КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-14-00375

НазваниеМолекулярно-биофизические аспекты олигомеризации мембранных доменов рецепторов, определяющие клеточную сигнализацию в норме и онкогенезе

РуководительЕфремов Роман Гербертович, Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2018 - 2020  , продлен на 2021 - 2022. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словатрансмембранный домен, клеточная мембрана, тирозинкиназа, липидный бислой, оценка свободной энергии, белок-белковые взаимодействия, молекулярная динамика, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, онкогенные мутации

Код ГРНТИ34.15.17


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Трансмембранные (ТМ) домены мембранных белков и, в первую очередь, рецепторов играют важную роль в работе клеточных мембран. Они участвуют в процессах сигнализации и транспорта веществ через мембрану, а также обеспечивают формирование пространственной структуры мембранных белков. В большинстве случаев данные ТМ-домены представлены одной или несколькими альфа-спиралями, пронизывающими мембрану. Битопические (т. е. имеющие одну спираль в ТМ-домене) рецепторы, такие как рецепторные тирозинкиназы (РТК), рецепторы цитокинов и другие, представляют повышенный интерес для биомедицинских исследований и приложений, поскольку их дисфункция приводит к серьезным патологиям, в том числе раку и диабету. Несмотря на активное исследование упомянутых мембранных рецепторов с помощью компьютерного моделирования и биофизических методов, молекулярные механизмы работы таких белков в норме и в патологии остаются неясными. В частности, предполагается существование механизма как лиганд-индуцированной, так и спонтанной активации данных сигнальных систем в патологии. Работы последних лет показывают, что для РТК и рецепторов цитокинов конфигурация (взаимное расположение в пространстве) ТМ-доменов непосредственно связана с активацией этих молекул. В то же время нет данных о непосредственной взаимосвязи перестроек в различных частях молекул рецепторов. Важным является вопрос о роли липидной мембраны в передаче сигнала и о взаимном влиянии в системе белок-мембрана. В структурной биологии часто используют редукционистский подход, который заключается в изучении молекул рецепторов по частям: отдельно внеклеточных и киназных доменов в водном окружении и отдельно - ТМ доменов в мембраноподобной среде. Компьютерное моделирование является необходимым дополнением к экспериментальным подходам в области изучения мембранных белков, поскольку позволяет выявить динамические взаимосвязи между различными частями молекулы рецептора и липидным окружением. Настоящий проект нацелен на всестороннее изучение димеризации мембранных белков в липидном окружении. В первую очередь, будет проверена гипотеза о потенциальном участии липидного бислоя в передаче сигнала рецепторными тирозинкиназами, выдвинутая недавно авторами проекта на основании изучения модельных систем. Ранее мембрану рассматривали как инертную среду, в которой ТМ домены белков способны свободно двигаться. Однако, в отличие от гомогенного растворителя, липидная компонента клеточной мембраны – высокогетерогенная, самоорганизующаяся динамическая система. Поэтому, помимо средних термодинамических параметров димеризации ТМ-доменов необходимо знать их динамические свойства. Такими свойствами могут являться характеристическая динамика ТМ спиралей и молекул водно-липидного окружения, геометрические и временные параметры неоднородностей, возникающих в липидной мембране вследствие влияния белка. Полученные ранее авторами данные о периодическом характере движений ТМ-спиралей и связанных с ними липидов указывают на потенциальную возможность аллостерической передачи сигнала внутри молекулы рецептора с участием липидов. Однако для поиска механизмов влияния на онкогенные формы РТК необходимо приблизиться к пониманию механизма взаимодействия между разными частями рецептора на атомарном уровне. Используемый в настоящем Проекте мультидисциплинарный подход позволит объединить все преимущества современных методов компьютерного моделирования биомолекул и структурной биологии для решения задачи детального описания белок-белковых взаимодействий в мембранах, влияния точечных онкогенных мутаций на равновесие между различными состояниями сигнальных систем клетки, а также поиска способов направленного влияния на патологические состояния организма с помощью воздействия на ТМ-домены целевых РТК и других рецепторов с помощью "пептидов-перехватчиков" и модуляции локальных свойств липидного окружения. В качестве объектов исследования выбраны рецепторы тромбоцитарного фактора роста PDGFRa, семейство рецепторов эпидерамльного фактора роста ErbB, рецептор эндотелиального фактора роста сосудов а также нейраминидаза-1 человека, рецепторы инсулина и инсулин-подобного фактора роста IGF1R. Все эти мембранные белки объединяет то, что они могут быть вовлечены в процесс онкогенеза при возникновении точечных мутаций в их генах. Предполагается, что результатом работы будет детальное описание механизмов спираль-спиральных взаимодействий в мембранах с учётом активной роли мембранного окружения, будет расшифрован механизм работы мутантных онкогенных форм данных белков, а также предложены несколько "пептидов-перехватчиков", являющихся прототипами перспективных селективных модуляторов активности онкогенных форм данных РТК. Важнейшей особенностью настоящего Проекта является включение в план работ целого комплекса уникальных биофизических экспериментов (оптическая и ЯМР-спектроскопия, белковая инженерия и пр.), с помощью которых будут получены структурно-динамические данные для ряда ТМ доменов РТК дикого типа и мутантных форм. Как показали предыдущие совместные исследования авторов (см. список публикаций) – сотрудников двух лабораторий Отдела структурной биологии ИБХ РАН, только применение взаимодополняющего комплексного подхода, сочетающего новейшие экспериментальные и вычислительные методики, позволяет получить «прорывные» результаты мирового уровня. Именно эта стратегия исследований будет применена в данном Проекте.

