Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью настоящего проекта является разработка научных основ создания радиофармпрепаратов (РФП) на основе углеродных носителей для эффективных диагностики и лечения социально-значимых заболеваний. Одним из главных требований, предъявляемых к РФП является целевое накопление в органе-мишени. Направленный транспорт РФП осуществляется при взаимодействии двух составляющих: носителя, доставляющего радиоактивный изотоп к органу-мишени; и самого изотопа, наработка и выделение которого является сложным процессом. Особенно перспективными носителями являются углеродные наноматериалы (УН), такие как наноалмаз, нанотрубки, графен, которые являются биосовместимыми, нетоксичными, специфично накопливаются в определенных органах, радиационно устойчивы и способны к комплексообразованию с радионуклидом за счет модифицирования их поверхности. В первый год выполнения проекта в соответствии с планом для выбранных углеродных носителей были определены следующие физико-химические свойства, прежде всего морфология (просвечивающая микроскопия высокого разрешения (ПЭМ)), фазовый состав (РФА), гибридизация (КРС), элементный и функциональный состав поверхности (РФЭС, ИКС), содержание элементов-примесей (ИСП-МС, гамма-активационный анализ). Показано, что детонационный наноалмаз (ND) образован частицами сферической формы имеющие кристаллическую структуру с размерами частиц от 3 до 10 нм, в среднем 4-6 нм. Содержание элементов-примесей не превышает 0,5 % масс., при этом примесей высокотоксичных элементов и адсорбированных органических соединений не обнаружено. Оксида графена (GO) представляет собой смесь плоских развернутых листов микронных размеров, имеющие толщину в несколько графеновых слоев, и диспергированный оксид графена в виде частиц с размерами около 2 нм. Площадь его поверхности достигает 900 м2/г; при нагревании до 250 оС он теряет 35 % массы, что в основном связано с разложением карбоксильных групп. Углеродные нанотрубки (MWNT) представляют собой хаотически изогнутые нитевидные многослойные графеновые слои цилиндрической формы с диаметром до 30 нм и толщиной стенки 5-10 нм. MWNT гидрофобны и водных растворах находятся на границе раздела фаз. В нанотрубках присутствуют частицы катализатора, что подтверждается наличием примесных элементов Ni, Co и др. по данным метода ИСП-МС. Для закрепления радионуклидов на УН необходимо их модифицирование для создания на поверхности необходимых функциональных групп или иммобилизации комплексообразующих веществ. Модификация УН проводилась следующими путями: восстановление УН водородом и алюмогидридом лития, окисление УН в смеси кислот, хлорирование с последующими аминированием ND аммиаком при 400 оС (ND-NH2). Окисленные УН модифицировались глицидолом (2,3 – эпоксипропанол). к ND карбодиимидным методом была осуществлена прививка этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и органических комплекооброзователей – производных аминокислот L1 и L2 (Богдан дай названия), которые имеют псевдополость с мягкими донорными центрами вторичных аминогрупп. Так, после окисления ND (HNO3(к)/H2SO4(к), 120 оС, 24 ч) количество кислотных групп на поверхности увеличилось в 3 раза, а после восстановления (Н2, 800 оС) – уменьшилось в 10 раз. При окислении MWNT (HNO3(к)/H2SO4(к), 100 оС, 6 ч) содержание кислорода увеличивается с 4 до 10 масс. %. При этом частицы MWNT становятся гидрофильными и их средний размер уменьшается до 50 нм. Установлено, что восстановление GO (H2, 800 оС, 5 ч) приводит к уменьшению содержания кислорода до 3% ат. и увеличение размеров частиц до 100 нм, что может быть связано со сворачиванием листов графена в глобулы. При иммобилизации комплексообразователей – глицидола, EDTA, L1 и