Аннотация результатов, полученных в 2018 году
С помощью комплексного биофизического подхода, сочетающего использование экспериментальных методов (биоинженерия, спектроскопия ЯМР и кругового дихроизма, динамическоле светорассеяние) и компьютерного молекулярного моделирования, исследованы структурно-динамические свойства трансмембранных (ТМ) альфа-спиральных доменов ряда рецепторов сигнальных систем клетки и их аналогов, содержащих точечные проонкогенные мутации. Объекты исследования – рецепторные тирозинкиназы (РТК): PDGFRA (рецептор тромбоцитарного фактора роста), VEGFR2 (рецептор эндотелиального фактора роста сосудов), рецептор инсулина (IR), рецепторы эпидермального фактора роста из семейства ErbB, а также мембрано-связанная нейраминидаза-1 и модельные ТМ пептиды. За отчетный период получены следующие основные результаты: - Показана склонность к олигомеризации (прежде всего, формирование тетрамеров) ТМ фрагментов мутантной формы V536E рецептора PDGFRA, отсутствующая в белке дикого типа. Это может играть потенциальную роль в спонтанной активации рецептора и представляет возможный новый и малоизученный механизм активации РТК, вызванной онкогенными мутациями в ТМ домене. В соответствии с полученными экспериментальными данными была предложена пространственная модель ТМ тетрамера V536E PDGFRA, согласно которой «ядро» тетрамера соответствует правозакрученному димеру по интерфейсу II, а две другие спирали периферически взаимодействуют с ядром и образуют два левозакрученных димера по интерфейсу I с контактами между мутированными остатками E536. Проведены расчеты 200 нс МД для полученной конфигурации ТМ тетрамеров V535E и дикого типа PDGFRA в полноатомном бислое ПОФХ. Показано, что мутантные ТМ альфа-спиральные пептиды формируют более компактный тетрамер по сравнению с белком дикого типа, в первую очередь - за счет стабильных контактов остатков E536-E536. Мутантная форма ТМ тетрамера также обладает меньшей подвижностью по сравнению тетрамером, формируемым ТМ спиралями белка дикого типа. Результаты опубликованы в статье, вышедшей в журнале BBA - General Subjects, 2018 (WOS, Q1). - В рамках изучения взаимного влияния трансмембранных фрагментов белков и их мембранного окружения исследован ряд фундаментальных вопросов. Так, показано, что длина ацильных цепей липидов и их насыщенность могут оказывать влияние на структуру и стабильность мембранных рецепторов, однако это справедливо не для всех систем. В частности, для описания стабильности димера рецептора ErbB4 важным оказывается баланс между белок-белковыми взаимодействиями и влиянием окружения, тогда как для ТМ доменов гликофорина А, рецептора ErbB1 и ряда модельных пептидов влияние типа ацильных цепей на конформацию олигомеров и сайты белок-липидного взаимодействия мало. Изучено возмущение мембраны, вызванное ТМ димерами PDGFRA дикого типа и его онкогенного ТМ мутанта V536E. Установлена взаимосвязь между геометрией ТМ димера и характером его поверхности, экспонированной в бислой, и наблюдаемым паттерном взаимодействий с липидами. Наиболее выраженные участки взаимодействия с липидами на поверхности ТМ спиралей наблюдаются в области полярных остатков (в первую очередь, S541). При этом правозакрученная конформация ТМ димера дикого типа «замораживает» наибольшее число липидных молекул. Энтропийный эффект, связанный с замораживанием липидов, оценивали методом квазигармонического приближения с последующим картированием полученных значений конформационной энтропии в плоскости бислоя. Наиболее значительное понижение энтропии липидного окружения наблюдается для правозакрученной конформации ТМ димера дикого типа. Обнаружен асимметричный характер возмущения в мембране, вызванного ТМ димерами: для ближнего липидного окружения наблюдается систематически более низкие значения конформационной энтропии в области “внешнего” (N-концевой участок ТМ спирали) монослоя, по сравнению со “внутренним” монослоем (С-концевой участок ТМ спирали). Поскольку асимметрия мембранного ответа может вносить непосредственный вклад в трансмембранную передачу сигнала, наблюдаемый феномен требует дальнейшего детального изучения. Результаты опубликованы в статье, вышедшей в журнале BBA - General Subjects, 2018 (WOS, Q1). - Изучение полноразмерных (или близких к ним) моделей рецепторов может дать гипотезы о переходе между активными и неактивными состояниями. В ходе работ этапа 2018 г. для рецептора инсулина продемонстрировано наличие шарнирной области во внеклеточном домене, вокруг которой возможно вращение примембранных сегментов, сопровождающееся их сближением. В то же время, поведение отдельных фрагментов молекулы относительно независимо. То есть изучение ряда индивидуальных доменов в таких сложных системах обоснованно и может адекватно описывать поведение системы в целом. Это позволяет рассчитывать на получение в будущем структурных результатов, применимых к полноразмерным мембрано-связанным рецепторам сигнальных