КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-14-00086

НазваниеЭволюция плацентарных аналогов у водных колониальных беспозвоночных (Bryozoa)

РуководительОстровский Андрей Николаевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ 2018 - 2020  , продлен на 2021 - 2022. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-101 - Зоология

Ключевые словаэволюционные инновации, плацента, оогенез, личинки, бактериальные симбионты, анатомия, ультраструктура, иммуноцитохимия, флуоресцентная in situ гибридизация, геномика, транскриптомика

Код ГРНТИ34.33.15


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Матротрофия (экстраэмбриональное питание) и его наиболее сложная форма – плацентотрофия, неоднократно возникали в различных группах живых организмов. В эволюционной биологии данный феномен рассматривается в качестве одной из ключевых инноваций, определивших возникновение высших растений, а также бурную радиацию позвоночных животных, в частности плацентарных млекопитающих. Малоизвестно, однако, что различные варианты матротрофии, в том числе с использованием плацентоподобных структур, широко представлены и среди беспозвоночных. А ведь первые примитивные плаценты возникли именно у беспозвоночных, и именно у них они достигли значительного структурного разнообразия, предварив возникновение сложных плацент позвоночных животных. Морфо-функциональное сходство плацент беспозвоночных и позвоночных является одним из самых ярких примеров конвергентной эволюции среди многоклеточных животных. Однако, в противоположность позвоночным животным, у которых экстраэмбриональное питание является объектом активных исследований, плаценты беспозвоночных остаются почти не изученными. Цель проекта – выявить закономерности эволюции плацентотрофии у беспозвоночных, а именно – её морфо-функционального, симбиотического и геномного аспектов. В качестве модели будет использована древняя группа колониальных организмов – мшанки (тип Bryozoa), где плацентарные аналоги распространены шире, чем в какой-либо другой группе водных беспозвоночных. Для исследований будут использованы как классические, так и современные микроскопические и молекулярные методы, включая световую, электронную и конфокальную микроскопию, иммуноцитохимию, флуоресцентную in situ гибридизацию, изучение геномов и транскриптомов. Будут исследованы плацентарные аналоги у морских и пресноводных представителей всех трех классов Bryozoa (Phylactolaemata, Stenolaemata и Gymnolaemata) (из 18 семейств), что позволит максимально широко охватить разнообразие независимо возникших трофических структур мшанок. В числе важнейших задач – изучение анатомического строения плацентарных аналогов, выявление ультраструктурных механизмов передачи питательных веществ к эмбрионам, сравнительный анализ строения личинок плацентарных видов, а также взаимоотношения между плацентарными органами и бактериальными симбионтами, в том числе исследование вертикальной их передачи от взрослых животных к личинкам через плацентарный барьер. Изучение бактериальных симбионтов у плацентарных видов будет выполнено на представителях классов Stenolaemata и Gymnolaemata. В ходе исследования будут проверены гипотезы о независимом происхождении и структурном усложнении плацентарных аналогов в различных группах мшанок, а также о влиянии возникновения плацент на изменение характера оогенеза и строение личинок и независимом приобретении у мшанок симбиоза с бактериями, выделяющими вещества, делающими личинок несъедобными для хищников. Геномные и транскриптомные исследования будут направлены на изучение трех модельных видов из трех классов Bryozoa. Реализация проекта позволит впервые охарактеризовать молекулярные основы развития плацентарных аналогов у беспозвоночных, идентифицировать гены, вовлеченные в данные процессы, и провести их сравнительный анализ как между различными классами Bryozoa, так и с аналогичными генами позвоночных. Будет проверена гипотеза о возможности конвергентных эволюционных приобретений на молекулярном уровне. Наша исследовательская группа более чем наполовину состоит из молодых, но уже высококвалифицированных исследователей, имеющих все необходимые для выполнения навыки микроскопической и молекулярной работы. Поскольку предварительные результаты изучения ультраструктурных, симбиотических и молекулярных аспектов плацентотрофии, полученные нашей группой в последние пять лет оказались «прорывными», есть полная уверенность в том, что будет осуществлен качественный скачок в данной области исследований. Проект в первую очередь направлен на изменение парадигмы отношения к феномену экстраэмбрионального питания у беспозвоночных как малозначительному и незаслуживающему внимания. Напротив, применив мультидисциплинарный подход, мы беремся доказать, что его изучение позволит решить ряд фундаментальных общебиологических проблем, связанных с пониманием возникновения и конвергентной эволюции сложных органов, таких как плацента, у многоклеточных животных. Подобных исследований до сих пор в мире не проводилось.