L2, необходимых для образования комплексов с радионуклидами, наибольшая степень прививки глицидола наблюдается для ND и MWNT, которая определялась по увеличению содержания кислорода на их поверхности, составляющее 33 и 23 % ат., соответственно. Это объясняется полимеризацией глицидола на поверхности УН и созданием дендримерной сетки из гидроксильных групп. В результате были получены и подробно проанализированы УН с восстановленной, окисленной и аминированной поверхностью, а также с привитыми хелатирующими молекулами EDTA и производных аминокислот, необходимых для проведения последующих сорбционных исследований. Изучение возможности закрепления радионуклидов на изучаемых модифированных УН проводили на примере технеция, как наиболее широко используемого радионуклида в ядерной медицине. Исследовали сорбцию 99Tc в двух формах: пертехнетат-анион TcO4- и Tc+4,+5 образующейся при восстановлении пертехнетат-аниона в экспериментальных условиях. Установлено, что сорбция из слабокислых растворов (pH = 1) для исследуемых УН незначительна (до 5%). Дальнейшие исследования проводились в растворах с pH = 6, что является физиологически приемлемыми условиями. Изучена сорбция пертехнетат-аниона в зависимости от времени, концентрации УН. Показано, что при увеличении содержания ND степень извлечения пертехнетат-аниона увеличивается логарифмически. Определены коэффициентов распределения пертехнетат-аниона на модифицированных ND. Адсорбция технеция на аминированных, гидрированных наноалмазах и конъюгате с ЭДТА описывается моделью Ленгмюра, что указывает на постепенное монослойное заполнение поверхности. Адсорбция на ND-glycidol описывается моделью Фрейндлиха, что свидетельствует о гетерогенности поверхности, образованной полимерной дендримерной «шубой» и разной энергии связи адсорбционных центров с пертехнетат-анионом. Установлено, что сорбция пертехнетат-аниона из растворов зависит от его концентрации. Так, при концентрации 10-4 М степень извлечения пертехнетат-аниона была менее 10% для всех исследованных образцов. При концентрации пертехнетат-аниона 10-5 М она составила 56%. Меньшую емкость для пертехнетат-аниона имели образцы в ряду ND-H (47%), ND-NH2 (42%), ND-L2 (32%), ND-L1 (23%). Графен, нанотрубки и их модификации показали низкую адсорбционную способность к пертехнет-аниону. При концентрации технеция 10-6 M образцы в порядке уменьшения адсорбционной способности можно расположить в следующей последовательности: ND-EDTA (72%) > ND-L1 (66%) = ND-L2 (67%) => ND-H (66%) > ND-NH2 (49%) > ND-glycidol (35%). Показано, что остальные УН практически не адсорбировали пертехнетат-анион. Таким образом, было показано, что при увеличении содержания ND степень извлечения пертехнетат-аниона увеличивается логарифмически. Данная адсорбционная емкость на два порядка превышает необходимую емкость для подготовки препарата на основе технеция при проведении диагностики методом ОФЭКТ (99mTc = 10-8 М). При изучении адсорбции технеция (IV, V) на УН удалось достичь количественной адсорбции до 99 % для 4 образцов УН: ND-COOH, ND-L2, GO и MWNT-H. Для остальных образцов сорбция технеция достигала 20-60%. Показано, что размеры Tc@ND-COOH и Tc@GO находились на уровне 50-60 нм, тогда как для Tc@MWNT-COOH они увеличивались с 50 до 200-500 нм. В результате в качестве наиболее подходящего углеродного наноматериала для пертехнетат-аниона выбран детонационный наноалмаз, проявляющий лучшую сорбционную способность. Для технеция (IV, V) оптимальными носителями можно считать окисленный наноалмаз и оксид графена, которые имеют размеры частиц менее 100 нм.