Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения работ по проекту осуществлен подбор и синтез имидазолиевых ионных жидкостей для дальнейшего их использования в составе конъюгатов с лекарственными препаратами: бромида 1-(10-карбоксидецил)-3-метилимидазолия, тетрафторбората 1-(10-карбоксидецил)-3-метилимидазолия, гексафторфосфата 1-(10-карбоксидецил)-3-метилимидазолия, бромида 1-(11-гидразинил-11-оксоундецил)-3-метилимидазолия. В качестве лекарственных препаратов выбраны противораковые препараты митоксантрон и доксорубицин, синтезированы их ионные конъюгаты: конъюгат митоксантрона с 4 остатками тетрафторбората 1-(10-карбоксидецил)-3-метилимидазолия (MX-IL-BF4), конъюгат доксорубицина с тетрафторборатом 1-(10-карбоксидецил)-3-метилимидазолия (DOX-IL-BF4), конъюгат доксорубицина с бромидом 1-(11-гидразинил-11-оксоундецил)-3-метилимидазолия (DOX-IL2-Br). Структуры и чистота всех синтезированных веществ подтверждены методами спектроскопии ЯМР 1H, 13C, 19F и 31P, а также масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS). Определены температуры плавления синтезированных ионных жидкостей. Ионные конъюгаты при комнатной температуре представляли собой масла и обладали достаточной растворимостью в воде. Таким образом, эти соединения не должны проявлять полиморфизма, свойственного кристаллическим лекарственным препаратам. В качестве систем для изучения биологической активности синтезированных ионных конъюгатов выбраны нормальные и злокачественные линии клеток человека: 3215 LS (фибробласты человека), FRSN (мезенхимные стволовые клетки крайней плоти человека), M-FetMSC (мезенхимные стволовые клетки из мышцы конечности эмбриона человека), Colo 320HSR (карцинома толстой кишки человека), CaCo-2 (колоректальная аденокарцинома человека). В качестве метода анализа биологической активности выбран метод MTS, который позволяет оценить цитотоксичность веществ. Согласно оценке цитотоксичности ионных конъюгатов митоксантрона и доксорубицина в сравнении с исходными лекарственными препаратами и ионными жидкостями, цитотоксичность конъюгата митоксантрона MX-IL-BF4 была сравнима с цитотоксичностью исходного дигидрохлорида митоксантрона и значительно превосходила цитотоксичность ионных жидкостей, в то время как конъюгат доксорубицина DOX-IL-BF4 проявлял намного меньшую цитотоксичность, чем исходный гидрохлорид доксорубицина. Следует отметить, что конъюгат митоксантрона также сохранял способность связываться с ДНК. Определены масс-спектрометрические пределы обнаружения конъюгата митоксантрона и дигидрохлорида митоксантрона. Снижение предела обнаружения конъюгата митоксантрона на порядок в сравнении с исходным лекарственным препаратом позволило методом ESI-MS изучить накопление конъюгата в образцах, содержащих 100 клеток. Данные результаты свидетельствуют о перспективности применения ионных конъюгатов лекарственных препаратов для изучения их накопления и активности на уровне отдельных клеток. Проведено аналитическое исследование фундаментальных направлений в области применения ионных жидкостей в биологии и медицине. Его результаты опубликованы в статье «Fundamental importance of ionic interactions in the liquid phase: A review of recent studies of ionic liquids in biomedical and pharmaceutical applications» в журнале Journal of Molecular Liquids (doi: 10.1016/j.molliq.2018.09.025). Результаты работ по проекту представлены в виде устных докладов на IV междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической, биологической химии и фармацевтике (Россия, Крым, Новый Свет) и конференции Frontiers in Chemistry 2018 (Армения, Ереван), а также в виде постерного доклада на конференции ChemTrends-2018 (Россия, Москва).