Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчете представлены результаты первого этапа работы в рамках проекта, посвященного изучению механизмов фотохимических процессов в комплексах полиметиновых красителей с двумя сопряженными хромофорами и белков. В то время как цианиновые красители широко используются в лабораторной и медицинской практике в качестве флуоресцентных меток и контрастных веществ, подкласс бискарбоцианиновых красителей все еще недостаточно изучен. Бискарбоцианиновые красители обладают уникальными фотохимическими свойствами, взаимодействия двух сопряженных хромофоров приводит к расщеплению уровня первого синглетного состояния и появлению двух новых полос, одна из которых имеет сильное смещение в красную область спектра, имеют достаточно высокий квантовый выход триплетного состояния, что позволяет рассматривать эти красители в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии. По результатам предварительных испытаний было отобрано три бискарбоцианиновых красителя с различными углами между хромофорами (90°, 120° и 180°). Спектральными методами (абсорбция, флуоресценция, импульсный фотолиза, остановленная струя) были исследованы процессы комплексообразования красителя с альбумином - основным транспортным белком, доставляющим лекарства в ткани. Получены равновесные константы комплексообразования красителей с альбумином. Комплексообразование бискарбоцианиновых красителей с молекулами альбумина сопровождается смещением максимума полосы поглощения вследствие изомеризации красителя. В комплексе образуется более жесткая структура бискарбоцианиновых красителей, что приводит к затруднению внутренней конверсии по механизму изомеризации полиметиновой цепи и квантовые выхода процесса флуоресценции и интеркомбинационной конверсии возрастают. Эти комплексы играют важную роль в фотосенсибилизированных бискарбоцианиновыми красителями процессах. Измерение времен жизни флуоресценции синглетно-возбужденного состояния комплексов бискарбоцианиновых красителей с альбумином методом однофотонного счета при пикосекундном лазерном фотовозбуждении показало двух-экспоненциальную зависимость кинетики гибели синглетного возбужденного состояния, что свидетельствует об образовании двух типов комплексов с различной молекулярной жесткостью (τ1 = 1,0 нс и τ2 = 2,5 нс). Константы комплексообразования зависят от угла между хромофорами. Наибольшей константой характеризуется краситель с углом между хромофорами 90° (Кb = 5,8 × 104 М-1). Определены кинетические константы взаимодействия красителей с альбумином, которые характеризуют этот процесс, как диффузионно-контролируемый (k1= 2,2 × 107 M-1c-1) со стерическим фактором 10-2. Линейный по структуре бискарбоцианиновый краситель 3 имеет более низкое значение константы, так как сайт связывания в альбумине по геометрии, вероятно, не соответствует строению красителя, а процесс изомеризации полиметиновой связи не может обеспечить конгруэнтности при взаимодействии красителя и гидрофобного кармана в структуре альбумина. Таким образом, стабильность комплекса определяется константой распада и зависит от структуры красителя. Методом импульсного фотолиза были получены спектрально-кинетические характеристики триплетных состояний бискарбоцианиноваых красителей в растворах и определены относительные квантовые выходы интеркомбинационной конверсии. Спектры триплет-триплетного поглощения бискарбоцианиноваых красителей характеризуются двумя полосами поглощения при 700 нм и полосой поглощения в ближней ИК области при 1000 нм, которая была обнаружена впервые в настоящем исследовании. Триплетная природа полос поглощения была доказана методом триплет-триплетного переноса энергии от донора триплетной энергии (антрацен, бензопирен) на краситель и полным совпадением спектров короткоживущих промежуточных продуктов при прямом и при фотосенсибилизированном УФ фотовозбуждении. Было установлено, что квантовые выходы в триплетное состояние бискарбоцианинов составляют 0,1-0,2 и слабо зависят от угла между хромофорами и незначительно увеличивается при переходе от красителя с прямым углом 1 к красителю с линейной структурой 3. В экспериментах по тушению УФ флуоресценции альбумина красителем 1 при образовании комплекса установлена важная роль взаимодействия бискарбоцианиновых красителей с ароматическими аминокислотами, входящими в структуру альбумина. При комплексообразовании происходит