзная трансформация ткани. В нашей экспериментальной модели уровень фиброза, оцененного через два месяца после И/Р, был значительно выше в группе небеременных самок, чем у беременных крыс. Помимо оценки физиологических и гистологических изменений был проведен анализ сигнализации, связанной с развитием ишемической толерантности. Мы обнаружили, что уровни белков, связанных с пролиферацией и регенерацией клеток, были увеличены в почках беременных крыс. Были увеличены уровни PCNA, GDF11, VEGF в ткани почек и трехкратное увеличение концентрации эритропоэтина в моче беременных животных. Кроме того, у беременных животных снижен уровень GSK3β в нефосфорилированной (ферментативно активной) форме, которая, вносит вклад в промотирование клеточного повреждения. Наоборот, неактивная (фосфорилированная по 9 серину) форма GSK3β в большем количестве выявлялась в почках беременных крыс. В сумме это означает, что в почках беременных животных соотношение P-GSK3β/GSK3β было в 6-7 раз выше, чем в почках небеременных животных. Отдельным направлении работы изучалось влияние сепсиса на развитие ОПП у различных возрастных групп животных. Получены данные о развитии ОПП при введении крысам разного возраста липополисахарида. Выявлено, что количество активной активированной каспазы-3 у взрослых и новорожденных крыс после воздействия ЛПС увеличивается. У взрослых крыс было выявлено увеличение каспазы-3 в 2 раза сравнению с интактным животными, у 3-дневных крыс количество активной каспазы-3 после действия ЛПС повышалось также примерно вдвое. Таким образом, активация апоптоза в почечной ткани при сепсис-подобной эндотоксемии была примерно одинаковой у новорожденных и взрослых крыс. Другим маркером развития острого почечного повреждения может служить уровень антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Через 24 часа после введения ЛПС количество PCNA в почке взрослых крыс увеличивается. Однако, у новорожденных крыс наблюдается обратная ситуация. Поскольку почка крыс в возрасте до 7 дней еще продолжает развитие, уровень PCNA в ней исходно повышен по сравнению с почкой взрослых животных. В то же время индукция системного воспаления с помощью ЛПС приводила к снижению количества PCNA, то есть, наоборот, понижению регенерации ткани. При анализе развития фиброза в почках крыс, подвергшихся действию ЛПС, было обнаружено, что у взрослых крыс количество гладкомышечного актина через 2 месяца после инъекции ЛПС значительно возрастало, то есть наблюдалось выраженное увеличение фиброзной ткани по сравнению с контролем. У крыс, получивших ЛПС в возрасте 3 дней, количество гладкомышечного актина через два месяца после ОПП возрастало не столь сильно, то есть фибротические изменения были менее выражены. Поскольку нами ранее неоднократно была показана ведущая роль окислительного стресса и дисфункции митохондрий в развитии различных острых почечных патологий, то в данной работе мы оценили активность ММП-2 и ММП-9 в цитоплазме и митохондриях клеток почки на моделях острых почечных патологий. Было показано значительное повышение количества ММП-2 и -9 в клетках почки при остром пиелонефрите, а также появление митохондриальной изоформы ММП-2, имеющей более низкую молекулярную массу, но также обладающей протеолитической активностью. Обнаружена прямая зависимость между количеством ММП-2 и -9 в клетках почки и выраженностью воспаления при пиелонефрите. Очевидно, что появление в митохондриях почек активной протеазы может оказывать влияние как на их функционирование, так и в целом на судьбу почечных клеток при развитии данной патологии. В части анализа клинического материала были собраны образцы мочи от пациентов нефрологического профиля из отделения хирургии новорожденных. Выполнен вестерн-блоттинг образцов мочи для 8 пациентов отделения хирургии новорожденных с антителами на два биомаркера почечного повреждения: Kim-1 и NGAL. У четырех пациентов отмечен повышенный уровень NGAL как минимум в один из дней взятия образцов, а у одного пациента отмечен повышенный уровень KIM-1 в один день. Для исследования динамики изменения параметров крови у пациентов была проанализирована широкая панель показателей биохимического и гематологического анализов, в том числе уровень мочевины и креатинина, уровень печеночных ферментов АСТ и АЛТ, концентрация С-реактивного белка в сыворотке крови, а также абсолютное число лейкоцитов в крови и относительное количество сегментоядерных клеток. Проведено сравнение изменения новых биомаркеров и классических гематологических и биохимических параметров крови. Отмечена корреляция повышения уровня NGAL в моче с высоким уровнем С-реактивного белка в крови (превышение нормы в 3-10 раз). Все образцы мочи, для которых отмечено значимое увеличение количества Kim-1 и NGAL, сохранены в глубокой заморозке и будут далее с помощью вестерн-блоттинга и ИФА исследованы на другие биомаркеры почечного повреждения, такие как L-FABP, цистатин С, IL-18.