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Быстрое развитие ядерной медицины в области визуализации в организме и направленной доставки лекарственных веществ ставит задачи поиска новых эффективных наноматериалов. Углеродные наноматериалы (УНМ) - наноалмазы (DND), графен и его оксид (GO), углеродные нанотрубки (CNT) - обладают уникальными структурами и физико-химическими свойствами для широкого спектра их применения в медицине. Использование УНМ открывает новые возможности одновременного выявления и лечения социально значимых заболеваний. При этом сведения об использовании УНМ в качестве носителей для целевой доставки радиоизотопов для диагностики и лечения в ядерной медицине в составе радиофармпрепаратов (РФП) ограничены. Основными задачами проекта в отчетный период являлось получение и систематическая характеризация различных образцов УНМ и изучение сорбции радионуклидов Ra, Ac, Ga, Y, Bi на полученных образцах. Выбор изотопов обусловлен не только широким спектром их применения в ядерной медицине, но и различием их химических свойств и их различным биораспределением. В работе использовали исходные образцы следующих УНМ: порошок DND (СКТБ «Технолог», Россия), водная суспензия GO и порошок MWCNT («Нанотехцентр», Тамбов, Россия). Образцы УНМ с модифицированной поверхностью получали в результате реакций окисления, гидрирования, хлорирования и аминирования, а также прививки комплексонов EDTA, DTPA, DOTA, EGTA и производных аминокислот на аминированную поверхность УНМ при карбодиимидном синтезе. Прививку комплексонов характеризовали методом ИК-спектрометрии. Исследование структуры, состава и свойств образцов УНМ проводили при использовании современных физико-химических методов анализа. Морфологию частиц УНМ определяли методом ПЭМ высокого разрешения. Для определения примесных элементов в УНМ использовали методы ИСП-МС и гамма-активационного анализа. Определение элементного состава поверхности УНМ выполняли методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС). Гидродинамический диаметр частиц УНМ в гидрозолях определяли методом динамического рассеяния света. Для определения кислотно-функциональных групп на поверхности УНМ использовали потенциометрическое титрование; для оценки количества аминогрупп – реакцию с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой с предварительной калибровкой по глицину. Установлено, что использованные в работе УНМ значительно отличались как по структуре, так и по составу. DND представляют собой сферические частицы, GO – наночастицы плоского строения, а MWCNT имеют нитевидную структуру микронных размеров с внутренней полостью. Удельная поверхность DND, GO и MWCNT по методу БЭТ: 240, 700 и 160 м2/г соответственно. Образцы УНМ отличались по содержанию примесей, при этом наиболее очищенным оказался DND (примеси - 1,4 мг/г). Эффективность выполненной модификации образцов УНМ подтверждали по изменению элементного состава их поверхности. Изучали сорбционное поведение Ra, Ac, Ga, Y, Bi на различных УНМ, в том числе определено влияние различных факторов на устойчивость конъюгатов УНМ с сорбированными радионуклидами. Для этого использовали различные изотопы исследуемых элементов: 223,226Ra, 228Ас, 68Ga, 90Y, 207Bi. Содержание исследованных изотопов в образцах определяли методом гамма-спектрометрии. Изучение сорбции Ra, Ас, Ga, Y, Bi в водном растворе или фосфатно-солевом буфере (ФБ) проводили на суспензиях УНМ с содержанием 1 мг/мл. Эксперименты проводили при 25 или 37 0С. После сорбции фазы разделяли центрифугированием в течение 20 мин при 18000 g. Десорбция изучаемых радионуклидов проводилась путём контакта сорбента с изучаемым радионуклидом с физиологическим раствором, ФБ или ФБ, содержащим 40 г/л бычьего сывороточного альбумина (БСА). Ra(II), имеющий альфа-излучающий изотоп 223Ra, который применяется в терапии костных метастаз, как установлено в исследованиях, из