Ожидаемые результаты
1. В ходе проекта будут детально изучены и описаны анатомия, ультраструктура, развитие и функционирование плацентарных аналогов, а также оогенез и строение личинок у 28 видов из 18 семейств всех трех классов мшанок (Phylactolaemata, Stenolaemata и Gymnolaemata). 2. На основе сравнительного анализа полученных данных будут реконструированы главные этапы и выявлены закономерности конвергентной эволюции матротрофии в пределах типа Bryozoa. 3. Будут проверены гипотезы, касающиеся (1) наличия переходных форм от примитивной к продвинутой матротрофии, (2) существования корреляции между типом оогенеза и синтетической и транспортной активностью плацент, (3) независимого структурного усложнения плацентарных аналогов в разных группах, (4) наличия инвазивных плацент у представителей класса Phylactolaemata, а также (5) влияния экстраэмбрионального питания на строение личинок. 4. Впервые будут изучены ультраструктурные механизмы, обеспечивающие питание бактериальных симбионтов за счет тканей хозяина, в том числе плацентарной, а также их трансплацентарный перенос к личинкам в выводковые камеры. С использованием молекулярных методов будет изучена локализация бактерий в личинках, проведена их идентификация и проверена гипотеза о неоднократном приобретении симбионтов мшанками. 5. Будет собран, проанализирован и опубликован геном первого представителя типа Bryozoa. 6. Будут секвенированы транскриптомы представителей трех классов мшанок, что позволит выявить ряд генов, потенциально контролирующих закладку и функционирование плацент. На основе полученных данных будет проведен ряд РНК-гибридизаций In situ для выявления пространственно-временной локализации выявленных генов и их сравнительного анализа. Проект будет первым масштабным исследованием, посвященным восстановлению этапов эволюции плацентарного питания у беспозвоночных, и позволит сделать важный шаг в понимании эволюции плацентотрофии у беспозвоночных в частности и Metazoa в целом. Результаты исследования будут опубликованы в виде серии статей в международных рецензируемых журналах по эволюционной и репродуктивной биологии, симбиозу и геномике, а также послужат материалом для написания трех кандидатских, двух магистерских диссертаций, и двух бакалаврских квалификационных работ. Кроме того, данные проекта будут использованы для подготовки образовательных программ и курсов лекций, читаемых на биологическом факультете Санкт-Петербургского государственного университета.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследования плацентарных аналогов, оогенеза и личинок В 2018 г. работы были собраны, зафиксированы и подготовлены для микроскопических исследований размножающиеся колонии 29 матротрофных видов мшанок, наличие плацентарных аналогов у которых было выявлено в ходе наших предварительных исследований или было известно из литературы. Большинство запланированных для исследования видов были собраны в ходе драгировок и с использованием легководолазной техники на Учебно-научной базе СПбГУ «Беломорская» (Республика Карелия), а также в пресных водоемах в окрестностях Санкт-Петербурга. Запланированные для исследования виды входят в 17 семейств, относящихся ко всем трем известным классам Bryozoa: Cristatellidae (класс Phylactolaemata), Crisiidae, Tubuliporidae, Lichenoporidae, Cinctiporidae (класс Stenolaemata), Bugulidae, Beaniidae, Microporidae, Cellariidae, Cribrilinidae, Catenicellidae, Hippothoidae, Watersiporidae, Lacernidae, Urceoliporidae, Flustrellidridae, Vesiculariidae (класс Gymnolaemata). Для сравнительного исследования также были собраны семь видов с неплацентарным вынашиванием из семейств Alcyoniidae, Tendridae, Calloporidae, Candidae, Flustridae и Cribrilinidae. С использованием световой микроскопии были изучены и описаны особенности развития и строения плацентарных аналогов у всех перечисленных выше видов: этапы изменения формы и размеров клеток эмбриофора на разных этапах его развития и деградации, форма зрелого эмбриофора, локализация питающих клеток, их форма и степень гипертрофии, положение ядра, наличие и положение включений (предположительно – резервных веществ, транспортируемых в полость выводковой камеры), степень ассоциации клеток эмбриофора с клетками транспортной фуникулярной ткани, степень развития фуникулярных клеток, их форма, наличие и положение включений. Сравнительные ультраструктурные исследования плацентарных аналогов и поверхностных клеток эмбрионов, а также транспортных механизмов, вовлеченных в передачу питательных веществ во время инкубации, были выполнены на четырех видах класса Stenolaemata и восьми видах из класса Gymnolaemata. На ультраструктурном уровне были изучены содержание органелл в клетках эмбриофора и поверхностных клетках эмбриона, а также динамика изменений, осуществляемых в процессе инкубации. Были получены доказательства наличия экзоцитоза в клетках эмбриофора и эндоцитоза в клетках эмбрионов. Плацентарный аналог Stenolaemata является модифицированной мембранной сумкой – бывшим гидростатическим аппаратом аутозооида, трансформировавшимся в питающую “ткань”. Развивающиеся эмбрионы и незрелые личинки погружены в эту ткань, которая окружает их со всех сторон, непосредственно прилегая к поверхностным клеткам эмбрионов. Питающая ткань представляет собой сложный синцитий перитонеальной природы. В состав синцития входят также и отдельные клетки, предположительно участвующие в его достройке и обновлении. Синцитий демонстрирует высокую синтетическую и транспортную активность. Плацентарные аналоги синцитиального типа у беспозвоночных до сих пор описаны не были. Развитие эмбриофора у представителей класса Gymnolaemata сопровождается делением и гипертрофией образующих его клеток, а также мощным развитием белоксинтезирующего аппарата. Фуникулярные клетки эмбриофора, которые отличаются неправильной формой, также