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В модельной системе исследована клиническая ситуация лечения новорожденных антибиотиками во время бактериальной инфекции, приводящей к сепсису. Модель включает введение липополисахарида (ЛПС), вызывающего выраженный системный воспалительный ответ, и антибиотика гентамицина, активно применяемого в клинической практике. Сначала были проведены эксперименты по анализу повреждающего воздействия на почки каждого из веществ отдельно. Было обнаружено, что однократное введение новорожденным крысам гентамицина в дозах до 50-100 мг/кг, а также ЛПС в дозе 2 мг/кг не вызывает выраженного почечного повреждения или дисфункции. Далее была подобрана схема последовательного введения (гентамицин через 24 часа после ЛПС), при которой наблюдалось повреждающее воздействие на почки. Повреждающее воздействие оценивалось с помощью ряда маркеров. Адаптивный ответ ткани на повреждение оценивался по анализу экспрессии ключевых белков. Регенеративный ответ анализировали с помощью вестерн блоттинга по экспрессии основного маркера пролиферации клеток PCNA в ткани почек через 24 часа после инъекции гентамицина. Активность апоптоза оценивалась по количеству активированной каспазы-3 в ткани почки также методом вестерн блоттинга в тех же образцах. Было обнаружено, что подобная схема введения приводила к значимому повышению концентрации мочевины в крови животных (19±3 мМ) по сравнению с контрольными животными (6±1 мМ). Совместное введение ЛПС и гентамицина вызывало появление маркера повреждения почек NGAL в моче у 90% животных. Таким образом, мы выявили тенденции к усилению ОПП при совместном действии ЛПС и антибиотика, однако, эти эффекты не были достаточно выраженными. В этой связи начаты работы по исследованию влияния сочетанного воздействия ЛПС и гентамицина при укорочении временного интервала между введениями этих двух веществ, что может отражать клиническую картину немедленного назначения антибиотикотерапии при первых признаках сепсиса. Эти работы запланированы на следующий год. Параллельно велась комплементарная работа по анализу влияния антибиотической терапии на клиническом материале у детей с потенциальной опасностью нефропатий. Для всех пациентов определены концентрации в крови креатинина, мочевины, С-реактивного белка, аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), калия, лейкоцитов, ряд клинических параметров крови. С помощью твердофазного иммуноферментного анализа и вестерн блоттинга содержание NGAL в моче было определено количественно и качественно. Проведен глубокий статистический анализ клинических данных, включавший в себя парное сравнение со значениями данного параметра при назначении антибиотика, а также поиск корреляций между параметрами. Для ряда антибиотиков, которые назначали большему количеству пациентов, удалось обнаружить статистически достоверные корреляции. Например, пациенты, которым был назначен антибиотик зивокс, имели статистически значимое падение концентрации креатинина в крови. У пациентов, получавших веро-нетилмицин, наблюдалось значимое падение концентрации С-реактивного белка в крови. Помимо описанной выше модели совместной токсичности ЛПС и гентамицина, были исследованы эффекты цисплатин-индуцированного почечного повреждения. Исследование действия цисплатина на нескольких моделях ОПП позволяет более точно определять механизмы, лежащие в основе повреждения почечной ткани. В сыворотке крови животных значимо росла концентрация маркеров дисфункции почек креатинина и мочевины, причем у животных с пролонгированным введением цисплатина увеличение было более значительным: концентрация мочевины в крови у животных с хроническим введением цисплатина была 67±10 мМ, у животных с однократным введением – 35±5 мМ по сравнению со значениями для контрольных животных 5±2 мМ. Аналогичное увеличение показано для креатинина. Также с помощью вестерн блоттинга было обнаружено, что оба типа повреждения ведут к значимому увеличению количества основного маркера пролиферации в ткани почки (PCNA): более чем в 6 раз при однократном остром введении цисплатина и в 5 раз при хроническом