всех изученных УНМ сорбируется только на GO (60 %) и DND с иммобилизованными производными аминокислот (10 %), а его десорбция при контакте с физиологическим раствором с GO составляет до 70 %. Полученные данные указывает на трудности использования изученного конъюгата Ra(II)@GO как РФП. Для увеличения сорбции Ra(II) необходимо использовать УНМ с предварительно привитыми лигандами, образующими устойчивые соединения с Ra(II). Показано, что сорбция Ac(III) (изотоп которого 225Ac применяется для таргетной альфа-терапии в ядерной медицине) на всех изученных УНМ характеризуется быстрой кинетикой (равновесие достигается в течение первых 5 мин), при этом сорбция на исходных образцах УНМ близка к количественной (не менее 95 %), а на окисленных или восстановленных УНМ сорбция снижается до 60 %. С исходных УНМ в ФБ с БСА за 10 мин десорбируется до 50 % Ас(III), тогда как с модифицированных образцов десорбция Ас(III) составляет не более 5 % за 30 мин. Можно предположить, что на исходном DND реализуется два механизма сорбции – прочное химическое связывание Ас(III) с карбоксильными группами и физическая адсорбция на других группах поверхности DND. В предварительно окисленном DND эти группы замещаются на карбоксильные, что положительно сказывается на прочности связывания, что в свою очередь определяет малую десорбцию Ас(III), тогда как сорбция уменьшается за счёт снижения вклада физической адсорбции. Взаимодействие Ас(III) с MWCNT, вероятно, реализуется по двум механизмам: его сорбция внутри полостей трубок и физическая сорбция на частицах катализатора на концах трубок. При гидрировании трубок примесь катализатора удаляется, чем можно объяснить одновременное снижение сорбции и десорбции Ас(III). Изотопы 67Ga и 68Ga широко используются в ядерной медицине для визуализации опухолей. При изучении сорбции Ga(III) установлено, что изотерма сорбции на DND, DND-COOH и GO-H в ФБ описывается уравнением Генри в диапазоне равновесных концентраций Ga(III) 4·10^(-14) – 10^(-5) M. Константы Генри для DND-СООН, DND и GO-Н составляют 2,62, 1,11 и 0,65 л/г соответственно, что говорит о доминирующей роли карбоксильных групп в процессе связывания с Ga(III). DND и DND-СООН сорбируют Ga(III) на 85 и 95 % при соотношении Т/Ж 50 мкг/мл, а десорбция 68Ga с этих образцов в среде БСА не более 30 % за 1 ч. В случае GO сорбция достигала 30 % за 5 мин и медленно увеличивалась до 50 % за 2 ч, а восстановление GO привело к снижению сорбции до 10 %. Для образцов GO и GO-Н наблюдалась полная десорбция Ga(III) в БСА уже за 15 мин, что, вероятно, указывает на физическую сорбцию Ga(III) на поверхности GO, в которую основной вклад вносит наличие кислородных групп. Для образцов MWCNT и MWCNT-Н величина сорбции Ga(III) не превышала 20 % и наблюдались те же закономерности, что и для образцов GO и GO-H. 90Y является чистым бета-эмиттером, и нашёл широкое применение в терапии, где, как правило, связывается с пептидами или антителами. Полученные данные по кинетике сорбции Y(III) для всех изученных УНМ показали, что равновесные условия достигаются не менее чем за 24 ч. При изучении изотермы сорбции Y(III) в ФБ в диапазоне концентраций Y(III) 6·10^(-10) – 2·10^(-5) M на примере DND показано, что сорбция в равновесных условиях достигает 99 % и описывается уравнением Генри с константой 2,76 л/г. Сорбция Y(III) на DND-COOH проходит также количественно (98 %) за то же время. Показано, что сорбция на GO составила 93 %, а при восстановлении GO сорбция снизилась до 48 %. MWCNT показали слабую способность к сорбции Y(III) и адсорбировали 46%. Модификация MWCNT в процессе гидрирования приводит к увеличению степени сорбции Y(III) до 79%. При этом десорбция Y(III) в среде ФБ с БСА с DND, DND-COOH и MWCNT составляет не более 