увеличиваются в размерах, хотя и не столь сильно, как эпидермальные. Особый, неизвестный ранее тип плацентарного аналога обнаружен у хейлостомной мшанки Celleporella hyalina. В отличие от прочих исследованных видов эмбриофор является не однослойной эпителиальной структурой, а “тканевидным органом”, который занимает до половины объема женского зооида. Также в ходе наших исследований были впервые получены ультраструктурные доказательства существования матротрофии у ктеностомат. Для всех видов из класса Gymnolaemata, исследованных при помощи трансмиссионной электронной микроскопии, в клетках эмбриофора нами были получены доказательства экзоцитоза в виде наличия различного рода выростов апикальной клеточной мембраны и находящихся под ней мелких пузырьков. Напротив, у представителей класса Stenolaemata следов экзоцитоза не обнаружено. Тем не менее, сильное развитие синтетического аппарата в синцитии указывает на наличие иных видов передачи питательных веществ растущим эмбрионам, например, активного транспорта. У представителей из обоих классов поверхностные клетки развивающихся эмбрионов характеризовались наличием пиноцитозных вакуолей и/или микровиллей. В целом, проведение сравнительного анатомического анализа выводковых камер и плацентарных аналогов мшанок, относящихся к разным классам, позволило выявить фундаментальные различия в локализации, строении и источниках формирования матротрофных структур на уровне семейств и классов. В то же время ультрастуктурные исследования однозначно указывают на общность цитологических механизмов, лежащих в основе их функционирования. Все вместе это позволяет приступить к выявлению основные направления эволюции плацентарного вынашивания в пределах Bryozoa. Сравнительный анализ был особенно показателен, так как выбранные для изучения виды мшанок характеризовались разными типами инкубации эмбрионов (живорождение у стенолемат и вынашивание у гимнолемат), разным строением выводковых камер (гонозооидами у стенолемат и овицеллами и внутренними выводковыми сумками у гимнолемат), а также разными типами оогенеза (микролецитальным у стенолемат и макро- и микролецитальным у гимнолемат). Анатомические исследования женских гонад показали четкие структурные различия для видов с разными репродуктивными паттернами. Плацентарные виды характеризовались относительно слабым развитием фолликулярных клеток, что указывает на меньшую, нежели у неплацентарных мшанок, роль овария в снабжении потомков питательными веществами. Напротив, гонады у видов преимущественно состояли из крупных фолликулярных клеток с хорошо развитым белоксинтезирующим аппаратом. Среди фолликулярных клеток на ультраструктурном уровне было выделено несколько типов. Также при помощи трансмиссионного электронного микроскопа были изучены содержание органелл в клетках овария и вителлоненных ооцитов. Было показано наличие транспорта веществ из клеток фолликула в ооциты за счет экзо- и эндоцитоза. Для проверки гипотезы о влиянии плацентарного питания на строение личинок гимнолемных мшанок были исследованы микроанатомия и ультраструктура личинки матротрофного вида из семейства Hippothoidae и личинок трех видов с неплацентарным вынашиванием из семейств Tendridae, Calloporidae и Alcyonidiidae. Данные по микроанатомии и ультраструктуре личинок плацентарного вида C. hyalina позволяют отнести их к типу коронатных личинок. Сходное строение личинки характеризует также неплацентарный вид C. craticula. Напротив, личинки видов A. hirstutum и T. zostericola относятся к типу паракоронатных личинок, которые сохраняют в своем строении анцестральные признаки планктотрофных личинок мшанок (цифонаутов). Морфологические и молекулярные исследования бактериальных симбионтов мшанок Бактериальные симбионты были обнаружены в трех видах изученных мшанок - Aquiloniella scabra, Scrupocellaria sinuosa и Dendrobeania fruticosa. Они располагаются внутри так называемых фуникулярных тел, которые, по сути, представляют локальные скопления бактерий, окруженные мезотелиальной тканью, и являющиеся частью обширной сети фуникулярных тяжей. Характер расположения и, собственно, организация бактериальных тел и строение бактериальных симбионтов являются видоспецифичными. Морфология симбионтов позволяет относить их к группе Грамотрицательных бактерий. Характер контакта клеток фуникулярных тел с симбионтами указывает на трофические связи между хозяином и бактериями. Мы также предполагаем, что последние могут перемещаться в лакунах фуникулярных тяжей хозяина. Молекулярные исследования систематического статуса симбиотических бактерий из мшанки Aquiloniella scabra посредством секвенирования последовательностей малой субъединицы р-ДНК бактерий показали принадлежность симбионтов к группе гамма-Протеобактерий протеобактериальной филы. Полученные сиквенсы, при сравнении с базой данных (blast.ncbi.nlm.nih.gov) показали высокий процент идентичности (максимальное сходство по одной паре праймеров – 99%, сходство по двум другим парам – 81% и 91%). Во всех трех вариантах были идентифицированы бактерии рода Psychrobacter. Оригинальной особенностью симбиотической системы с участием бактерий и мшанки Scrupocellaria sinuosa является обнаружение округлых радиально исчерченных образований внутри бактериальных клеток, которые можно трактовать как вирусоподобные частицы. До настоящего времени вирусы у мшанок описаны не были. Свето- и электронномикроскопическое изучение Dendrobeania fruticosa (Bugulidae) также показало наличие симбиотических бактерий в полости этих мшанок. Бактерии находятся в одном очень крупном фуникулярном теле, плотно прилегающем к кишечнику животного. Клетки обкладки бактериального тела, в отличие от двух других описанных выше видов мшанок, крупные и кубические или столбчатые по форме. Внутри клеток находится большое количество ш-ЭПР и секреторных пузырьков. Совокупность таких