донор-акцепторное взаимодействие красителя с ароматическими аминокислотами - тирозином (Tyr) и триптофаном (Trp). Тушение флуоресценции альбумина обусловлено быстрым фотопереносом электрона от ароматической аминокислоты на краситель. Сайт связывания в альбумине локализуется в области гидрофобного кармана, содержащего ароматическую аминокислоту Trp-212 и является потенциальным донором электронов для красителя в триплетном состоянии. Установлена природа образования двух видов комплексов полиметиновых красителей с альбумином. Импульсными методами доказан фотоперенос электрона с участием триплетного состояния полиметинового красителя двумя сопряженными хромофорами. Фотопереносу электрона способствует близкий контакт между красителем и ароматическими аминокислотами в структуре альбумина. Лидерный краситель 1 отобран по совокупности фотохимических и спектрально-кинетических характеристик комплексообразования с альбумином, который предполагается использовать в исследованиях по лазерному фотолизу и в экспериментах на клетках.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В процессе выполнения плана работ 2019 года по проекту был разработан протокол синтеза и очистки бискарбоцианинового красителя 3,8-диметил-2,7-бис((E)-3-((E)-1,3,3-триметилиндолин-2-иден)проп-1-ен-1-ил)бензо[1,2-d:3,4-d']бис(тиазол)-3,8-дииума перхлорат (БКЦ). Важным этапом получения БКЦ является синтез центрального гетероцикла 3,8-диметил-2,7-бис(метилсульфанил)-2Н-тиазоло[5,4:1,3]-бензотиазола, который в реакции с (3Е)-3-(1,3,3-триметилиндоленин-2-илиден)пропаналем в присутствии уксусного ангидрида дает целевой бискарбоцианиновый краситель. БКЦ был перекристаллизован из этилового спирта и пиридина с образованием серо-синих кристаллов. Широкое распространение в практике и научных исследованиях по фотодинамической терапии получили различные тетрапиррольные производные. Это обусловливает важность сравнения фотохимического и химического поведения (триплетные состояния, комплексообразование с белками крови) нового класса фотосенсибилизаторов на основе бискарбоцианиновых красителей с практически важным классом тетрапиррольных соединений. Структура молекул бисцианиновых и тетрапиррольных красителей была подтверждена методами ИК, ЯМР, UV-VIS, флуоресцентной спектроскопии и масс-спектроскопии. Важным этапом при проведении фотодинамической терапии является доставка фотосенсибилизатора в клетки, которая происходит с участием комплексов молекул красителей с белками крови (альбумин, липопротеины низкой плотности). Высокий метаболизм в раковых клетках приводит к накоплению фотосенсибилизатора преимущественно в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками. Исследовано и сопоставлено взаимодействие БКЦ и тетрапиррольных красителей с альбумином и липопротеинами низкой плотности. Методами стационарной и время-разрешенной флуориметрии были определены константы комплексообразования белков крови с исследуемыми красителями и времена жизни флуоресценции этих комплексов. Установлено, что при взаимодействии красителя с альбумином происходит образование двух видов комплексов с более жесткой структурой красителя, что подтверждается двумя различными временами жизни флуоресценции. Для комплекса красителя с липопротеинами низкой плотности была установлена одноэкспоненциальная кинетика гибели флуоресценции комплекса, что соответствует флуоресценции молекулы в вязкой органической среде. Сравнение констант комплексообразования двух важных классов фотосенсибилизаторов бискарбоцианинов и хлоринов показало, что важный для фотодинамической терапии процесс доставки фотосенсибилизатора в раковую клетку более эффективен для молекул хлоринов, для которых константы комплексообразования с альбумином на порядок выше, чем измеренные нами константы для бискарбоцианиновых красителей. Это различие в строении комплексов может оказывать влияние на эффективность доставки фотосенсибилизатора в раковую клетку и влиять на распределение фотосенсибилизатора между внутриклеточными органеллами, поскольку внутри клетки наблюдается сильная разница в аффиности молекул красителя к различным биомакромолекулам, образующим внутреннюю структуру клетки. Как показали наши эксперименты по конфокальной микроскопии с БКЦ, несмотря на значительные размеры, краситель в низких концентрациях проникает внутрь ядра клетки. При комплексообразовании БКЦ с молекулой ДНК происходит интеркалирование