17 % за 1 ч. Для GO и GO-Н десорбция составила в аналогичных условиях 48 и 36% соответственно. Для MWCNT-Н десорбция была наименьшей – 14%, что может быть связано с прочным удерживанием Y(III) в каналах нанотрубок. Сорбции Y(III) на DND и DND-COOH предположительно определяется двумя механизмами – хемосорбцией с образованием комплексов Y(III) с кислородсодержащими группами (-COOH, -OH) на поверхности DND и физическую адсорбцию за счет электростатического притяжения между Y(III) и противоположно заряженными группами на поверхности. Cорбция Y(III) на GO и MWCNT может идти по двум механизмам: быстрая сорбция на внешних поверхностях и медленная сорбция во внутренних каналах MWCNT и межслоевых пространствах GO, что подтверждается наименьшей степенью десорбции. Изотопы висмута 212Bi и 213Bi используются в ядерной медицине в таргетной альфа-терапии раковых опухолей. Нами было определено, что сорбция Bi(III) на всех изученных УНМ составляет от 80 до 100 %, а сорбционное равновесие для образцов DND, DND-COOH, GO-H и MWCNT достигалось за 5 минут, для образцов GO и MWCNT-H – за 30 минут. Обнаружено, что изотерма сорбции Bi(III) при его концентрациях 10^(-9) – 10^(-5) M на образцах DND, DND-COOH и GО-Н в ФБ описывается уравнением Генри, а константы Генри для DND и DND-COOH составляют около 2,33 л/г, а для GО-Н - 2,15 л/г. Таким образом, наличие кислородсодержащих групп на поверхности УНМ не оказывает решающего влияния на эффективность сорбции Bi(III). Наибольшую устойчивость к десорбции Bi(III) показали DND, DND-COOH и GO. В растворе БСА в ФБ при 37 ˚С за 5 ч c DND десорбируется не более 4 % Bi(III), а за 18 ч – до 20 %. Таким образом, в отчетный период показана перспективность применения УНМ, прежде всего DND и DND-COOH, содержащих на поверхности карбоксильные группы, как носителей для медицинских изотопов Ac, Ga, Y, Bi. Для подтверждения эффективности этих сорбентов для целей ядерной медицины необходимо продолжить исследования в рамках проекта. Предварительными исследованиями по изучению сорбции Ra(II), Y(III) и Bi(III) на примере DND, модифицированного путём прививки DTPA, DOTA, EDTA и EGTA, было показано, что эти материалы не имеют преимуществ перед изученными в работе УНМ в целях получения новых конъюгатов с исследованными нуклидами для целевой доставки для диагностики и лечения социально значимых заболеваний. Заявленный в проекте план научных исследований на 2019 год выполнен полностью. В отчетный период получены научные результаты в соответствии с заявкой. Принята в печать 1 статья в журнале «Радиохимия» (английская версия «Radiochemistry»), индексируемом в базах данных Web of Science и Scopus. Кроме того, подготовлена и прошла рецензирование 1 статья в журнале «Diamond and Related Materials» из квартиля Q1, входящий в базы цитирования Web of Science и Scopus, однако на дату подачи настоящего отчета заключение редакции о принятии статьи в печать не получено. Результаты проекта рассмотрены на 2 международных конференциях: 14th International Conference Advanced Carbon Nanostructures ACNS’2019 (Saint-Petersburg, Russia, July 1-5, 2019); 30th International Conference on Diamond and Carbon Materials (Melia Lebreros, Seville, Spain, September 8-12, 2019).