клеточных систем. - Для нейраминидазы-1 человека предсказано формирование при димеризации тетрамера парой трансмембранных гетеродимеров ТМ2-ТМ3. Выявлена вероятная конфигурация такого тетрамера и показана его стабильность в модельной мембране. Формирование такой структуры хорошо согласуется с имеющимися в распоряжении авторов экспериментальными данными и, предположительно, обусловливает активность мембранной формы указанного фермента. - Для изучения влияния патогенных мутаций на внутри- и межмолекулярные взаимодействия мембранных рецепторов типа I был проведен поиск по базам данных онкогенных мутаций в рецепторе VEGFR2 из семейства рецепторов эндотелиального фактора роста сосудов организма человека. Для структурно-динамических исследований методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения разработаны генноинженерные конструкции и протоколы очистки рекомбинантных фрагментов (включающих полностью ТМ домен с короткими примембранными участками) рецептора TM-VEGFR2 дикого типа и его проонкогенных мутантных форм с аминокислотными заменами T771R и A772T. С помощью бесклеточной системы экспрессии наработаны количества 15N/13C-изотопно-меченых фрагментов TM-VEGFR2, достаточные для проведения ЯМР-экспериментов. С помощью гетероядерной спектроскопии ЯМР, спектроскопии кругового дихроизма и метода динамического светорассеяния для фрагментов TM-VEGFR2 дикого типа и мутантных форм подтверждено образование ТМ спирали и показана специфическая димеризация в мембрано-подобных супрамолекулярных комплексах в виде детергентных мицелл. Таким образом, на данном этапе проекта были получены ЯМР-образцы ТМ доменов рецептора VEGFR2 дикого типа и его мутантных форм, приемлемые для получения детальной экспериментальной информации о молекулярных механизмах влияния онкогенных мутаций на структурно-динамические свойства и специфическую димеризацию в мембраноподобной среде. Проведены обобщение и систематизация накопленной авторами (в т.ч. и в ходе работ по проекту) информации о роли гидрофобных взаимодействий в белок-мембранных системах. Результаты опубликованы в виде обзорной статьи в журнале Expert Review of Proteomics (WOS, Q2). Показано, что атомистические пространственно-временные характеристики гидрофобных/гидрофильных свойств изучаемых белок-мембранных систем определяют сценарии поведения пептидов на границе раздела вода-мембрана и внутри липидного бислоя. Эти данные необходимы для количественной характеризации параметров «мембранного ответа» при изучении ассоциации ТМ спиральных доменов РТК и других интегральных мембранных белков.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
- Проведено сравнительное исследование динамического поведения трансмембранных (ТМ) доменов и полноразмерного рецептора PDGFRa дикого типа (WT) и его мутантной формы V536E в мономерном, димерном и тетрамерном состояниях. Установлено, что в олигомерных формах белка дикого типа (WT) характер движения ТМ спиралей принципиально отличается от такового в мутанте, причем обнаруженный ранее в димерах динамический эффект полярной онкогенной мутации сохраняется и в олигомерах более высокого порядка. Внесение данной мутации разобщает передачу механического сигнала в мембране от внеклеточных рецепторных доменов к цитоплазматическим киназным, блокируя вращение ТМ спиралей и создавая предпосылки для независимого движения их С-концевых участков. Полученные результаты создают молекулярную основу для рациональной терапии онкологических процессов, обусловленных неправильной работой рецепторных сигнальных белков клетки. - Детально изучено поведение внеклеточных доменов ряда важнейших рецепторных тирозинкиназ человека — рецепторов инсулина (IR), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) и эпидермального фактора роста (EGFR). Показано, что, несмотря на высокое сходство структурной организации, детали их поведения различаются. При этом включение мембраны в полноразмерную модель рецептора затрудняет анализ внутримолекулярных движений. С другой стороны, обнаруженная независимость структурно-динамических параметров ТМ сегмента от остальных доменов дала возможность построения моделей рецепторов на основании результатов исследования поведения их отдельных фрагментов (в частности, ТМ домена). Получена модель ТМ гетеродимера IR и IGF-1R, близкая по геометрии к ранее полученным моделям гомодимеров каждого из рецепторов, но менее выгодная в терминах свободной энергии ассоциации. Данный результат позволяет предположить, что такой гетеродимер может формироваться за счёт взаимодействий внеклеточных доменов, но будет обладать сниженной активностью по сравнению с рецепторами дикого типа. - С помощью комплексного биофизического подхода (ЯМР, оптическая спектроскопия, молекулярное моделирование) изучено влияние патогенной семейной «австралийской» мутации L723P на структурно-динамическое поведение ТМ сегмента белка-предшественника бета-амилоида (APР). Обнаружено, что мутация