Ожидаемые результаты
Настоящий проект сочетает в себе применение современных методов многомасштабного атомистического моделирования поведения биомолекул — сигнальных рецепторов в липидных мембранах — и биофизических подходов к определению пространственной структуры данных белков in vitro. Таким образом, с помощью компьютерного моделирования будет осуществлён перебор большого числа возможных конформаций димерных состояний для широкого набора мутантных форм исследуемых РТК и других рецепторов, будут выбраны наиболее перспективные из них для изучения методами структурной биологии. Использование в работе метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) позволит подтвердить правильность предсказания димерных структур, а также выявить дополнительные структурные детерминанты, определяющие белок-белковые взаимодействия в мембранах, в частности, для онкогенных форм рецепторов. Данные методы широко применяются для решения подобных задач в настоящее время и хорошо себя зарекомендовали в исследовании нативных форм димеров РТК. Основным результатом настоящей работы станет набор перспективных ТМ пептидов, способных модулировать димеризацию целевых мембранных белков (онкогенных форм рецепторов ErbB1, PDGFRa, VEGFR2; нейраминидазы-1 и др.) путём непосредственного воздействия на их ТМ домены, либо опосредованного влияния на свойства мембранного окружения. Возможность создания таких соединений показана ранее в ряде экспериментальных работ, однако механизм их действия остаётся непонятным. Настоящая работа призвана решить данный вопрос путём сопоставления экспериментальных данных с теоретическими моделями. Также предполагается решить задачу построения полноразмерных моделей рецепторов РТК и других мембранных белков с применением многомасштабного атомистического моделирования, молекулярной динамики (МД) с различной степенью детализации и длиной траекторий порядка нескольких микросекунд. Полученные данные создадут основу для выявления путей аллостерической коммуникации внутри молекул рецептора и роли ТМ-доменов в передаче сигнала и активации в нативном состоянии, а также при внесении онкогенных мутаций. Полученные в результате динамические модели полноразмерных рецепторов IR, IGF1R, ErbB1, PDGFRa и др. позволят детально понять механизм работы этих сигнальных систем на атомарном уровне, что в дальнейшем может быть использовано для рационального дизайна фармакологических средств, нацеленных на эти рецепторы. В настоящем проекте будет установлено влияние конфигурации ТМ доменов на характер возмущений липидной мембраны различного состава. Будут рассмотрены конформации ТМ-димеров мембранных рецепторов с разными интерфейсами димеризации, соответствующие активным/неактивным состояниям и т. д. Это позволит учитывать роль мембранного окружения при конструировании модуляторов активности исследуемых белков, в том числе, и пептидов-перехватчиков. Применение современных методов структурной биологии и биофизики для экспериментального подтверждения теоретических моделей позволит авторам претендовать на ведущие позиции в области исследования димеризации мембранных рецепторов (в первую очередь, РТК), а также публиковать результаты работ в высокорейтинговых научных журналах широкого профиля. Исследованные в ходе проекта пептидные модуляторы активности указанных мембранных рецепторов создадут основу для новейших биомедицинских приложений, направленных на эффективную терапию социально-значимых заболеваний, таких как рак и диабет.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
С помощью комплексного биофизического подхода, сочетающего использование экспериментальных методов (биоинженерия, спектроскопия ЯМР и кругового дихроизма, динамическоле светорассеяние) и компьютерного молекулярного моделирования, исследованы структурно-динамические свойства трансмембранных (ТМ) альфа-спиральных доменов ряда рецепторов сигнальных систем клетки и их аналогов, содержащих точечные проонкогенные мутации. Объекты исследования – рецепторные тирозинкиназы (РТК): PDGFRA (рецептор тромбоцитарного фактора роста), VEGFR2 (рецептор эндотелиального фактора роста сосудов), рецептор инсулина (IR), рецепторы эпидермального фактора роста из семейства ErbB, а также мембрано-связанная нейраминидаза-1 и модельные ТМ пептиды. За отчетный период получены следующие основные результаты: - Показана склонность к олигомеризации (прежде всего, формирование тетрамеров) ТМ фрагментов мутантной формы V536E рецептора PDGFRA, отсутствующая в белке дикого типа. Это может играть потенциальную роль в спонтанной активации рецептора и представляет возможный новый и малоизученный механизм активации РТК, вызванной онкогенными мутациями в ТМ домене. В соответствии с полученными экспериментальными данными была предложена пространственная модель ТМ тетрамера V536E PDGFRA, согласно которой «ядро» тетрамера соответствует правозакрученному димеру по интерфейсу II, а две другие спирали периферически взаимодействуют с ядром и образуют два левозакрученных димера по интерфейсу I с контактами между мутированными остатками E536. Проведены расчеты 200 нс МД для полученной конфигурации ТМ тетрамеров V535E и дикого типа PDGFRA в полноатомном бислое ПОФХ. Показано, что мутантные ТМ альфа-спиральные пептиды формируют более компактный тетрамер по сравнению с белком дикого типа, в первую очередь - за счет стабильных контактов остатков E536-E536. Мутантная форма ТМ тетрамера также обладает меньшей подвижностью по сравнению тетрамером, формируемым ТМ спиралями белка