введении по сравнению с контролем. Токсический эффект цисплатина также оценивался на первичной культуре эпителия почечных канальцев с помощью МТТ-теста. Показано, что даже при самых небольших концентрациях (6,25 мкМ) цисплатин цитотоксичен для клеток почечных канальцев, гибнет около 8-10% клеток. Заметный спад выживаемости клеток начинается от 12.5 мкМ (гибель 15% клеток) и далее – 35-40% гибели при 25 мкМ цисплатина, до 60-70% при 50 и 100 мкМ цисплатина в среде. Кроме того, мы предприняли попытку оценить изменение регенеративного потенциала почки с помощью использования трансгенных животных, несущих флуоресцентный белок GFP под нестиновым промотером. В связи с этим трансгенные мыши, несущие ген GFP под промотером нестина, подвергались однократному внутрибрюшинному введению цисплатина в дозе 15 мг/кг. В исследовании мы показали, что достаточное большое количество клеток в почке в норме экспрессирует нестин. Кроме подоцитов, которые экспрессируют нестин постоянно, данный маркер обнаруживался в клетках сосочка и кортико-медуллярной зоне, в которой располагаются S3-сегменты проксимальных канальцев. Расположение GFP-нестиновых клеток может соответствовать резидентным прогениторным клеткам почки. Однако, требуются дополнительные исследования для точного доказательства, что данные клетки обладают прогениторным фенотипом. В ходе экспериментов было обнаружено, что количество PCNA в ткани почки увеличивается постепенно в течение трех суток после введения цисплатина, причем более выражено его повышение в области коркового вещества почки. Однако, через 72 часа после введения цисплатина PCNA начинает также обнаруживаться в мозговом веществе. Повышение пролиферативной активности в ткани почки указывает на запуск регенеративных процессов. Есть также тенденция к увеличению GFP в почках трансгенных животных, что может означать пролиферацию данных клеток. Для более детального понимания механизмов почечного повреждения и регенерации были исследованы процессы аутофагии в ткани почки. Активация данного процесса после повреждения очень важна для последующей регенерации. В качестве активатора аутофагии в данном проекте был использован рапамицин. Мы проводили эксперименты как на in vivo на молодых крысах, так и in vitro на первичной культуре эпителия канальцев. Параллельно все эксперименты были проведены на фоне цисплатин-индуцированного повреждения. Тяжесть ишемического и цисплатин-индуцированного повреждения без и на фоне рапамицина оценивали по стандартной панели маркеров (NGAL, L-FABP, креатинин, мочевина). Было показано, что рапамицин в концентрации 1 мг/кг действительно ингибирует mTOR. Это было подтверждено по снижению относительного содержания фосфорилированной формы p70S6K к ее тотальной форме в гомогенатах почек крыс, получавших рапамицин. Значимое снижение достигалось через 24 часа после введения препарата. Однако, несмотря на ингибирование mTOR, нам не удалось зарегистрировать снижение тяжести ишемического и цисплатин-индуцированного почечного повреждения. С помощью прибора RTCA iCelligence было показано, что в культуре рапамицин обладает антипролиферативными свойствами, замедляя рост клеток. Инкубация в течение 24 часов приводила к 4-х кратному снижению пролиферации клеток. Однако, как и в случае экспериментов на животных, не было обнаружено защитных свойств рапамицина. И на модели КГД, и на модели цисплатиновой токсичности рапамицин только ухудшал состояние клеток. Было показано, что в культуре рапамицин также должным образом не активировал образование аутофагосом, что отслеживали по окрашиванию клеток красителем Cyto-ID. В качестве ингибитора аутофагии был исследован хлорохин. Хорошо известно, что хлорохин способен изменять рН в лизосомах, тем самым препятствуя лизосомальной деградации содержимого аутофагосом. Были протестированы защитные эффекты хлорохина как in vitro на первичной культуре эпителия почечных канальцев, так и in vivo на молодых крысах. Хлорохин не оказывал ни антипролиферативного, ни защитного действия на первичную культуру клеток при КГД. Важной целью проекта является не только выявление механизмов острого почечного повреждения, но и разработка методов воздействия на данное патологическое состояние. Воспаление представляет собой один из главных патогенетических механизмов развития повреждения. В связи с этим мы исследовали возможность модуляции воспаления как одной из нефропротекторных стратегий. В качестве фармакологического агента был выбран ингибитор циклооксигеназы-2 (ЦОГ) нимесулид. В гомогенатах