клеток формирует объемные складки, направленные внутрь пространства с симбиотическими бактериями, и от поверхности клеток отходят тонкие неупорядоченные микровилли. Характер строения клеточной стенки бактерий указывает на их принадлежность к Грамотрицательным бактериям. Молекулярно-генетические и биоинформатические исследования Выделенная из пресноводного плацентарного вида Сristatella mucedo ДНК и несколько молодых колоний были использованы для проведения: (1) полногеномного секвенирования с малой длинной прочтений (short-read) с использованием технологии NGS на платформе Illumina HiSeq4000; (2) полногеномного секвенирования с большой длинной прочтений (long-read) с использованием технологии NGS на платформе Pacific Biosciences; (3) диссоциации молодых колоний на отдельные клетки и проведения транскриптомного анализа отдельных клеток путем single-cell-секвенирования с использованием технологии NGS IonTorrent. Полученные результаты NGS использованы для гибридной сборки генома, проводимого в сотрудничестве в Институтом биоинформатики, Санкт-Петербург. Для сборки используется программа-сборщик Flye и программа для постобработки Racon. Предварительныерезультаты сборки генома свидетельствуют о высоком качестве полученных данных (суммарная длина 562.5 Мb, 950 контигов, N50 = 2.814 Мб, Busco-счет – 93.4%, что существенно превышает показатели опубликованных геномов представителей Phoronida и Brachiopoda). Собранные зрелые колонии Cristatella mucedo были использованы для проведения транскриптомного анализа. Из разных частей колоний была выделена тотальная РНК, с последующей чисткой polyA-фракции, использованной для характеристики как полного, транскриптомов зрелой колонии. Анализ транскриптома позволит верифицировать предсказанные кодирующие последовательности в геноме. Первичный анализ результатов single-cell-секвенирования выявил 10 кластеров клеток. Тем не менее, на данном этапе не представляется возможным сопоставление данных кластеров с отдельными клеточными типами C. mucedo. Для решения этой задачи для каждого из кластеров было выбрано по 1-2 мажорных транскрипта для анализа их методом РНК-гибридизации in situ. Метод in situ РНК-гибридизации является одним из ключевых в проводимом исследовании, т.к. позволяет, с одной стороны, верифицировать результаты биоинформатического анализа траскриптомных данных, а с другой, получить информацию о пространственно-временном паттерне экспрессии целевых генов.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Изучение плацентарных аналогов и оогенеза В ходе второго года работы необходимый материал был собран в ходе драгировок и с использованием легководолазной техники в акваториях Белого, Черного и Адриатического морей. Размножающиеся колонии мшанок были зафиксированы и исследованы с использованием световой, трансмиссионной и сканирующей электронной, а также конфокальной лазерной микроскопии. Проведен сравнительный анализ общей анатомии выводковых камер и плацентарных аналогов, а также изучены ультраструктурные механизмы, используемые клетками плаценты и эмбрионов в ходе экстраэмбрионального питания на разных стадиях инкубации. Кроме того, был исследован оогенез плацентарных и неплацентарных видов мшанок и строение их личинок. Микроскопические методы были дополнены методами объемной реконструкции исследуемых плацентарных аналогов. Всего было изучено 23 вида, относящихся к 17 семействам, входящим в два класса и три отряда типа Bryozoa. Широкий спектр исследованных объектов – представителей филогенетически удаленных линий мшанок, позволил сделать сравнительный анализ максимально репрезентативным. При помощи световой и конфокальной микроскопии были проанализированы развитие и структура выводковых камер – внутренних выводковых сумок и скелетных выводковых камер. Использование гистологических срезов позволило также детально описать развитие и строение эпителиальных плацент (эмбриофора) хейлостомных мшанок на разных этапах развития и деградации эмбриофора. Были изучены ультраструктура плацентарных аналогов и характер их взаимодействия с развивающимися эмбрионами, в том числе обнаружены ультраструктурные свидетельства транспорта веществ и их поглощения эмбрионами. Выяснено, что на ранних стадиях развития эмбрионы ввиду своих небольших размеров не касаются эмбриофора, по-видимому, потребляя питательные вещества непосредственно из жидкости выводковой полости, куда их поставляет плацентарный аналог. Полученные данные свидетельствуют, что матротрофное питание на этом этапе осуществляется посредством гистотрофии – активного поглощения низкомолекулярных веществ всей поверхностью зародыша. В ходе роста эмбрионы постепенно занимают бóльшую часть, и, в конечном счете, всю выводковую полость, тесно прилегая к стенкам выводковой камеры, в том числе эмбриофору. Сами механизмы питания при этом не меняются (мы предполагаем наличие пассивного и активного транспорта питательных веществ, а также пиноцитоза), однако формально такой вариант питания с прилегающими друг к другу поверхностями, через которые осуществляется направленный двусторонний транспорт газов, питательных веществ и метаболитов рассматривается как плацентотрофия. Эволюционное значение приобретения плацентарных аналогов в настоящее активно обсуждается в литературе. Широкое распространение плацент у неродственных или характеризующихся дальним родством таксонов указывает на неоднократное конвергентное приобретение плацентарных аналогов. Наши данные по распределению плацент среди представителей типа Bryozoa, а также различия в их положении, структуре и источниках формирования однозначно указывают на ту же тенденцию. Кроме того, полученные нами данные указывают на то, что данная адаптация, в основном, характеризует виды с эфемерными колониями – быстрорастущими и слабо обызвествленными, зачастую – с вертикальными ветвящимися колониями. В