дикого типа. Результаты опубликованы в статье, вышедшей в журнале BBA - General Subjects, 2018 (WOS, Q1). - В рамках изучения взаимного влияния трансмембранных фрагментов белков и их мембранного окружения исследован ряд фундаментальных вопросов. Так, показано, что длина ацильных цепей липидов и их насыщенность могут оказывать влияние на структуру и стабильность мембранных рецепторов, однако это справедливо не для всех систем. В частности, для описания стабильности димера рецептора ErbB4 важным оказывается баланс между белок-белковыми взаимодействиями и влиянием окружения, тогда как для ТМ доменов гликофорина А, рецептора ErbB1 и ряда модельных пептидов влияние типа ацильных цепей на конформацию олигомеров и сайты белок-липидного взаимодействия мало. Изучено возмущение мембраны, вызванное ТМ димерами PDGFRA дикого типа и его онкогенного ТМ мутанта V536E. Установлена взаимосвязь между геометрией ТМ димера и характером его поверхности, экспонированной в бислой, и наблюдаемым паттерном взаимодействий с липидами. Наиболее выраженные участки взаимодействия с липидами на поверхности ТМ спиралей наблюдаются в области полярных остатков (в первую очередь, S541). При этом правозакрученная конформация ТМ димера дикого типа «замораживает» наибольшее число липидных молекул. Энтропийный эффект, связанный с замораживанием липидов, оценивали методом квазигармонического приближения с последующим картированием полученных значений конформационной энтропии в плоскости бислоя. Наиболее значительное понижение энтропии липидного окружения наблюдается для правозакрученной конформации ТМ димера дикого типа. Обнаружен асимметричный характер возмущения в мембране, вызванного ТМ димерами: для ближнего липидного окружения наблюдается систематически более низкие значения конформационной энтропии в области “внешнего” (N-концевой участок ТМ спирали) монослоя, по сравнению со “внутренним” монослоем (С-концевой участок ТМ спирали). Поскольку асимметрия мембранного ответа может вносить непосредственный вклад в трансмембранную передачу сигнала, наблюдаемый феномен требует дальнейшего детального изучения. Результаты опубликованы в статье, вышедшей в журнале BBA - General Subjects, 2018 (WOS, Q1). - Изучение полноразмерных (или близких к ним) моделей рецепторов может дать гипотезы о переходе между активными и неактивными состояниями. В ходе работ этапа 2018 г. для рецептора инсулина продемонстрировано наличие шарнирной области во внеклеточном домене, вокруг которой возможно вращение примембранных сегментов, сопровождающееся их сближением. В то же время, поведение отдельных фрагментов молекулы относительно независимо. То есть изучение ряда индивидуальных доменов в таких сложных системах обоснованно и может адекватно описывать поведение системы в целом. Это позволяет рассчитывать на получение в будущем структурных результатов, применимых к полноразмерным мембрано-связанным рецепторам сигнальных клеточных систем. - Для нейраминидазы-1 человека предсказано формирование при димеризации тетрамера парой трансмембранных гетеродимеров ТМ2-ТМ3. Выявлена вероятная конфигурация такого тетрамера и показана его стабильность в модельной мембране. Формирование такой структуры хорошо согласуется с имеющимися в распоряжении авторов экспериментальными данными и, предположительно, обусловливает активность мембранной формы указанного фермента. - Для изучения влияния патогенных мутаций на внутри- и межмолекулярные взаимодействия мембранных рецепторов типа I был проведен поиск по базам данных онкогенных мутаций в рецепторе VEGFR2 из семейства рецепторов эндотелиального фактора роста сосудов организма человека. Для структурно-динамических исследований методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения разработаны генноинженерные конструкции и протоколы очистки рекомбинантных фрагментов (включающих полностью ТМ домен с короткими примембранными участками) рецептора TM-VEGFR2 дикого типа и его проонкогенных мутантных форм с аминокислотными заменами T771R и A772T. С помощью бесклеточной системы экспрессии наработаны количества 15N/13C-изотопно-меченых фрагментов TM-VEGFR2, достаточные для проведения ЯМР-экспериментов. С помощью гетероядерной спектроскопии ЯМР, спектроскопии кругового дихроизма и метода динамического светорассеяния для фрагментов TM-VEGFR2 дикого типа и мутантных форм подтверждено образование ТМ спирали и показана специфическая димеризация в мембрано-подобных супрамолекулярных комплексах в виде детергентных мицелл. Таким образом, на данном этапе проекта были получены ЯМР-образцы ТМ доменов рецептора VEGFR2 дикого типа и его мутантных форм, приемлемые для получения детальной экспериментальной информации о молекулярных механизмах влияния онкогенных мутаций на структурно-динамические свойства и специфическую димеризацию в мембраноподобной среде. Проведены обобщение и систематизация накопленной авторами (в т.ч. и в ходе работ по проекту) информации о роли гидрофобных взаимодействий в белок-мембранных системах. Результаты опубликованы в виде обзорной статьи в журнале Expert Review of Proteomics (WOS, Q2). Показано, что атомистические пространственно-временные характеристики гидрофобных/гидрофильных свойств изучаемых белок-мембранных систем определяют сценарии поведения пептидов на границе раздела вода-мембрана и внутри липидного бислоя. Эти данные необходимы для количественной характеризации параметров «мембранного ответа» при изучении ассоциации ТМ спиральных доменов РТК и других интегральных мембранных белков.