почек крыс после ишемии/реперфузии, получавших или не получавших нимесулид, были изучены различные маркеры регенерации и воспаления. Было показано, что тяжесть почечной дисфункции после ишемического почечного повреждения снижается при воздействии нимесулида в концентрации 10 мг/кг при введении в течение 7 суток до повреждения. Концентрация креатинина снижалась на 30% (220±20 мкМ) по сравнению с крысами, не получавшими нимесулид (350±50 мкМ). В моче крыс, получавших нимесулид, также было обнаружено на 80% меньше количества маркера повреждения почек белка NGAL, чем у обычных крыс после повреждения, а также уменьшение маркера L-FABP Другим фактором, влияющим на воспаление, является микробиота. Известно, что состав микробиоты влияет на воспалительный ответ при разных патологиях, что в свою очередь может оказывать заметный эффект на их тяжесть. В качестве одного из направлений мы исследовали, оказывает ли нефропротекторный эффект прием антибиотиков широкого спектра. Было выявлено, что функциональное повреждение почек у животных, получавших антибиотики, выражено менее значительно: уровень креатинина был в плазме крови был в 2,5 раза меньше, а мочевины почти в 3 раза ниже. С помощью вестерн блоттинга была обнаружена тенденция к уменьшению количества активированной каспазы 3 после ишемии/реперфузии в ткани почек крыс, получавших антибиотики, по сравнению с животными, не получавшими антибиотики до ишемии, на 40%. Также обнаружены тенденции к уменьшению маркеров макрофагов F4/80 и Iba-1 в ткани почек крыс, получавших антибиотики, в 2 и 2,5 раза, соответственно. Таким образом, при определенной совокупности антибиотиков и их концентрации, а также времени приема существует тенденция к защитному действию от ишемического ОПП. Из литературных данных было известно, что ряд работ обсуждает влияние микробиотного состава на тяжесть развития хронической почечной недостаточности и уремии. Но никто не проводил всесторонний анализ возможности синтеза микробиотой уремических токсинов – веществ, концентрация которых растет в крови при отказе почек, и которые в конечном итоге приводят к гибели организма. Проведен биоинформатический анализ возможности синтеза уремических токсинов в митохондриях, а также влияния уремических токсинов на митохондрии. Мы обнаружили, что 20 из 140 уремических токсинов потенциально могут быть синтезированы в митохондриях или их синтез зависит от активности митохондриальных ферментов. Кроме того, мы проанализировали возможность повреждения митохондрий уремическими токсинами. Например, 4-HNE нарушает продукцию АТФ и разобщает митохондрии, помимо других своих негативных эффектов на организм. Индоксил сульфат и п-крезол вызывают усиление генерации активных форм кислорода, разобщают митохондрии, приводят к уменьшению количества митохондрий в клетке и нарушают дыхание. Таким образом была продемонстрирована петля с положительной обратной связью: митохондрии являются источником ряда уремических токсинов во время хронической почечной недостаточности, но также являются мишенью ряда токсинов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Одним из основных направлений в отчетном периоде стал более глубокий анализ механизмов нефропротекторного действия ограничения питания у животных разного возраста. Мы показали, что выраженное повышение толерантности почки к ишемии в ответ на ограничение калорийности питания (ОКП) в течении 4 недель, наблюдается у молодых крыс и отсутствует у старых. Ранее мы считали основной причиной неэффективность активации аутофагии и митофагии. В нынешней работе мы попытались усилить индукцию аутофагии за счет удлинения периода ограничения питания у старых крыс, и параллельно исследовали ряд других механизмов, помимо аутофагии, которые могут быть ответственны за устойчивость почек к ишемии. Мы показали, что почка старых крыс даже после 8-недельного ограничения питания остается более чувствительной к ишемическому повреждению, чем почка молодых животных после 4-недель ограничения. В то же время по некоторым маркерам острого почечного повреждения (ОПП) нам удалось добиться проявления признаков нефропротекции у старых животных. Одним из факторов, обусловливающих большую чувствительность старой почки к ишемии, может являться сниженный регенеративный потенциал, поскольку пролиферация в ответ на повреждение была выражена у старых крыс в несколько раз слабее, чем у молодых. Но как мы показали, ограничение питания не влияет на интенсивность пролиферации даже у молодых крыс, поэтому не может служить