вызывает локальное разворачивание концевого витка ТМ спирали, в то время как в центре липидной мембраны наблюдается стабилизация данного сегмента. Это и приводит к пагубным последствиям - расщеплению белка АРР ферментами-секретазами и интенсивному накоплению патогенных форм бета-амилоида вокруг нейронов. Результаты исследования раскрывают простой молекулярный механизм развития болезни Альцгеймера, связанный непосредственно с влиянием «австралийской» мутации на структурно-динамические свойства мембранного сегмента белка APР. Примечательно, что возрастное развитие болезни Альцгеймера можно объяснить схожими механизмами, где вместо мутации будут действовать, например, окислительный стресс или определенный липидный состав мембран нейронов, включая избыток холестерина. Результаты этой работы были представлены на сайте МФТИ в виде интервью с с.н.с. Э.В. Бочаровым: https://mipt.ru/news/biofiziki_vyyasnili_kak_avstraliyskaya_mutatsiya_privodit_k_bolezni_altsgeymera - Проведена количественная оценка энергетических вкладов водородных связей между группами всех компонентов системы (белок, липиды, вода) в стабилизацию ТМ сегментов рецепторов и их олигомеров в липидном бислое. На основании рассчитанных методом Монте-Карло в средах различной полярности профилей потенциала средней силы и значений свободной энергии ассоциации ряда модельных соединений, имитирующих комплексы с водородной связью в мембране, установлено, что эти вклады критическим образом зависят от величины локальной диэлектрической проницаемости среды, и, следовательно, от расположения донорно-акцепторной пары относительно центра мембраны.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На этапе 2020 г. работу проводили по следующим направлениям: - Изучение механизмов олигомеризации РТК как на уровне их ТМ доменов, так и на расширенных моделях, включающих внемембранные участки – вплоть до полноразмерных рецепторов; Основные результаты: С помощью комплексного – экспериментального и теоретического – молекулярно-биофизического подхода проведено уточнение моделей пространственной структуры димеров рецепторов инсулина (IR) и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R). Сделаны выводы о структурной взаимосвязи между внеклеточным, трансмембранным (ТМ) и киназным доменами и их роли в передаче сигнала. Предполагается, что сближение примембранных участков внеклеточного домена приводит к спонтанной ассоциации ТМ доменов с образованием одного или нескольких промежуточных состояний димера. В то же время, наиболее энергетически выгодное состояние ТМ димера соответствует активному состоянию и приводит к «правильному» контакту внутриклеточных частей молекулы. Разработанные модели ТМ димеров IR и IGF-1R с параллельной упаковкой спиралей позволили объяснить роль двух описанных в литературе точечных мутаций. Впервые предложена модель димера полноразмерного рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFRa) и методом молекулярной динамики (МД) в полноатомном представлении изучены его структурно-динамические характеристики в липидном бислое. Впервые показана возможность аллостерической коммуникации между внеклеточными и внутриклеточными доменами в димере, в которую непосредственный вклад вносит конфигурация димера ТМ доменов. Кроме того, каждой уникальной конформации ТМ димера, по-видимому, соответствует определенное расположение киназных доменов. Таким образом, модулируя димеризацию ТМ спиралей, можно непосредственно влиять на характер взаимодействия между киназными доменами и их активность. Это дает важную теоретическую основу для разработки модуляторов работы рецепторных тирозинкиназ (РТК), действующих на ТМ домены. Рассчитанные в ходе МД коллективные (низкочастотные) движения в модели полноразмерного рецептора PDGFRa проиллюстрированы в видео-файлах, доступных в сети Интернет по ссылкам: 1. https://www.dropbox.com/s/qabw2ik366qyyio/PDGFRA_dimer_MD_300ns_v3.mov?dl=0 2. https://www.dropbox.com/s/b268fhl2peo37ge/PGDFRA_dimer_MD_300ns_v4.mov?dl=0 На примере четырёх РТК - представителей семейства ErbB – методом МД детально охарактеризовано распределение связанных молекул липидов в модельных липидных бислоях. Впервые выявлены интересные закономерности локализации липидов на поверхности ТМ пептидов в мономерном и димерном состояниях. Обнаружена важная роль в белок-липидных взаимодействиях т.