Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основная цель проекта - создание короткого селекционного трансгена, который бы эффективно интегрировался в таргетный ген, используя короткие плечи гомологии, выключал ген и одновременно экспрессировался на поверхности клетки, что позволило бы выделить популяцию редактированных клеток при последующей FACS-сортировке. На первом этапе мы разработали и протестировали три стратегии детекции редактированных клеток: с помощью эпитопа Flag и/или HA, доставляемых на поверхность клетки в контексте коротких GPI-белков (1) или путем слияния их с трансмембранным доменом (2) или с помощью тетрацистеинового тага (TC) (3). Среди всех подходов последние два оказались проблемными и добиться экспрессии/детекции маркера не удавалось. Однако на основе коротких GPI-белков, используя методы мутагенеза и химеризации гомологичных доменов, мы отобрали два наилучший варианта, которые назвали Glu-LD-N-Flag-GPI52 и CD5Flag2, обеспечивающие эффективную доставку эпитопа Flag на поверхность клетки. Существенным оказалось то, что GPI-сигнал из молекулы CD52 в сочетании с лидерным пептидом из секретируемой люциферазы Gaussia или из того же CD52 и N-гликозилирование между лидерным пептидом и маркерным эпитопом обеспечивали максимальный уровень поверхностной экспрессии Flag. Созданные конструкции успешно были применены для селекции клеток, нокаутных по гену GFP-turbo. Для эффективной экспрессии GPI-тагов при нокине в эндогенные гены человека мы решили проблему экспрессии мРНК трансгена путем добавления сигнала polyA из бета-глобина человека. По сравнению с традиционным polyA из SV40, он оказался в 2.8 раза короче, но в 1.5 раза эффективней при оценке уровня нокина в локус GAPDH человека. На основе коротких кодирующих и терминирующих последовательностей были также созданы конструкции с тагом HA. Была продемонстрирована эффективность как раздельного, так и одновременного нокина Flag и HA конструкций в локус GAPDH. Полученная пара GPI-эпитопных тагов будет использована для селекции клеток с биаллельным нокаутом по ряду внутриклеточных и секретируемых белков.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Нами разработан метод SORTS (Surface Oligopeptide knock-in for Rapid Target Selection). В основе его лежит создание очень короткого GPI-заякоренного эпитопного тага в сочетании с коротким терминатором транскрипции из бета-глобина человека. Совокупно длина трансгенной конструкции составляет около 250 п.о. При такой длине использование плечей гомологии размером по 100 нуклеотидов, которые мы включали в синтетические олигонуклеотиды, оказалось достаточным для эффективной интеграции конструкции в таргетный локус с помощью CRISPR/Cas9. Экспрессия эпитопа и одновременный нокаут гена были эффективными. Малозатратное и быстрое приготовление ПЦР-донора позволяет протестировать эффективность нокина в разные области гена и отобрать наилучший вариант по поверхностной экспрессии GPI-эпитопа. Сортировка клеток по двум тагам, а в большинстве случаев и по одному тагу, позволяет получить поликлональные клеточные нокауты по любым генам, включая те, которые кодируют внутриклеточные или секретируемые белки. Релевантность полученных таким способом нокаутов для оценки функции гена выше, чем у нокаутов, отобранных клонированием. Видимо, это связано с конкурентным выживанием и ростом в популяции клеток с наименьшими off-target повреждениями генома. Кроме нокаутирования, SORTS может успешно применяться для обогащения клеток с тагированным геном, например, ауксиновым дегроном, позволяющим кратковременно осуществлять деплецию жизненно-важных белков. Важным на наш взгляд применением SORTS является борьба с ВИЧ. Метод может решить задачу эрадикации интегрированного вируса и проблему возникновения escape мутантов, вызванных образоваием indels. По крайней мере, мы продемонстрировали на модели in vitro, что SORTS эффективен в эрадикации провируса ВИЧ.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Мы продолжили работу по расширению возможностей разработанного нами метода SORTS и сфокусировались на разработке стратегии нокина эпитопных тагов в интронную часть генов. И хотя эта часть работы изначально не была запланирована в проекте (план был выполнен в первые два года), мы посчитали это интересной и полезной опцией для нашего метода. В частности, нокин в интронную область нейтральных локусов человека и мыши, AAVS1 и Rosa26, используют для стабильной экспрессии различных генов. Считается, что в этих областях хроматин активен, а влияние трансгена на рядом лежащие области генома и наоборот минимально, а также клетка не реагирует на трансген включением эпигенетического сайленсинга. Эффективность любого нокина снижается пропорционально увеличению размера вставляемого трансгена. Мы предположили, что использование SORTS и короткой конструкции с эпитопным тагом будут эффективны для внедрения сайтов рекомбинации в локус AAVS1. С помощью данного подхода мы запланировали получить клетки HEK293T c интеграцией сайтов FRT в локус AAVS1. Мы подобрали две пары сайтов рекомбинации FRTwt-FRT3 и FRT13-FRT14. Чтобы заставить эпитопный таг экспрессироваться после интеграции в интрон, перед беспромоторной конструкцией in-frame с кодирующей частью экзона-1 гена PPP1R12C мы добавили и протестировали два варианта наиболее коротких последовательностей сплайс-акцепторов, из мышиного белка En2 и аденовируса (Ad). Эффективным оказался первый вариант. В итоге мы сконструировали донорный вектор, где конструкция En2SA-P2A-CD5HA2-bglpA была фланкирована плечами гомологии AAVS1. Однако мы столкнулись с проблемой, связанной с инициацией экспрессии эпитопного тага до интеграции в локус, которую мы решили путем мутации криптического стар-кодона в 5’-плече гомологии и укорочения плечей гомологии. При сравнении нуклеаз ZFN и CRISPR/Cas9, специфичных к AAVS1, обе индуцировали нокин, с небольшим преимуществом для ZFN. В итоге мы получили около 7% клеток с нокином, которые мы отсортировали и подтвердили высокую стабильность экспрессии эпитопа. Были созданы клетки HEK293T с сайтами FRTwt-FRT3 или FRT13-FRT14, изолированные по экспрессии трех различных эпитопных тага – Flag, HA и c-myc. На этих клетках мы показали возможность обмена кассеты с эпитопным тагом на экспресионную кассету с GFP при добавлении рекомбиназы FlpO. Таким образом, мы адаптировали SORTS для редактирования интронов, и получили таким способом клетки HEK293T c сайтами рекомбинации в локусе AAVS1, в которые можно будет вставлять трансгены любых размеров методом рекомбинации. Следует отметить, что клетки с нокином, полученные путем сортировки поликлональной популяции, т.е. методом SORTS, являются более функционально полноценным, чем выделенные клонированием. К недостатку данного варианта метода можно отнести то, что в случае нецелевой интеграции кассеты, вероятность ее экспрессии увеличивается, так как может сработать принцип генной ловушки. Обзор по методу SORTS и детальный протокол опубликованы в главе 22 монографии «Методы редактирования генов и геномов» Новосибирского издательства РАН.