 

Публикации

1. Бершацкий Я.В, Бочарова О.В., Бочаров Э.В., Урбан А.С., Арсеньев А.С. Expression, purification and NMR study of the transmembrane domains of the insulin-like receptor family Biomembranes 2018. International Conference. 01.10.18-05.10.18. Book of Abstracts., С. 174 (год публикации - 2018).

2. Бочаров Э.В., Лесовой Д.М., Минеев К.С., Бочарова О.В., Волынский П.Е., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С. Signal transduction mechanism via transmembrane domains of bitopic receptors studied by high-resolution NMR Biomembranes 2018. International Conference. 01.10.18-05.10.18. Book of Abstracts., С. 176 (год публикации - 2018).

3. Бочаров Э.В., Урбан А.С., Надеждин К.Д., Кузьмичев П.К., Волынский П.Е., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С., Бочарова О.В. Structural insights into initial steps of Alzheimer disease via mutation-induced conformational variability of APP transmembrane domain Biomembranes 2018. International Conference. 01.10.18-05.10.18. Book of Abstracts., С. 177 (год публикации - 2018).

4. Дубовский П.В., Ефремов Р.Г. The role of hydrophobic/hydrophilic balance in the activity of structurally flexible vs. rigid cytolytic polypeptides and analogs developed on their basis Expert Review of Proteomics, V. 15, No. 11, P. 873-886 (год публикации - 2018).

5. Ефремов Р.Г. Технология "Молекулярного портрета" в анализе биомолекулярных взаимодействий Сборник научных трудов V Международной конференции "Постгеном'2018", С. 138 (год публикации - 2018).

6. Замалетдинов М.Ф., Кузнецов А.С., Маурис П., Ефремов Р.Г. Putative role of transmembrane domain dimerization in activation of proteins from the insulin receptor family Biomembranes 2018. International Conference. 01.10.18-05.10.18. Book of Abstracts., С. 381 (год публикации - 2018).

7. Полянский А.А., Бочаров Э.В., Фелге А.И., Кузнецов А.С., Бочарова О.В., Урбан А.С., Арсеньев А.С., Загровик Б., Демоулин Я.Б., Ефремов Р.Г. Atomistic mechanism of the constitutive activation of PDGFRA via its transmembrane domain BBA General Subjects, V. 1863, No. 1, P. 82-95 (год публикации - 2019).