фактором усиления устойчивости почки к ОПП. Увеличение продолжительности ОКП до 8 недель у старых крыс не привело к значимой активации аутофагии в почке: соотношения LC3 II/LC3 I значимо повышалось только у молодых крыс, снижение уровня p62/SQSTM1 тоже наблюдалось только при ограничении питания молодых, но не старых крыс. Количество лизосомального маркера LAMP1 и лизосом-специфического окрашивания в витальных срезах значительно увеличивалось при ОКП у молодых животных, а у старых это повышение было значительно слабее. В то же время следует отметить большую гетерогенность по данному параметру: отдельные старые животные демонстрировали выраженные положительные изменения, тогда как другие не отвечали на ограничение питания. В то же время на уровне митохондрий нам удалось добиться значимого улучшения в почках не только у молодых, но и у старых животных. Так, ОКП приводило к увеличению антиапоптотического белка Bcl-xL в клетках почки, и этот эффект наблюдался и у старых крыс. Анализ ультраструктуры митохондрий также показал наличие выраженных положительных изменений у обеих групп крыс, подвергшихся ограничению питания. Эти изменения коррелировали с повышением митохондриального потенциала в канальцевых клетках. Таким образом, за меньшую устойчивость почки к ишемии у старых животных отвечает несколько относительно независимых механизмов, на часть из которых можно оказать воздействие более длительными периодами ограничения питания. Однако, суммарный защитный эффект ОКП у старых животных остается менее выраженным, чем у молодых. Вторым направлением работы был анализ взаимодействия кишечной микробиоты с организмом хозяина в ключе почечных функций и нефропротекции. В данном исследовании был выявлен ряд интересных закономерностей, свидетельствующих о значительном вкладе бактерий в развитие уремии. В ходе анализа мы взяли за основу список уремических токсинов европейского консорциума EUTox, соотнесли его с базой человеческого метаболома и проанализировали по базе данных KEGG потенциальные пути синтеза всех уремических токсинов. Затем, соотнесли список генов бактерий микробиома человека и список ферментов, способных катализировать синтез уремических токсинов, исключили из рассмотрения те уремические токсины, гены для синтеза которых имеются и в геноме человека. В результате этой работы мы идентифицировали 4 уремических токсина, гены для синтеза которых отсутствуют в геноме человека, но имеются у человеческой микробиоты: фенол, маннитол, триметиламин-N-оксид и псевдоуридин. В человеческом организме также отсутствуют ферменты, способные метаболизировать эти соединения. Таким образом, полученный список соединений представляет собой уремические токсины, которые потенциально могут синтезироваться бактериями кишечника, но не способны синтезироваться в организме человека. Хотя мы не имели возможности проверить выявленные взаимосвязи микробиоты и синтеза уремических токсинов на клиническом материале, тем не менее была осуществлена попытка транслировать полученные закономерности на экспериментальную уремию, вызванную ОПП. Для этого у крыс определяли видовой состав микробиоты кала и соотносили наличие определенных таксонов бактерий с тяжестью ОПП, а также с наличием ряда метаболитов в крови, характеризующих повреждение или устойчивость почек. В этом исследовании, используя композиционно-ориентированный подход к анализу данных микробиома, мы обнаружили несколько ассоциаций между микробиомом и уровнем мочевины или креатинина после И/Р. Из наших результатов можно сделать вывод, что Rothia и Staphylococcus, связаны с высокой тяжестью повреждения почек, т. е. они демонстрируют заметную положительную корреляцию с повышением концентрации креатинина или мочевины и могут быть охарактеризованы как «нефропатологические». Наоборот, преобладание в кишечном биоценозе Prevotella copri, Faecalibacterium prausnitzii и Coprococcus eutactus было ассоциировано с низким уровнем креатинина и мочевины, то есть эти таксоны могут быть охарактеризованы как «нефропротекторные». Из нашего анализа микробиома и метаболома мы можем также предложить некоторые способы, с помощью которых бактерии влияют на повреждение почек. Например, было показано, что бактерии, предположительно играющие в наших экспериментах “нефропротекторную” роль (Prevotella copri, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus eutactus), продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты, представленные в основном ацетатом, пропионатом и бутиратом. Еще одной запланированной работой