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе работ по проекту синтезированы ионные жидкости (ИЖ) на основе противопротозойного и противомикробного препарата метронидазола. В чистом виде выделены бромид 1-(2-гидроксиэтил)-2,3-диметил-5-нитро-1H-имидазолия и бромид 3-(2-карбоксиэтил)-1-(2-гидроксиэтил)-2-метил-5-нитро-1H-имидазолия. Структуры и чистота полученных веществ подтверждены методами спектроскопии ЯМР. В режиме реального времени с использованием 3D-микроскопа 3D Cell Explorer (NanoLive), оснащенного флуоресцентной приставкой и CO2-камерой, изучено воздействие ионного конъюгата митоксантрона (3,3'-(((((((5,8-дигидрокси-9,10-диоксо-9,10-дигидроантрацен-1,4-диил)бис(азандиил)) бис(этан-2,1-диил))бис((11-(1-метил-1H-имидазол-3-иум-3-ил)ундеканоил)азандиил)) бис(этан-2,1-диил))бис(окси))бис(11-оксоундекан-11,1-диил))бис(1-метил-1H-имидазол-3-иум-3-ил) тетракис(тетрафторборат), MX-IL-BF4) на отдельные человеческие фибробласты; показано, что при использовании концентраций, превышающих IC50 конъюгата, видимые признаки цитотоксического стресса наблюдаются уже через 15 минут инкубации. Также в режиме реального времени посредством детекции флуоресценции продемонстрировано накопление митоксантрона в клетках HEK293T. Впервые изучена взаимосвязь структурирования среды и цитотоксичности бинарных смесей, включающих имидазолиевые ИЖ с боковыми алкильными цепями различной длины (этил, бутил, гексил) и разными анионами (хлорид, тетрафторборат, ацетат, гидросульфат), а также хлорид тетрабутиламмония и хлорид 1-бутилпиридиния. В ходе работы определены 24-ч IC50 индивидуальных ИЖ и их бинарных смесей на клетках Colo 320HSR. Продемонстрировано, что в большинстве изученных смесей ИЖ проявлялся антагонистический эффект (экспериментальные значения IC50 были выше предсказанных). Исследование смесей ИЖ и воды методом FE-SEM (field emission scanning electron microscopy, полевая эмиссионная сканирующая электронная микроскопия) выявило микроструктурирование среды, которое, предположительно, является одним из факторов, влияющих на цитотоксичность. Полученные результаты опубликованы в статье «Assessing possible influence of structuring effects in solution on cytotoxicity of ionic liquid systems» в журнале Journal of Molecular Liquids (doi: 10.1016/j.molliq.2019.111751). Изучены фитотоксичность и цитотоксичность хлоридов и ацетатов железа, никеля, меди, родия и палладия. Впервые продемонстрировано чрезвычайно быстрое воздействие хлорида родия (III) в концентрациях выше 600 µM на горох посевной (Pisum sativum), люпин узколистный (Lupinus angustifolius) и огурец обыкновенный (Cucumis sativus), приводящее к гибели растений в течение суток; эффект зависел от стадии развития, на которой произошел контакт с солью металла. Показано, что высокая фитотоксичность RhCl3 не связана с изменением pH среды. Растворимые соли других металлов и [Rh(OAc)2]2 проявили меньшую токсичность. Ni(OAc)2 в значительной степени подавлял накопление биомассы, в то время как Fe(OAc)2 и Pd(OAc)2 оказывали наименьшее токсическое воздействие. Все изученные соли проявляли схожее ингибирующее влияние на рост корня. Показано, что металлы во всех случаях вызывали дефекты морфологии и преимущественно накапливались в корнях растений. При концентрации 1000 µМ все соли подавляли рост корня и побегов, а также, за исключением Fe(OAc)2 и Pd(OAc)2, подавляли формирование боковых корней. CuCl2, NiCl2, RhCl3 и [Rh(OAc)2]2 вызывали некроз листьев. Несмотря на высокую фитотоксичность, RhCl3 проявлял более низкую цитотоксичность по отношению к человеческим фибробластам (линия 3215 LS), чем изученные соли других металлов. Также низкой цитотоксичностью обладали FeCl3 и Fe(OAc)2, в то время как соли никеля и меди проявляли значительную цитотоксичность. Эти данные позволяют предположить, что введение никеля и меди в состав ионных жидкостей позволит повысить их цитотоксичность. Полученные результаты опубликованы в статье «Evaluation of phytotoxicity and cytotoxicity of industrial catalyst components (Fe, Cu, Ni, Rh and Pd): A case of lethal toxicity of a rhodium salt in terrestrial plants» в журнале Chemosphere (doi: 10.1016/j.chemosphere.2019.02.043). Показана возможность повышения цитотоксичности биологически активных веществ посредством винилирования и дейтерирования. Полученные результаты опубликованы в статье «Direct synthesis of deuterium-labeled O-, S-, N-vinyl derivatives from calcium carbide» в журнале Synthesis (doi: 10.1055/s-0037-1611518). Результаты работ по проекту представлены в виде устных докладов на Всероссийской конференции «Взаимосвязь ионных и ковалентных взаимодействий в дизайне молекулярных и наноразмерных химических систем» (ChemSci-2019, Россия, Москва, 13-17 мая 2019 г.), 8-м Международном конгрессе по ионным жидкостям COIL-8 (Китай, Пекин, 13-17 мая 2019 г.) и 4-й Международной конференции по применению ионных жидкостей в технологиях разделения и очистки ILSEPT (Испания, Сиджес, 8-11 сентября 2019 г.).