красителей между основаниями ДНК и залегание в малой бороздке двойной спирали, что подтверждается изменениями в спектрах поглощения и в спектрах кругового дихроизма, и соответствует двум различным комплексам. С использованием импульсного фотолиза методом триплет-триплетного переноса была проведена оценка положения триплетного уровня БКЦ. Установлено большое различие в реакционной способности триплетных состояний комплексов бискарбоцианиновых красителей в различных быстрых элементарных фотохимических процессах. Комплексообразование фотосенсибизаторов с молекулами ДНК приводит к сильным стерическим затруднениям для протекания фотохимических реакций с участием триплетного состояния красителя, и несмотря на увеличение квантового выхода триплетного состояния в этих системах, эффективность фотосенсибилизаторов может быть невысокой. Именно этот факт может препятствовать фотосенсибилизированным процессам в фотодинамической терапии, в которых затрагиваются реакции, непосредственно связанные с ядром клетки. Вероятность проникновения фотосенсибилизаторов в ядро клетки является не очень высокой, что в сочетании с большими стерическими затруднениями приводит к невысокой эффективности сенсибилизированных процессов внутри ядра клетки. Доказана важная роль триплетного состояния БКЦ в процессах фотопереноса электрона от доноров электрона, которые могут предшествовать образованию супероксида анион-радикала в модельных экспериментах и в клетках. Показано, что в присутствии донора электрона (аскорбиновая кислота), возбужденная молекула БКЦ образует анион-радикал, вследствие переноса электрона от донора. Кинетика этого процесса характеризуется диффузионной константой скорости. Получены спектрально-кинетические характеристики анион-радикала БКЦ. Этот интермедиат может приводить к образованию супероксид анион-радикала, который проявляет сильное цитотоксическое действие и играет важную роль в разрушении раковых клеток. В клетках в качестве донора электрона могут выступать некоторые аминокислоты (тирозин, триптофан), входящие в структуру альбумина. Исследование зависимости накопления БКЦ в цитоплазме клеток аденокарциномы прямой кишки человека HCT116 осуществлялось методом флуориметрии клеточных лизатов, полученных в результате инкубации клеток с красителем. Оптимальный временной интервал накопления красителя в клетках составляет 1 ч. Световую и темновую цитотоксичность БКЦ исследовали с помощью МТТ-теста. Световая цитотоксичность IC50L составила 0.3 мкМ, а темновая токсичность IC50D соответствовала концентрации красителя 5 мкМ, т.е. БКЦ проявляет сильную световую цитотоксичность. Экспериментально показано, что БКЦ производит эффективную фотодеструкцию опухолевых клеток. Методом конфокальной микроскопии установлено возникновение сильного оксислительного стресса, вызванного воздействием БКЦ. С использованием флуоресцентного сенсора MitoSOXRed показано образование супероксид анион-радикала в клетках HCT116. Таким образом установлена важная роль триплетных состояний бискарбоцианиновых красителей в формировании реакционноспособных частиц (супероксид анион-радикала), возникновение которых приводит к запуску механизма апоптоза и некроза, приводящих к гибели клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Экспериментально доказан фотоперенос электрона от донора (аскорбиновая кислота) на триплетное состояние фотосенсибилизаторов (бискарбоцианиновые красители, порфирины и хлорины) и получены спектрально-кинетические характеристики короткоживущих интермедиатов в этих фотохимических процессах. Установлены механизмы фотодеградации фотосенсибилизаторов в присутствии кислорода. Рекомбинация радикалов красителей приводит к образованию исходной молекулярной формы фотосенсибилизатора и восстановленной формы красителя. Проведенные эксперименты по импульсному фотолизу, фемтосекундной спектроскопии и методом ЭПР показали, что в растворе при фотовозбуждении комплексов фотосенсибилизаторов (бискарбоцианины, порфирины и хлорины) с альбумином не происходит образования анион-радикала красителя и не образуется супероксид анион-радикал. При фотовозбуждении комплекса фотосенсибилизатора с альбумином в синглетном возбужденном состоянии происходит сверхбыстрый фотоперенос электрона в комплексе от донора (тирозин в альбумине) на фотосенсибилизатор. Гибель этой ион-радикальной пары происходит за время 45 фс с образованием исходного комплекса в