стал анализ повреждения и регенерации почки под действием цисплатина. Мы сосредоточились на сравнении пролиферативного потенциала и регенерации почек у старых и молодых животных. Наши эксперименты показали, что культуры эпителия почечных канальцев, полученные из почек молодых мышей, характеризовались более быстрой скоростью роста, чем таковые от старых мышей. Чтобы выявить роль прогениторных клеток в повышенном пролиферативном потенциале молодой почки были использованы культуры почечного эпителия трансгенных мышей, несущих репортерный флуоресцентный белок, который экспрессируется в стволовых или прогениторных клетках. Эксперименты с такими клетками показали, что культура от молодой мыши имеет более высокий уровень флуоресценции GFP, начиная со 2 дня in vitro, по сравнению с культурой от старой мыши. Кроме того, в культуре молодой мыши наблюдалось более быстрое накопление GFP в клетках. Таким образом, наблюдаемые явления могут говорить о том, что в почках молодых мышей исходно содержится большее число прогениторных клеток, либо о том, что дедифференцировка эпителиоцитов и приобретение ими стволового фенотипа эффективнее протекает в молодой почке. Тем не менее, требуются дополнительные эксперименты, которые покажут, достигается ли это исключительно за счет изначально более высокого содержания у молодых мышей в канальцах GFP-положительных клеток, или же пролиферация GFP-положительных клеток в условиях повреждения идет с большей скоростью, чем у эпителиоцитов, не экспрессирующих нестин. Следуя исходной логике проекта, молекулярные механизмы ОПП в течение всего времени выполнения проекта оценивались при нескольких типах индукции повреждения, поэтому и на данном этапе третьим исследуемым типом патологического воздействия на почку стала нефропатия, связанная с системным воспалением и сепсисом. Исследование проводилось как на клиническом материале, так и в экспериментах на крысах. В экспериментальном исследовании мы проверили предположение, что лечение сепсиса антибиотиками может усиливать развитие ОПП за счет нефротоксического действия. На предыдущих этапах выполнения проекта мы показали, что моделирование сепсиса путем введения ЛПС в дозе 4 мг/кг вызывает выраженное ОПП у новорожденных крыс, которое детектируется по повышенному содержанию мочевины в крови и NGAL в моче животных. Аналогично, у пациентов наличие признаков сепсиса коррелировало с появлением маркеров ОПП. Поскольку основным лечением сепсиса является антибиотикотерапия, мы провели исследование совместного эффекта антибиотиков и системного воспаления. При сочетанном действии ЛПС 2 мг/кг и гентамицина в дозе 150 мг/кг наблюдается статистически значимое повышение концентрации мочевины в крови и достоверное увеличение уровня белков NGAL и KIM-1 в моче по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о развитии выраженного ОПП. Однако, при совместном действии ЛПС и гентамицина не было выявлено ухудшения пролиферативного потенциала в ткани почки, в отличие от действия чистого эндотоксина. Также не наблюдалось значимого изменения содержания активированной каспазы-3. Таким образом, развивающееся при совместном действии ЛПС и гентамицина ОПП сравнимо с эффектом чистого ЛПС в дозе 2 мг/кг, то есть гентамицин не усугублял развивающееся после ЛПС повреждение. Более того, по ряду признаков мы наблюдаем тенденцию к ослаблению ОПП, то есть вместо ожидаемого повышения повреждения почки, происходит его уменьшение. Отсутствие синергетического нефротоксического действия антибиотиков и ЛПС, и даже наличие признаков нефропротекторного действия может служить обнаруженное нами влияние микробиоты кишечника на тяжесть ОПП. Поскольку антибиотик подавляет рост многих бактерий, это может снижать тяжесть ОПП, вызванного системным воспалением. Схожие результаты были получены при анализе клинического материала. Выявлена прямая корреляция повышенного уровня NGAL в моче с высоким уровнем С-реактивного белка в сыворотке крови, то есть развитием системного воспаления и сепсиса. У части этих пациентов наблюдалось повышение и других маркеров ОПП: уровня IL-18, KIM-1, GST-π и кластерина в моче детей с признаками инфекции. В то же время, не было отмечено корреляции появления или повышения уровня маркеров ОПП с терапией различными антибиотиками (суммарно в схемах лечения применялось 5 основных антибиотиков), в том числе у пациентов, не имевших признаков сепсиса. Таким образом, развитие ОПП у пациентов коррелировало с системным воспалением и не коррелировало с применением антибиотиков.