8. Полянский А.А., Кузнецов А.С., Волынский П.Е., Ефремов Р.Г. Proteins and membranes: born to be together. A computational view Biomembranes 2018. International Conference. 01.10.18-05.10.18. Book of Abstracts., С. 89 (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
- Проведено сравнительное исследование динамического поведения трансмембранных (ТМ) доменов и полноразмерного рецептора PDGFRa дикого типа (WT) и его мутантной формы V536E в мономерном, димерном и тетрамерном состояниях. Установлено, что в олигомерных формах белка дикого типа (WT) характер движения ТМ спиралей принципиально отличается от такового в мутанте, причем обнаруженный ранее в димерах динамический эффект полярной онкогенной мутации сохраняется и в олигомерах более высокого порядка. Внесение данной мутации разобщает передачу механического сигнала в мембране от внеклеточных рецепторных доменов к цитоплазматическим киназным, блокируя вращение ТМ спиралей и создавая предпосылки для независимого движения их С-концевых участков. Полученные результаты создают молекулярную основу для рациональной терапии онкологических процессов, обусловленных неправильной работой рецепторных сигнальных белков клетки. - Детально изучено поведение внеклеточных доменов ряда важнейших рецепторных тирозинкиназ человека — рецепторов инсулина (IR), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) и эпидермального фактора роста (EGFR). Показано, что, несмотря на высокое сходство структурной организации, детали их поведения различаются. При этом включение мембраны в полноразмерную модель рецептора затрудняет анализ внутримолекулярных движений. С другой стороны, обнаруженная независимость структурно-динамических параметров ТМ сегмента от остальных доменов дала возможность построения моделей рецепторов на основании результатов исследования поведения их отдельных фрагментов (в частности, ТМ домена). Получена модель ТМ гетеродимера IR и IGF-1R, близкая по геометрии к ранее полученным моделям гомодимеров каждого из рецепторов, но менее выгодная в терминах свободной энергии ассоциации. Данный результат позволяет предположить, что такой гетеродимер может формироваться за счёт взаимодействий внеклеточных доменов, но будет обладать сниженной активностью по сравнению с рецепторами дикого типа. - С помощью комплексного биофизического подхода (ЯМР, оптическая спектроскопия, молекулярное моделирование) изучено влияние патогенной семейной «австралийской» мутации L723P на структурно-динамическое поведение ТМ сегмента белка-предшественника бета-амилоида (APР). Обнаружено, что мутация вызывает локальное разворачивание концевого витка ТМ спирали, в то время как в центре липидной мембраны наблюдается стабилизация данного сегмента. Это и приводит к пагубным последствиям - расщеплению белка АРР ферментами-секретазами и интенсивному накоплению патогенных форм бета-амилоида вокруг нейронов. Результаты исследования раскрывают простой молекулярный механизм развития болезни Альцгеймера, связанный непосредственно с влиянием «австралийской» мутации на структурно-динамические свойства мембранного сегмента белка APР. Примечательно, что возрастное развитие болезни Альцгеймера можно объяснить схожими механизмами, где вместо мутации будут действовать, например, окислительный стресс или определенный липидный состав мембран нейронов, включая избыток холестерина. Результаты этой работы были представлены на сайте МФТИ в виде интервью с с.н.с. Э.В. Бочаровым: https://mipt.ru/news/biofiziki_vyyasnili_kak_avstraliyskaya_mutatsiya_privodit_k_bolezni_altsgeymera - Проведена количественная оценка энергетических вкладов водородных связей между группами всех компонентов системы (белок, липиды, вода) в стабилизацию ТМ сегментов рецепторов и их олигомеров в липидном бислое. На основании рассчитанных методом Монте-Карло в средах различной полярности профилей потенциала средней силы и значений свободной энергии ассоциации ряда модельных соединений, имитирующих комплексы с водородной связью в мембране, установлено, что эти вклады критическим образом зависят от величины локальной диэлектрической проницаемости среды, и, следовательно, от расположения донорно-акцепторной пары относительно центра мембраны.

 

Публикации

1. - Биофизики выяснили, как «Австралийская мутация» приводит к болезни Альцгеймера МФТИ - официальный сайт, новости науки, https://mipt.ru/news/biofiziki_vyyasnili_kak_avstraliyskaya_mutatsiya_privodit_k_bolezni_altsgeymera (год публикации - ).

2. Бочаров Э., Лесовой Д., Павлов К., Бочарова О., Урбан А., Бершацкий Я., Штыкова Э., Волынский П., Ефремов Р., Арсеньев А. Structural basis of the signal transduction via transmembrane domains of type I receptors in norma and pathology FEBS OPEN BIO, v. 9,130 (год публикации - 2019).

3. Бочаров Э.В., Надеждин К.Д., Урбан А.С., Волынский П.Е., Павлов К.В., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С., Бочарова О.В. Familial L723P Mutation Can Shift the Distribution between the Alternative APP Transmembrane Domain Cleavage Cascades by Local Unfolding of the Ε‑Cleavage Site Suggesting a Straightforward Mechanism of Alzheimer’s Disease Pathogenesis ACS Chemical Biology, v. 14, N 7, 1573-1582. (год публикации - 2019).

4. Волынский П.Е., Нольде Д.Е., Захарова Г.С., Палмер Р.А., Тоневицкий А.Г., Ефремов Р.Г Specific refolding pathway of viscumin A chain in membrane-like medium reveals a possible mechanism of toxin entry into cell Scientific Reports, 9,413 (год публикации - 2019).

5. Ефремов Р.Г. Dielectric-dependent strength of interlipid H-bonding in biomembranes: a model case study Journal of Chemical Information and Modeling, v. 59, N 6, 2765-2775 (год публикации - 2019).

6. Ефремов Р.Г. Путешествия в «аномальные зоны» клетки с помощью вычислительной биофизики VI Съезд биофизиков России. Сборник научных трудов, VI Съезд биофизиков России, г. Сочи, Сб. трудов, Т. 1, С. 16. (год публикации - 2019).

7. Замалетдинов М., Кузнецов А., Морис П., Ефремов Р. Dimerization of transmembrane domain of insulin receptor: structure and possible role in activation FEBS OPEN BIO (2019)., v. 9, 262 (год публикации - 2019).

8. Кузнецов А.С., Ефремов Р.Г. Роль мембранного окружения в процессе димеризации трансмембранных сегментов рецепторных тирозинкиназ семейства ERBB VI Съезд биофизиков России, Сборник трудов, VI Съезд биофизиков России, Сб. трудов, Т. 1, С. 165 (год публикации - 2019).