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью настоящего проекта является разработка научных основ создания радиофармпрепаратов (РФП) на основе углеродных носителей для эффективных методов диагностики и лечения социально-значимых заболеваний. В заключительный год реализации проекта были проведены исследования, направленные на изучение закономерностей распределения по органам лабораторных животных наиболее перспективных из синтезированных в работе конъюгатов с использованием углеродных наноматериалов с сорбированными на них изотопами. В экспериментах использовались в качестве носителей коммерческий наноалмаз (ND) и наноалмаз с окисленной поверхностью (ND-COOH) и радионуклиды 99mTc, 207Bi, 228Ac. Одна из главных задач состояла в изучении устойчивости конъюгатов выбранных радионуклидов с ND и ND-COOH в модельных биологических средах для определения возможности дальнейшего введения конъюгатов в кровь. Было установлено, что в средах, имитирующих рН желудка (HCl с рН 1,2) и верхнего отдела кишечника (ацетатный буфер с рН 4,5) десорбция всех изучаемых радионуклидов значительна как для ND, так и для ND-COOH. В то же время, в модельных средах крови (фосфатно-солевом буфере и эмбриональной телячьей сыворотке) десорбция оказалась минимальной (менее 10 % за 2 ч) для всех выбранных радионуклидов. Таким образом, показано, что оптимальным способом введения изучаемых конъюгатов является введение в кровь, при котором все конъюгаты будут устойчивы, а введение их перорально невозможно. По результатам данных экспериментов для опытов in vivo были выбраны конъюгаты 99mTc@ND и 99mTc@ND-COOH. Следующим этапом исследований было определение цитотоксичности ND и ND-COOH с целью подтверждения безопасности введения в кровь их в экспериментально определённых оптимальных количествах. Эксперимент проводили в ходе стандартного МТТ-теста, в котором определяется полулетальная доза (LC50) здоровых и раковых клеток. Содержание ND и ND-COOH в растворах составляло от 1 до 500 мкг/мл. В результате опытов с мононуклеарными клетками и клетками В-линейного лимфобластного лейкоза (по три донора клеток в каждом случае) установлено, что LC50 для ND и ND-COOH составляет более 500 мкг/мл, что указывает на отсутствие собственной токсической нагрузки выбранных наноматериалов на клетки организма при введении в кровь достаточных для максимальной сорбции радионуклидов количеств – 100 мкг. Таким образом, показано, что уничтожение клеток может происходить только за счёт радиационного воздействия радионуклидов, сорбированных на ND или ND-COOH. В проекте также исследовали биораспределение конъюгатов 99mTc@ND и 99mTc@ND-COOH в организме лабораторных мышей. Для этого конъюгаты в растворе фосфатно-солевого буфера вводили мышам путём инъекции в хвостовую вену, а также контрольной группе мышей вводили образец сравнения, содержащий 99mTc без наночастиц. Через 1 или 6 ч проводили эвтаназию животных, после чего их препарировали и измеряли содержание 99mTc в отдельных органах. Было обнаружено, что избирательное накопление 99mTc в каких-либо органах отсутствует. Кроме того, показано, что распределение 99mTc по органам и скорость выведения из организма значительно отличаются для образца с ND и ND-COOH и образца сравнения. Такое различие в распределении объясняется тем, что 99mTc(IV), сорбированный на ND или ND-COOH, прочно удерживается на сорбенте, и его распределение определяется распределением самого носителя. Таким образом, это подтверждает сделанный нами ранее вывод о том, что конъюгаты 99mTc@ND и 99mTc@ND-COOH являются устойчивыми в среде организма при их введении в кровь. Также изучено содержание конъюгатов в крови от времени после введения в организм мышей, и при этом было установлено, что содержание 99mTc значительно отличается для образца с частицами носителя и без них, что также подтверждает устойчивость 99mTc@ND и 99mTc@ND-COOH. Таким образом, в ходе завершающих проект исследований среди всех изученных УНМ и радионуклидов были выбраны оптимальные коньюгаты - на основе ND или ND-COOH с сорбированным 99mTc(IV). Продемонстрирована высокая устойчивость данных конъюгатов как in vitro, так и in vivo. Таким образом, данные конъюгаты являются перспективными для дальнейшего применения в составе радиофармпрепаратов.