этой ситуации представляется логичным предположить, что наличие экстраэмбрионального питания может обеспечивать более быстрое развитие эмбрионов и формирование личинки, нежели у нематротрофных видов. Для эфемеров, обитающих в сезонных условиях, такая стратегия может оказаться выгодной, особенно после зимовки, когда многие ниши становятся вакантными. Детали анатомии женской гонады и ультраструктуры оогенеза были исследованы у двух видов с контрастными репродуктивными паттернами. Были описаны форма и характер распределения фолликулярных клеток разных типов в разных участках овариальной стенки, а также положение и содержание органелл в клетках овария и ооцитов. Особое внимание было уделено изменениям этих характеристик в ходе вителлогенеза. Изучение личинки хейлостомной неплацентарной мшанки Tendra zostericola выявило ее сходство по ряду признаков с личинками типа цифонаут. В то же время, общая архитектура нервной системы сходна с личинками коронатного типа. Уникальные особенности, неизвестные личинок других видов, обнаружены в строении мускулатуры. Сочетание архаичных и специализированных признаков у личинки данного вида подтверждают имеющиеся в литературе данные о независимом переходе тендрид от вымета зигот к вынашиванию и формированию лецитотрофных личинок. Начаты исследования личинок ктеностомной (предположительно плацентарной) мшанки Amathia sp., изучены общая анатомия и строение нервной и мышечной системы. Изучение личинок плацентарных видов стенолемных мшанок Patinella verrucaria и Tubulipora sp. показало наличие ранее неизвестных для личинок циклостомных мшанок типов клеток с различным типом секрета и большое количество клеток с запасными питательными веществами. В личинках P. verrucaria между микровиллями клеток поверхностного эпителия, а также между внутренними клетками были обнаружены бактерии. Исследования бактериальных симбионтов мшанок Для исследований симбиотических ассоциаций между мшанками и Prokaryota были использованы методы световой, трасмиссионной электронной и флуоресцентной микроскопии. Собранный материал использовался для поиска бактериальных симбионтов в зооидах, анцеструлах и личинках мшанок, определения мест их локализации, изучения строения бактериальных клеток и клеток мшанок, с которыми симбионты контактируют, а также для изучения перемещения симбионтов в пределах организма хозяина. Кроме бактерий, обнаруженных в фуникулярных телах у видов Bugula neretina, Paralicornia sinuosa, and Dendrobeania fruticosa, были впервые описаны бактерии, поселяющиеся в щупальцах аутозооидов. Таким образом, показано, что в мшанках возможно присутствие, по крайней мере, двух независимых популяций бактериальных симбионтов, различающихся по морфологии и локализации. Симбиотические бактерии B. neretina и P. sinuosa в пределах фуникулярных тел и в эпидермисе щупалец подвергаются морфологическим изменениям, которые сопровождаются появлением в цитоплазме клеток вирусо-подобных частиц (ВПЧ). Присутствие предполагаемых бактериофагов в мшанках ранее в литературе не отмечалось. У видов C. craticula и Patinella verrucaria симбионты обнаружены в личинках методами ТЕМ и флуоресцентной микроскопии. На основании обнаружения бактериальных симбионтов в разных локусах зооидов мшанок нами были предложены различные сценарии перемещения бактерий в пределах колонии мшанок – за счет самостоятельного движения бактерий (механизм локомоции не известен) – в целомической полости зооида или по лакунам фуникулярной системы, и посредством амебоцитов. Строение бактериальных симбионтов и ВПЧ в них и их расположение и динамика в мшанках-хозяевах B.neretina и P.sinuosa позволяют предположить, что все три участника симбиотической ассоциации образуют целостного холобионта, в котором каждый из членов может играть соответствующую роль в поддержании стабильности всей системы. Молекулярно-генетические и биоинформатические исследования Завершена сборка и аннотация генома пресноводной мшанки Cristatella mucedo. Исходно было получено 20-кратное покрытие генома с помощью Oxford Nanopore, 65-кратное покрытие PacBio и 80-кратное покрытие Illumina (стандартные Paired end библиотеки). В результате удалось получить сборку генома со следующими показателями: N50 – 4,116 Мб, суммарная длина – 574Мб, 986 контигов. В геноме обнаруживается 920 (94%) ортологов из базы BUSCO, характерных для Metazoa, 905 из которых являются полными и однокопийными. Предсказание генов с использованием RNA-seq и «мягкого» маскирования генома позволило выявить 35 950 генов. Текущее качество аннотации также может быть оценено с использованием процента прочтений RNA-seq, которые сопоставляются с аннотированными последовательностями. Более 70% прочтений было картировано, что свидетельствует о хорошем качестве полученной аннотации. Для удобства работы, полученные результаты сборки и аннотации генома и транскриптомов были организованы в удобном для просмотра виде с помощью геномного браузера Jbrowse. С учетом улучшенной сборки и аннотации генома был предпринят повторный анализ результатов single-cell-секвенирования с использованием набора программ CellRanger и пакета Seurat для языка R. В результате удалось картировать более 65% single-cell ридов что позволило существенно улучшить полученные ранее результаты. Выделено 20 кластеров клеток, часть из которых удалось определить по характеру генной экспрессии. Для верификации результатов биоинформатического анализа траскриптомных данных было выбрано несколько кластер-специфичных мажорных транскриптов для анализа их методом РНК-гибридизации in situ. В результате были выявлены гены, экспрессия которых характерна для тканей лофофора, пищеварительной системы, а также покровных эпителиев. В настоящее время проводится анализ экспрессии кластер-специфичных генов, полученных в результате повторного анализа результатов single-cell-секвенирования.