невозбужденном основном состоянии. Этот эксперимент свидетельствует о тесном контакте фотосенсибилизатора с ароматической аминокислотой в комплексе краситель–альбумин. Возможные взаимодействия между молекулой бискарбоцианина и альбумином были проанализированы с использованием метода молекулярного докинга. Большая часть конформаций бискарбоцианиновых красителей расположена между Субдоменами IIA и IIIA а также между Субдоменами IIA и IIB в основании структуры белка. Аминокислотные остатки расположены в пределах 4 Å от красителя. Анализ сайт связывания показывает, что один замещенный индолениновый фрагмент вставляется глубоко в карман, а другой фрагмент ориентирован к внешней поверхности белка. Форма кармана между сайтами IIA и IIB достаточно близко соответствует форме молекулы красителя. Для режима связывания наблюдается дополнительный вклад от слабого нековалентного π-π-стэкингового взаимодействия между остатком Trp214 и периферическим индолениновым кольцом. Расчетное расстояние 4.126 Å между ароматическими фрагментами при π–π-стекинге подтверждает предположение, что краситель имеет дополнительное взаимодействие с молекулой белка. Диссоциация синглетной ион-радикальной пары на ион-радикалы в растворе не происходит, что объясняет отсутствие в системе радикала супероксида. Гибель триплетного эксиплекса (комплекс триплетного состояния фотосенсибилизатора с альбумином) также не приводит к полному переносу электрона и образованию ион-радикальных интермедиатов, что также не дает возможности образоваться анион-радикалу супероксида. Однако, эксперименты in vitro на раковых клетках демонстрируют фотодинамический эффект и указывают на образование анион-радикала супероксида. Методом конфокальной микроскопии установлена локализация в клеточных структурах фотосенсибилизаторов различных классов (бискарбоцианины, порфирины и хлорины). Для бискарбоцианоновых красителей характерна митохондриальная локализация фотосенсибилизатора в клетках. На культуре клеток аденокарциномы толстой кишки человека НСТ116 установлена фотоцитотоксичность бискарбоцианоновых красителей и доказано образование супероксида, который и приводит к гибели клеток. Эти эксперименты указывают на то, что в клетках фотосенсибилизатор находится в комплексе с молекулой белка, который эффективно вступает в реакцию фотопереноса электрона с образованием анион-радикала фотосенсибилизатора с последующей передачей электрона на молекулярный кислород с образованием супероксида. Образование синглетного кислорода при фотосенсибилизации красителями доказано в экспериментах in vitro. Однако при облучении раковых клеток однозначного вывода об участии синглетного кислорода сделать нельзя, поскольку сама по себе регистрация люминесценции при 1275 нм свидетельствует только об образовании синглетного кислорода, но не о его реакции с органеллами клетки. Малое время жизни и низкая реакционная способность синглетного кислорода не позволяет этому интермедиату внести существенный вклад в процесс фотодеструкции клеточных структур. В результате быстрого процесса гибели синглетного кислорода образуется основное невозбужденное триплетное состояние молекулярного кислорода, которое далее не вступает в реакции, приводящие к гибели клеток. Реакции супероксида с клеточными структурами приводят к появлению новых радикальных интермедиатов, образование которых несовместимо с внутриклеточными процессами и в каскаде этих радикальных превращений неизбежно происходит гибель клеток по механизму апоптоза или некроза. Генерация супероксид анион-радикала в клетках при фотооблучении бискарбоцианина была доказана методом конфокальной микроскопии на модельной клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека HCT116 с использованием зонда MitoSOX. Бискарбоцианиновые красители по сравнению с фотосенсибилизаторами тетрапиррольного ряда имеют ряд преимуществ: высокие константы связывания с альбумином, что способствует проникновению красителя в клетки, и высокие коэффициенты экстинкции в красной области спектра. В модельных экспериментах с донором электрона – аскорбиновой кислотой, триплетное состояние бискарбоцианиновых красителей обладает более высокой реакционной способностью в реакции фотопереноса электрона по сравнению с тетрапиррольными фотосенсибилизаторами. Этими экспериментами доказана важная роль супероксида в процессе фотоактивации гибели раковых клеток при фотодинамической терапии.