н. «гликофоринового» мотива в аминокислотной последовательности ТМ пептидов. Показано, что для димеров с «гликофорин-подобным» интерфейсом димеризации картины пространственного распределения максимумов плотности липидов вблизи области контакта спиралей похожи и, вероятно, определяются геометрией упаковки мономеров белка. Именно для структур с таким типом упаковки характерно формирование чётко выраженных сайтов связывания молекул липидов: они возникают в области самого «гликофоринового» мотива в случае мономеров и вблизи интерфейса в димерах. Такое связывание липидов, предположительно, определяется геометрическими параметрами (рельефом поверхности спирального ТМ домена и параметрами димера). Результаты, полученные для ТМ доменов изученных в рамках проекта РТК (IR, IGF-1R, ErbB, PDGFRa и др.), свидетельствуют о том, что даже в рецепторах одного семейства процессы олигомеризации могут происходить по-разному – в зависимости от тонких особенностей структурно-динамической организации как самих ТМ доменов, так и соседних с ними участков белков и мембранного окружения. Мы полагаем, что подобная «многофакторная» модель функционирования ТМ олигомеров позволяет рецепторам осуществлять свою «тонкую настройку» в сигнальных процессах в клетке. - Исследование фундаментальных аспектов влияния мембранного окружения на процессы белок-белковых взаимодействий – с привлечением данных, полученных на модельных системах, имитирующих клеточные мембраны; Основные результаты: Методами атомистического компьютерного моделирования получены новые результаты о физических механизмах белок-липидных и липид-липдных взаимодействий в модельных мембранах. Предложен оригинальный вычислительный подход к поиску кластеров (нанодоменов) и «потоков» липидов в мембранах на основе одновременного анализа их координат и векторов смещений, что позволило выявлять и описывать различные типы коллективных движений в модельных мембранах. Впервые сделан вывод о том, что липидные нано-домены, несмотря на высокую насыщенность водородными связями (Н-связями), представляют собой нестабильные, быстро флуктуирующие структуры с небольшим временем существования и повышенной степенью гидратации по сравнению с остальными участками мембраны. Молекулы липидов, находящиеся внутри доменов, способны быстро менять своих партнеров по межлипидным Н-связям, способствуя возникновению интенсивных флуктуаций доменной структуры. Важно, что представленная картина характерна для бислоя в состоянии равновесия (согласно критериям, достигнутым в ходе МД), т.е. доступная воде поверхность клеточной мембраны – ее т.н. «молекулярный портрет» - имеет выраженный мозаичный и, что существенно, динамический характер. Параметры такого «динамического молекулярного портрета» сильно зависят от липидного состава бислоя, а также, по-видимому, от условий среды (температура, давление, концентрации ионов и пр.). - Демонстрация возможностей разрабатываемой молекулярно-биофизической технологии путем создания «пептидов-перехватчиков», нацеленных на ТМ домены рецептора, с последующей экспериментальной проверкой действия этих пептидов на их мишени в клетках; Основные результаты: С помощью комплексного – экспериментального и теоретического – молекулярно-биофизического подхода осуществлен рациональный дизайн пептидов, действующих на ТМ домен мембранного белка - нейраминидазы-1 человека (NEU1). Методами компьютерного моделирования провели сравнение структурно-динамических свойств димеров, формируемых ТМ2 сегментом NEU1 с двумя потенциальными «интерферирующими пептидами» IntPep-RKR и mutIntPep-RKR. На основании рассчитанных значений свободной энергии ассоциации ТМ спиралей показали, что первый из них связывается с природным ТМ2 сегментом лучше, чем сам изолированный пептид ТМ2, в то время как замены аминокислот во втором делают его взаимодействие с ТМ2 менее энергетически выгодным. Получен образец N15-меченого рекомбинантного фрагмента R305-R341 NEU1, включающий в себя сегмент ТМ2. С использованием экспериментальных биофизических методов (спектроскопия ЯМР, КД, динамические светорассеяние) для полученного полипептида удалось выявить спонтанную димеризацию в мицеллах. Результаты анализа межмолекулярных контактов и оценки времени перехода мономер-димер говорят в пользу наличия протяжённого полярного интерфейса спираль-спираль, характерного для «слабых» димеров ТМ доменов. Показано, что пептид mutIntPep-RKR, содержащий четыре мутации в аминокислотной последовательности по сравнению с пептидом ТМ2 из белка дикого типа, склонен к формированию гетеродимеров с ТМ2. Важно отметить, что в ходе исследования данные вычислительных и экспериментальных методов взаимно дополняли друг друга, способствуя таким образом значительному повышению точности прогноза. Эффективность «пептидов-перехватчиков» ТМ домена NEU1, разработанных с помощью комбинированного - in silico и экспериментального – подхода, была продемонстрирована в совместной работе с коллегами из университета г. Реймс. Французские коллеги экспериментально подтвердили, что пептиды IntPep-RKR и mutIntPep-RKR заданным образом влияют на димеризацию и сиалидазную активность фермента в клетках. Это – первое в мире доказательство успешно осуществленного молекулярного дизайна пептидного агента, способного управлять работой важнейшего мембранного белка NEU1. Таким образом, предложенный авторами в настоящем проекте «молекулярно-биофизический» подход, нацеленный на модуляцию свойств ТМ доменов рецепторов, был непосредственно апробирован в ходе биологических испытаний in vitro.