 

Публикации

1. Дик М.Х., Вешенбах А., Тротт Т.Дж., Ониши Т., Беверидж С., Епископ Д.Д., Ито М., Островский А.Н. Global distribution of the invasive cheilostome bryozoan Cribrilina mutabilis Zoological Science, - (год публикации - 2020).

2. Квач А.Ю., Варфоломеева М.А., Котенко О.Н., Сухотин А.А., Кутиумов В.А., Грищенко А.В., Гранович А.И., Островский А.Н. Life history of the ctenostome bryozoan Flustrellidra hispida in the White Sea Invertebrate Zoology, Том16, № 4 (год публикации - 2019).

3. Неклюдова У.А., Шваха Т.Ф.,Котенко О.Н.,Грубер Д.,Циран Н.,Островский А.Н. Sexual reproduction of the placental brooder Celleporella hyalina (Bryozoa, Cheilostomata) in the White Sea Journal of Morphology, Том 280, Выпуск 2, Стр. 278-299 (год публикации - 2019).

4. Неклюдова Ю.А., Шунькина К.В., Гришанков А.В., Варфоломеева М.А., Гранович А.И., Островский А.Н. Colonies as dynamic systems: reconstructing the life-history of Cribrilina annulata (Bryozoa) on two algal substrates. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, Том 99, № 6, Стр.: 1363-1377 (год публикации - 2019).

5. Островский А.Н. Reproductive Strategies and Patterns of Marine Invertebrates: Diversity and Evolution Paleontological Journal, - (год публикации - 2020).

6. Старунов В.В., Предеус А.В., Барбицов Ю.Б., Кутюмов В.А., Мальцева А.Л., Водясова Е.А., Кон А.Б., Мороз Л.Л., Островский А.Н. Comparative genomic analysis of Cristatella mucedo provides insights into Bryozoan evolution and nervous system function bioRxiv, BIORXIV/2019/869792 (год публикации - 2019).

7. Шваха Т., Моосбруггер М., Вальзль М., Островский А.Н. First ultrastructural evidence of placental nutrition in a ctenostome bryozoan: example of Amathia verticillata. Zoomorphology, Том: 138, Выпуск: 2, Стр.: 221-232 (год публикации - 2019).

8. Шваха Т., Островский А.Н., Ваннингер А. Key novelties in the evolution of Bryozoa: evidence from the soft-body morphology Biological Reviews, - (год публикации - 2019).