9. Лесовой Д.М., Дубинный М.А., Нольде С.Б., Бочаров Э.В., Арсеньев А.С. Accurate measurement of dipole/dipole cross-correlation contribution to R2 in methylenes and primary amines of uniformly 13C/15N-labeled proteins JOURNAL OF BIOMOLECULAR NMR, v. 73, N 5, 245-260 (год публикации - 2019).

10. Урбан А., Бочаров Э., Надеждин К., Павлов К., Штыкова Э., Тихая Е., Волынский П., Ефремов Р., Арсеньев А., Бочарова О. Conformational variability and intramembrane recognition possibly associated with abnormal cleavage of APP transmembrane domain FEBS OPEN BIO, v.9, 299 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На этапе 2020 г. работу проводили по следующим направлениям: - Изучение механизмов олигомеризации РТК как на уровне их ТМ доменов, так и на расширенных моделях, включающих внемембранные участки – вплоть до полноразмерных рецепторов; Основные результаты: С помощью комплексного – экспериментального и теоретического – молекулярно-биофизического подхода проведено уточнение моделей пространственной структуры димеров рецепторов инсулина (IR) и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R). Сделаны выводы о структурной взаимосвязи между внеклеточным, трансмембранным (ТМ) и киназным доменами и их роли в передаче сигнала. Предполагается, что сближение примембранных участков внеклеточного домена приводит к спонтанной ассоциации ТМ доменов с образованием одного или нескольких промежуточных состояний димера. В то же время, наиболее энергетически выгодное состояние ТМ димера соответствует активному состоянию и приводит к «правильному» контакту внутриклеточных частей молекулы. Разработанные модели ТМ димеров IR и IGF-1R с параллельной упаковкой спиралей позволили объяснить роль двух описанных в литературе точечных мутаций. Впервые предложена модель димера полноразмерного рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFRa) и методом молекулярной динамики (МД) в полноатомном представлении изучены его структурно-динамические характеристики в липидном бислое. Впервые показана возможность аллостерической коммуникации между внеклеточными и внутриклеточными доменами в димере, в которую непосредственный вклад вносит конфигурация димера ТМ доменов. Кроме того, каждой уникальной конформации ТМ димера, по-видимому, соответствует определенное расположение киназных доменов. Таким образом, модулируя димеризацию ТМ спиралей, можно непосредственно влиять на характер взаимодействия между киназными доменами и их активность. Это дает важную теоретическую основу для разработки модуляторов работы рецепторных тирозинкиназ (РТК), действующих на ТМ домены. Рассчитанные в ходе МД коллективные (низкочастотные) движения в модели полноразмерного рецептора PDGFRa проиллюстрированы в видео-файлах, доступных в сети Интернет по ссылкам: 1. https://www.dropbox.com/s/qabw2ik366qyyio/PDGFRA_dimer_MD_300ns_v3.mov?dl=0 2. https://www.dropbox.com/s/b268fhl2peo37ge/PGDFRA_dimer_MD_300ns_v4.mov?dl=0 На примере четырёх РТК - представителей семейства ErbB – методом МД детально охарактеризовано распределение связанных молекул липидов в модельных липидных бислоях. Впервые выявлены интересные закономерности локализации липидов на поверхности ТМ пептидов в мономерном и димерном состояниях. Обнаружена важная роль в белок-липидных взаимодействиях т.н. «гликофоринового» мотива в аминокислотной последовательности ТМ пептидов. Показано, что для димеров с «гликофорин-подобным» интерфейсом димеризации картины пространственного распределения максимумов плотности липидов вблизи области контакта спиралей похожи и, вероятно, определяются геометрией упаковки мономеров белка. Именно для структур с таким типом упаковки характерно формирование чётко выраженных сайтов связывания молекул липидов: они возникают в области самого «гликофоринового» мотива в случае мономеров и вблизи интерфейса в димерах. Такое связывание липидов, предположительно, определяется геометрическими параметрами (рельефом поверхности спирального ТМ домена и параметрами димера). Результаты, полученные для ТМ доменов изученных в рамках проекта РТК (IR, IGF-1R, ErbB, PDGFRa и др.), свидетельствуют о том, что даже в рецепторах одного семейства процессы олигомеризации могут происходить по-разному – в зависимости от тонких особенностей структурно-динамической организации как самих ТМ доменов, так и соседних с ними участков белков и мембранного окружения. Мы полагаем, что подобная «многофакторная» модель функционирования ТМ олигомеров позволяет рецепторам осуществлять свою «тонкую настройку» в сигнальных процессах в клетке. - Исследование фундаментальных аспектов влияния мембранного окружения на процессы белок-белковых взаимодействий – с привлечением данных, полученных на модельных системах, имитирующих клеточные мембраны; Основные результаты: Методами атомистического компьютерного моделирования получены новые результаты о физических механизмах белок-липидных и липид-липдных взаимодействий в модельных мембранах. Предложен оригинальный вычислительный подход к поиску кластеров (нанодоменов) и «потоков» липидов в мембранах на основе одновременного анализа их координат и векторов смещений, что позволило выявлять и описывать различные типы коллективных движений в модельных мембранах. Впервые сделан вывод о том, что липидные нано-домены, несмотря на высокую насыщенность водородными связями (Н-связями), представляют собой нестабильные, быстро флуктуирующие структуры с небольшим временем существования и повышенной степенью гидратации по сравнению с остальными участками мембраны. Молекулы липидов, находящиеся внутри доменов, способны быстро менять своих партнеров по межлипидным Н-связям, способствуя возникновению интенсивных флуктуаций доменной структуры. Важно, что представленная картина характерна для бислоя в состоянии равновесия (согласно критериям, достигнутым в ходе МД), т.е. доступная воде поверхность клеточной мембраны – ее т.н. «молекулярный портрет» - имеет выраженный мозаичный и, что существенно, динамический характер. Параметры такого «динамического молекулярного портрета» сильно зависят от липидного состава бислоя, а также, по-видимому, от условий среды (температура, давление, концентрации ионов и пр.). - Демонстрация возможностей разрабатываемой молекулярно-биофизической технологии путем создания «пептидов-перехватчиков», нацеленных на ТМ домены рецептора, с последующей экспериментальной проверкой действия этих пептидов на их мишени в клетках; Основные результаты: С помощью комплексного – экспериментального и теоретического – молекулярно-биофизического подхода осуществлен рациональный дизайн пептидов, действующих на ТМ домен мембранного белка - нейраминидазы-1 человека (NEU1). Методами компьютерного моделирования провели сравнение структурно-динамических свойств димеров, формируемых ТМ2 сегментом NEU1 с двумя потенциальными «интерферирующими пептидами» IntPep-RKR и mutIntPep-RKR. На основании рассчитанных значений свободной энергии ассоциации ТМ спиралей показали, что первый из них связывается с природным ТМ2 сегментом лучше, чем сам изолированный пептид ТМ2, в то время как замены аминокислот во втором делают его взаимодействие с ТМ2 менее энергетически выгодным. Получен образец N15-меченого рекомбинантного фрагмента R305-R341 NEU1, включающий в себя сегмент ТМ2. С использованием экспериментальных биофизических методов (спектроскопия ЯМР, КД, динамические светорассеяние) для полученного полипептида удалось выявить спонтанную димеризацию в мицеллах. Результаты анализа межмолекулярных контактов и оценки времени перехода мономер-димер говорят в пользу наличия протяжённого полярного интерфейса спираль-спираль, характерного для «слабых» димеров ТМ доменов. Показано, что пептид mutIntPep-RKR, содержащий четыре мутации в аминокислотной последовательности по сравнению с пептидом ТМ2 из белка дикого типа, склонен к формированию гетеродимеров с ТМ2. Важно отметить, что в ходе исследования данные вычислительных и экспериментальных методов взаимно дополняли друг друга, способствуя таким образом значительному повышению точности прогноза. Эффективность «пептидов-перехватчиков» ТМ домена NEU1, разработанных с помощью комбинированного - in silico и экспериментального – подхода, была продемонстрирована в совместной работе с коллегами из университета г. Реймс. Французские коллеги экспериментально подтвердили, что пептиды IntPep-RKR и mutIntPep-RKR заданным образом влияют на димеризацию и сиалидазную активность фермента в клетках. Это – первое в мире доказательство успешно осуществленного молекулярного дизайна пептидного агента, способного управлять работой важнейшего мембранного белка NEU1. Таким образом, предложенный авторами в настоящем проекте «молекулярно-биофизический» подход, нацеленный на модуляцию свойств ТМ доменов рецепторов, был непосредственно апробирован в ходе биологических испытаний in vitro.