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе работ по проекту проведен синтез ионных жидкостей (ИЖ), содержащих коричную кислоту. Коричная кислота выбрана как соединение с потенциально высокой биологической активностью, но низкой биодоступностью из-за слабой растворимости в воде (как самой коричной кислоты, так и ее солей). В данном случае применение стратегии АФИ-ИЖ (активный фармацевтический ингредиент – ионная жидкость) для улучшения растворимости и, соответственно, биодоступности вещества представляется весьма перспективным. В качестве катионных центров использованы имидазолий, пиридиний и холиний, в качестве анионов – галогениды или циннамат. При выборе структур АФИ-ИЖ изучена возможность варьирования трех параметров: структуры катионного центра, структуры линкера и прочности сшивки. Для ИЖ на основе имидазолия и пиридиния рассмотрены линкеры двух типов: «мягкие» (алкильные цепи различной длины), допускающие свободное вращение вокруг связей, а также пространственное сближение субстрата и катионного центра, и «жесткие» (ароматические), препятствующие свободному вращению вокруг связей и предотвращающие сближение функциональных частей катиона. В качестве «мягких» линкеров предложены алкильные цепи, содержащие 2, 4, 5 и 6 атомов углерода. В качестве «жесткого» линкера – пара-ксилилендихлорид. Также рассмотрен параметр прочности сшивки субстрата с линкером. Для всех предложенных ИЖ проведен ретросинтетический анализ, и на его основании подобраны схемы синтеза. Всего синтезировано и охарактеризовано девять АФИ-ИЖ, содержащих коричную кислоту. На примере метансульфоната этил(2-гидроксиэтил)диметиламмония продемонстрирована возможность успешного применения ионных жидкостей в качестве фиксирующих агентов для исследования клеток методом электронной микроскопии без дополнительной пробоподготовки. Работы велись на культуре клеток 3215 LS (фибробласты человека). В ходе эксперимента с помощью наноманипулятора, оснащенного вольфрамовой иглой, удалось напрямую захватить отдельные клетки в камере электронного микроскопа и затем перенести их в пробирки. Изучены цитотоксические эффекты бинарных смесей имидазолиевых ИЖ (хлорид 1-этил-3-метилимидазолия, хлорид 1-бутил-3-метилимидазолия, хлорид 1-гексил-3-метилимидазолия, тетрафторборат 1-бутил-3-метилимидазолия, ацетат 1-бутил-3-метилимидазолия) с противораковыми препаратами митоксантроном и доксорубицином на линии колоректальной аденокарциномы человека CaCo-2. Получены значения 24-h IC50 для индивидуальных веществ и показано, что исследованные вещества вызывают некротическую гибель клеток. Из 10 исследованных смесей ИЖ с лекарственными препаратами четыре продемонстрировали синергизм (митоксантрон / хлорид 1-этил-3-метилимидазолия, доксорубицин / тетрафторборат 1-бутил-3-метилимидазолия, митоксантрон / тетрафторборат 1-бутил-3-метилимидазолия) или антагонизм (митоксантрон / ацетат 1-бутил-3-метилимидазолия). Методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) продемонстрирована микроструктурированность этих смесей, а методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) показано формирование сильных взаимодействий между лекарством и ИЖ в некоторых смесях. Полученные результаты опубликованы в статье Synergistic/antagonistic cytotoxic effects in mixtures of ionic liquids with doxorubicin or mitoxantrone в журнале Journal of Molecular Liquids (doi: 10.1016/j.molliq.2020.114870). В режиме реального времени с использованием 3D-микроскопа 3D Cell Explorer (NanoLive), оснащенного флуоресцентной приставкой и CO2-камерой, изучено накопление митоксантрона в клетках HEK293T (эмбриональная почка человека) в присутствии тетрафторбората 1-бутил-3-метилимидазолия. Сигнал митоксантрона был детектирован как в цитоплазме, так и в клеточных ядрах. Показано, что в ходе наблюдения морфология клеток начинает меняться. Также исследовано накопление доксорубицина в клетках HEK293T. Результаты работ по проекту представлены в виде устного доклада на VI междисциплинарной конференции «Молекулярные и биологические аспекты химии, фармацевтики и фармакологии» (Россия, Нижний Новгород, 27-30 сентября 2020 г.).