9. Шевченко Е.Т., Варфоломеева М.А., Неклюдова Ю.А., Котенко О.Н., Усов Н.В., Гранович А.И., Островский А.Н. Electra vs Callopora: Life-histories of two bryozoans with contrasting reproductive patterns from the White Sea Invertebrate Reproduction and Development, - (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Плаценты, оогенез, личинки В течение заключительного года проекта сравнительные исследования микроанатомии и ультраструктуры плацентарных аналогов Bryozoa были направлены, в первую очередь, на поиск доказательств неоднократного конвергентного возникновения плацентотрофии, а также на выявление ультраструктурных механизмов, обеспечивающих двунаправленный обмен веществ между плацентой и эмбрионом в ходе инкубации. Были исследованы плацентарные аналоги видов мшанок из девяти семейств, относящихся ко всем трем известным классам типа Bryozoa (Phylactolaemata, Stenolaemata и Gymnolaemata). Впервые для всех перечисленных выше таксонов с использованием световой микроскопии были изучены и описаны особенности развития и строения камер для инкубации эмбрионов – овицелл и внутренних выводковых камер: их положение, форма, характер обызвествления скелетных стенок и их эпителиальная выстилка. Были изучены и описаны особенности развития и строения плацентарных аналогов (эмбриофоров): локусы их закладки и источники возникновения, этапы изменения формы и размеров плацентарных клеток на разных этапах их развития и деградации, наличие делений и резорбции плацентарных клеток, положение их ядра, наличие и положение включений (предположительно – резервных веществ, транспортируемых в полость выводковой камеры). Также была описана форма зрелого эмбриофора, степень ассоциации клеток эмбриофора с клетками транспортной фуникулярной ткани, степень развития фуникулярных клеток, их форма, наличие и положение включений. На ультраструктурном уровне были изучены содержание органелл в клетках эмбриофора и в поверхностных клетках эмбриона, а также динамика цитологических изменений в процессе инкубации. Были получены доказательства наличия экзоцитоза в клетках эмбриофора и эндоцитоза в клетках эмбрионов. У Phylactolaemata и Stenolaemata в плацентарных клетках было показано наличие трансцитоза. Сравнительные ультраструктурные исследования плацентарных аналогов и поверхностных клеток эмбрионов позволили сделать выводы об общности цитологических механизмов, вовлеченных в передачу питательных веществ во время инкубации в разных группах мшанок. Доказательствами независимости происхождения матротрофии в исследованных группах Bryozoa являются выраженные различия в строении камер для инкубации эмбрионов, а также мозаичный характер распределения плацентарных видов на филогенетическом древе мшанок. В то же время следует указать, что хотя матротрофия в разных группах мшанок возникала независимо, ее структурные основы и используемые цитологические механизмы схожи. Питающая ткань плаценты циклостомных мшанок (кл. Stenoalemata) в настоящее время является единственным известным примером плаценты, состоящей из ценоцитов. Эволюция плаценты у циклостомат, включающая трансформацию гидрокомпенсаторного аппарата и замену его функции на экстраэмбриональное питание, является примером экзаптации (замещения функций), пример которой был также обнаружен у исследованной ктеностомной мшанки. Мы предполагаем, что приобретение высокоразвитой плаценты, обеспечивающей питание многочисленных эмбрионов, могло стать трофической «основой» возникновения полиэмбрионии у Cyclostomata. В свою очередь, массовая продукция личинок могла привести к эволюции крупных полиморфных гонозооидов. У циклостомных и филактолемной мшанок были изучены ранние этапы эмбриогенеза, включая раннее дробление и формирование двуслойного зародыша. В обоих группах это оказалась деламинация. Для плацентарных мшанок всех классов были предложены гипотетические сценарии эволюции их репродуктивных паттернов, включая обоснование гипотетических причин возникновения и следствий плацентотрофии. В результате обобщения результатов по плацентарным аналогам Bryozoa была реконструирована интегральная картина эволюции матротрофных структур в пределах типа – выявлены основные направления морфологической эволюции, источники их возникновения и основные параметры функционирования, а также показано влияние возникновения плацент на изменение характера оогенеза и, таким образом, возникновения новых вариантов репродукции. C целью проверки гипотезы о влиянии плацентарного питания на строение личинок в 2020 году была исследована микроанатомия и ультраструктура личинок двух плацентарных видов из разных классов мшанок:Celeporella hyalina (Gymnolaemata) и Tubulipora sp. (Stenolaemata) и неплацентарного вида Cribrilina annulata (Gymnolaemata). Были обнаружены уникальные особенности строения покровов у личинок плацентарных видов, в частности – наличие развитой густой сети длинных толстых микровиллей и клеточных выростов в апикальной части клеток покровов. Мы предполагаем, что подобное многократное увеличение площади поверхностного эпителия личинок позволяет наиболее эффективно получать питательные вещества через покровы от плацентарного аналога в период инкубации. Клетки покровов также осуществляют передачу питательных веществ с поверхности в глубокие внутренние слои личинки. Их форма и ультраструктурные характеристики сходны даже у личинок из разных классов мшанок. Кроме многочисленных микровиллией такие клетки характеризуются очень темной, электронно-плотной цитоплазмой и образуют длинные отростки, идущие внутрь тканей личинки. У личинок неплацентарных видов специализированные поверхностные клетки с электронно-плотной цитоплазмой в составе покровов не обнаружены, покровные клетки не образуют длинных клеточных выростов, микровилли либо отсутствуют, либо более короткие, тонкие и не такие многочисленные. Сравнительный анализ структуры планктотрофных личинок (цифонаутов) вида Electra pilosa (Electridae), развивающегося во внешней среде, и личинок двух вынашивающих неплацентарных видов из семейств Alcyonidiidae (Alcyonidium hirsutum) и Tendridae (Tendra zostericola), показал наличие у личинок последних двух видов архаичных черт. Их сходство с цифонаутом обнаруживается в 1) сохранении рудиментарного кишечника, 2) способности клеток аборального эпителия к формированию толстого поверхностного органического слоя наподобие раковины цифонаутов, 3) положении и размере клеток короны, 4) размере и строении апикального органа. Таким образом, эти личинки сохраняют множество признаков планктотрофных личинок мшанок, несмотря на развитие в инкубационных камерах. На ультраструктурном уровне признаков питания за счет материнского организма у зрелых, вышедших в окружающую среду личинок A. hirsutum и T. zostericola не обнаружено. Однако мы предполагаем, что эти признаки могут быть у ранних эмбрионов и личинок A. hirsutum, вынашиваемых в щупальцевом влагалище, поэтому в будущем планируем провести исследования в данном направлении. Бактериальные симбионты В 2020 году было продолжено изучение симбиотических систем мшанок с прокариотами. Исследование проводили на восьми видах мшанок из трех семейств класса Gymnolaemata и одного семейства класса Stenolaemata. Мшанки были собраны и зафиксированы в различные периоды полевого сезона, что позволило отследить динамику развития симбиотических взаимоотношений и изменения внутренних структур мшанок, связанных с симбиозом. У Aquiloniella scabra и Dendrobeania fruticosa эти изменения выражались в количестве бактерий и изменении клеточного состава фуникулярных тел. Bugula neretina демонстрирует самую большую вариабельность как в отношении морфологических типов бактериальных симбионтов, так и их локализации в аутозооидах и репродуктивных структурах. На основании детального описания этих характеристик предложены способы приобретения и передачи симбионтов в ходе жизненного цикла мшанок. Обнаруженные вирусоподобные частицы (ВПЧ) в двух видах мшанок Paralicornia sinuosa и B. neretina и характер изменений, происходящих с симбионтами, позволяет предположить, что вирусы являются бактериофагами, участвующими в регуляции численности симбиотических бактерий, обеспечивая стабильность симбиотической ассоциации. Необычные ВПЧ P. sinuosa в настоящее время предлагается рассматривать как фактор, предположительно участвующий в регуляции онтогенеза этого вида мшанок. Молекулярные исследования Были получены библиотеки последовательностей большой протяженности для Cristatella mucedo (N50 прочтений составляет 37,22 кб). Полученные прочтения использованы совместно с уже имеющимися данными для улучшения текущей версии сборки генома. Также, в рамках геномного проекта собран и проанализирован митохондриальный геном C. mucedo, оказавшийся самым большим среди всех изученных видов мшанок (21,008 bp), и характеризующийся наличием длинных некодирующих регионов. Порядок митохондриальных генов C. mucedo практически полностью идентичен таковому другой пресноводной мшанки - Pectinatella magnifica, но резко отличается от сильно реаранжированных митохондриальных геномов морских мшанок. Кроме того, сравнительный анализ порядка генов позволил обнаружить вероятную синапоморфию форонид и пресноводных мшанок, что косвенно подтверждает монофилию клады Phoronida+Bryozoa. Продолжен анализ результатов single-cell секвенирования молодых колоний C. mucedo. Результаты первичного анализа данных позволили предварительно охарактеризовать отдельные кластеры клеток как принадлежащие к мускулатуре, нервной системе, ресничным образованиям, а также, возможно, связанные с защитными функциями организма. Полученные результаты РНК-гибридизаций in situ согласуются с результатами проведенного анализа. Было проведено секвенирование транскриптомов из различных типов зооидов мшанки Crisiella producta (стерильные аутозооиды, а также гонозооиды на различных стадиях созревания, формирования плаценты и эмбрионов). Полученные результаты будут использованы для дальнейшего анализа с целью выявления последовательностей, специфических для гонозооидов и плацентарных аналогов, а также анализа динамики экспрессии генов в гонозооидах C. producta. Кроме того, проведен первичный биоинформатический анализ результатов секвенирования трансриптомов четырех видов мшанок (филактолемных мшанок Plumatella fungosa и Fredericella sultana и неплацентарных гимнолемных видов Eucratea loricata и Dendrobeania fruticosa).