 

Публикации

1. Альбрехт К., Кузнецов А.С., Апперт-Коллин А., Дайде З., Каллеварт М., Бершацкий Я.В., Урбан А.С., Бочаров Э.В., Багнар Д., Бауд С., Блейз С., Ромье-Крузе Б. , Ефремов Р.Г., Даучес М., Дюка Л., Гиролт М., Морис П., Беннасроун А. Transmembrane peptides as a new strategy to inhibit neuraminidase-1 activation Frontiers in Cell and Developmental Biology, т. 8, с.611121 (год публикации - 2020).

2. Бочаров Э.В., Лесовой Д.М., Бочарова О.В., Урбан А.С., Бершацкий Ю.В., Волынский П.Е., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С. The role of protein-lipid interactions in the functioning of bitopic membrane proteins Biophysical Journal, 118,3,211a (год публикации - 2020).

3. Кузнецов А.С., Замалетдинов М.Ф., Бершацкий Я.В., Урбан А.С., Бочарова О.В., Беннасрун А., Морис П., Бочаров Э.В., Ефремов Р.Г. Dimeric states of transmembrane domains of insulin and IGF-1R receptors: structures and possible role in activation BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - BIOMEMBRANES, v. 1862, 183417 (год публикации - 2020).

4. Панина И.С., Крылов Н.А., Нольде Д.Е., Ефремов Р.Г., Чугунов А.О. Environmental and dynamic effects explain how nisin captures membrane-bound lipid II Scientific Reports, 10, 8821 (год публикации - 2020).


Возможность практического использования результатов
Главный итог проекта – создание комплексной молекулярно-биофизической платформы для изучения работы сигнальных клеточных рецепторов и других интегральных мембранных белков, преимущественно их трансмембранных (ТМ) доменов. Полученные результаты имеют несомненную значимость и перспективы использования как с точки зрения фундаментальных исследований, так и в плане развития и применения новейших биомедицинских технологий. Перспективы фундаментальных исследований: Учитывая большие сложности структурно-функциональных исследований мембранных белков, особенно тех, которые вовлечены в клеточную сигнализацию, речь идет о широком использовании созданных авторами взаимодополняющих друг друга вычислительных и экспериментальных методов в изучении важнейших рецепторов, механизмы работы которых до сих пор не расшифрованы в той степени, которая позволяла бы осуществлять целенаправленную модуляцию их функции в живой клетке. Среди них – представители семейства рецепторных тирозинкиназ (РТК) - рецепторов эпидермальных факторов роста (ErbB), и рецепторов инсулина (IR, IRR, IGF1R) и др. В перспективе предлагается провести сравнительный анализ структурно-функциональных детерминант и межмолекулярных белок-белковых и белок-липидных взаимодействий для ТМ доменов РТК (и других мембранных белков) и их мутантных форм. Это позволит выявить отличия в функциональных конформационных изменениях, происходящих при активации этих белков в норме и при патологиях, а также раскрыть молекулярные механизмы взаимосвязи «структура-функция-патогенез» для РТК и других мембранных белков из разных семейств. Полученные в ходе выполнения проекта структурно-динамические данные будут в дальнейшем востребованы при создании новых биологически активных веществ с заданными свойствами для направленного воздействия на биологическую активность РТК и иных мембранных белков при терапии заболеваний человека и управления клеточными процессами. Отдельного внимания заслуживают результаты, полученные в ходе рационального создания т.н. «пептидов-перехватчиков», способных направленным образом влиять на процессы олигомеризации и активность нейраминидазы-1 человека (NEU1). Полученные в 2020 г. французскими коллегами из университета г. Реймс данные биологических испытаний созданных пептидов на клетках полностью подтвердили эффективность предложенной в проекте оригинальной технологии. В то же время, это – лишь первый шаг, авторы уже видят пути совершенствования таких «пептидов-перехватчиков», в т.ч. и путем точечного мутагенеза. Поскольку ингибирование NEU1 может приводить к значительному уменьшению последствий атеросклероза и воспалений сосудов, планируемые результаты открывают перспективное направление терапии атеросклероза. Более того, появившиеся недавно экспериментальные данные о вовлеченности NEU1 в процессы межрецепторной коммуникации (т.н. «cross-talking»), например, с рецептором инсулина и др., позволяют рассматривать возможность создания пептидых агентов, действующих на соответствующие пути обмена информацией в клетке. Это – совершенно новое направление, в случае успеха результаты откроют новые фундаментальные закономерности в работе рецепторных «оркестров» клетки. Французские коллеги готовы активно продолжать сотрудничество в рамках данной темы. Перспективы фундаментально-ориентированных и прикладных исследований: С точки зрения возможностей практического применения в биомедицине разработанная платформа и накопленная авторами экспертиза в области молекулярной биофизики сигнальных рецепторов будут использованы для создания уникального биоинформационного онлайн-ресурса - базы данных потенциальных димерных конформаций ТМ доменов РТК со всеми ТМ доменами битопных белков в протеоме человека. Общее число таких конфигураций составляет более 200 тысяч. Это даст возможность эффективного поиска потенциальных клеточных партнеров РТК среди битопных белков с последующей валидацией на основании литературных данных, анализа интерактомов, а также возможной экспериментальной проверкой. Особый интерес представляют гетеродимеры между родственными РТК, поскольку они могут проявлять патологическую активность. Авторы уже начали работы в этом направлении, полученные предварительные результаты выглядят многообещающими с точки зрения их применения к прогнозированию эффектов точечных мутаций в РТК и создания селективных ТМ-модуляторов их активности. Хотя разработанная в ходе проекта платформа доказала свою работоспособность, необходимо ее совершенствовать и, что особенно важно для приложений, масштабировать/информатизировать. Это позволит перейти от изучения одиночных РТК к массированному скринингу состояний их ТМ олигомеров и автоматизированному дизайну действующих на них агентов. Таким образом, перспективным и практически значимым представляется переход от поискового фундаментального исследования к созданию высокотехнологичных биоинформационных ресурсов и услуг в области рецепторики. Вышеперечисленные задачи можно было бы эффективно решать в случае продления сроков выполнения проекта - авторы планируют подать в Фонд такую заявку на 2021-2022 гг.