 

Публикации

1. - Не можешь убежать — защищайся! Биологи выяснили, что помогло мшанкам прожить на Земле почти 500 миллионов лет Пресс-служба Управления по связям с общественностью СПбГУ, публикация в СМИ от 26 марта 2020 (год публикации - ).

2. Богданов Е.А., Вишняков А.Э., Островский А.Н. From Procaryota to Eumetazoa: fossil and modern associations of Bryozoa Paleontological Journal, - (год публикации - 2021).

3. Вишняков А.Е., Карагодина Н.П., Лим-Фонг Г., Иванов П.А., Шваха Т.Ф., Летаров А.В., Островский А. First evidence of virus-like particles in the bacterial symbionts of Bryozoa Scientific Reports, - (год публикации - 2020).

4. Грищенко А.В., Гордон Д.П., Тейлор П.Д., Куклинский П., Денисенко Н.В., Спенсер-Джонс М.Е., Островский А.Н. Systematics, ecology and zoogeography of the Recent species of Rhamphostomella Lorenz, 1886 and Mixtoscutella gen. nov. (Bryozoa, Cheilostomata) Zootaxa, - (год публикации - 2020).

5. Кутюмов В.А., Предеус А.В., Старунов В.В., Мальцева А.Л., Островский А.Н. Mitochondrial gene order of the freshwater bryozoan Cristatella mucedo retains ancestral lophotrochozoan features Mitochondrion, - (год публикации - 2021).

6. Неклюдова Ю.А., Шваха Т.Ф., Котенко О.Н., Грубер Д., Киран Н., Островский А.Н. Three in one: evolution of viviparity, coenocytic placenta and polyembryony in cyclostome bryozoans BMC Evolutionary Biology, - (год публикации - 2021).

7. Островский А.Н. Sexual reproduction in Bryozoa Handbook of Zoology, Глава 4, стр. 101-121 (год публикации - 2020).