Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основные результаты, полученные по итогам первого года выполнения проекта, можно разделить на следующие разделы: 1) Начат сбор коллекции ГКР спектров лекарств и основных компонентов мочи с использованием стандартного ГКР-активного материала (НЧ серебра). На данный момент подробно изучено 10 антибиотиков различных классов и три компонента мочи/крови (мочевина, креатинин и мочевая кислота). Описаны условия регистрации спектров, а также влияние уровня рН. Проведена оценка влияния основных компонентов мочи на возможность ГКР детектирования антибиотиков в моче и уровень фонового сигнала. Предложены способы подавления фонового сигнала. Проведены предварительные исследования по детектированию антибиотиков с использованием разбавления мочи и изменения её рН в качестве простых способов пробоподготовки. 2) Разработана методика совмещения спектроскопии ГКР с жидкость-жидкостной экстракцией для количественного определения сульфаниламидных антибиотиков (сульфадиметоксина и сульфаметоксазола) в моче. Подобраны оптимальные условия экстракции лекарства из водных сред (растворитель, рН и время экстракции) и его ГКР детектирования. Получены зависимости ГКР сигнала от концентрации лекарства в образцах реальной мочи здоровых и больных волонтеров для диапазона концентраций, актуального для терапевтического лекарственного мониторинга. 3) Предложено использование силикагеля с молекулярными отпечатками для улучшения селективности ГКР детектирования креатинина в моче. Дополнительно предложено использование данного материала для очистки мочи от креатинина для снижения уровня фонового сигнала при детектировании других аналитов. 4) Начаты исследования по оценке аналитической эффективности ГКР-активных медных наноструктур: - Проведено сравнение усиливающих свойств медных, серебряных и золотых НЧ относительно стандартного аналита, показана конкурентоспособность и перспективность медных НЧ в ГКР анализе. - Предложено встраивание медных НЧ в матрицу гидроксида алюминия для защиты от окисления. Проведено изучение химической стабильности, а также усиливающих свойств полученного композита с использованием как стандартного аналита, так и ряда лекарств. - Получен ГКР-активный композит на основе микросфер карбоната кальция со встроенными НЧ меди, обладающий повышенной химической стабильностью (месяцы). Разработана и протестирована методика детектирования цефтриаксона и сульфадиметоксина с использованием полученного материала.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1) Определены условия, при которых достигается минимальный уровень фонового ГКР сигнала от основных компонентов мочи. Для этого проводили ГКР измерения при изменении величины рН и степени разбавления мочи, а также возбуждение ГКР сигнала с помощью лазеров с различными длинами волн. Установлено, что в кислой и щелочной среде основными фонообразующими компонентами мочи являются уробилин и креатинин, соответственно. В нейтральной среде разбавление приводит к значительному снижению интенсивности ГКР сигнала компонентов мочи, но не влияет на профили спектров. Также найдено, что фоновый сигнал мочи в основном интенсивнее в кислой и щелочной среде. Таким образом, прямое детектирование лекарств возможно в нейтральной среде при разбавлении мочи. 2) Разработан протокол ГКР определения цефалоспориновых антибиотиков в моче. Ключевым этапом протокола является предварительная обработка мочи перед анализом для минимизации фонового сигнала. Обработка включает (i) извлечение компонентов мочи с использованием геля гидроксида алюминия и (ii) настройку уровня рН очищенного образца до 1.5. Потенциал протокола для количественного определения антибиотиков в моче был показан на примере пяти представителей класса цефалоспоринов: цефазолин, цефоперазон, цефотаксим, цефтриаксон и цефуроксим. Градуировочные зависимости четырех антибиотиков (за исключением цефуроксима) охватывают концентрации, необходимые для определения этих антибиотиков в моче пациентов во время лечения (50‒500 мкг/мл). Величина погрешности анализа (<20%) и пределы количественного обнаружения для этих антибиотиков демонстрируют применимость протокола для надежного количественного определения при ТЛМ. Детектирование цефуроксима в моче по разработанному протоколу недостаточно чувствительно, позволяя только качественный анализ. Также исследована стабильность геля во времени и воспроизводимость синтеза (RSD <5%) и оценено негативное влияние протокола предварительной обработки и его ограничений. 3) Разработан протокол синтеза медных наночастиц с использованием микроволнового нагрева. Исследовано влияние параметров синтеза на ГКР эффективность полученных медных наночастиц и определены их оптимальные величины: (i) количество восстановителя (гидразин) и стабилизатора (цитрат натрия), (ii) природа аниона в соли меди (нитрат, сульфат, хлорид, ацетат), (iii) временная стабильность медных наночастиц. Несмотря на ограниченную стабильность медных наночастиц во времени, высокая воспроизводимость (RSD <8%) и простота синтеза позволяют использовать свежеприготовленные медные наночастицы для ГКР анализа. Способность медных наночастиц усиливать ГКР сигнал сравнили с таковой для серебряных и золотых наночастиц. Медные наночастицы показали лучшие результаты при детектировании цефтриаксона благодаря более высокой реакционной способности и способности образовывать стабильные комплексы с карбоксильной группой аналита, что увеличивает вероятность переноса заряда и повышает усиление КР сигнала. Разработан протокол ГКР анализа цефтриаксона в моче с использованием полученных медных наночастиц, который требует не более 10‒15 минут и включает синтез медных наночастиц, их смешивание с разбавленным образцом мочи (подавление фонового сигнала) и агрегирующим агентом и дальнейшие ГКР измерения. Аналитические показатели, полученные по градуировочной зависимости, продемонстрировали чувствительность, точность и надежность анализа сравнимые с таковыми для серебряных наночастиц. 4) Разработана методика ТСХ разделения аналита и компонентов мочи с последующим ГКР детектированием. В качестве аналитов использовали антибиотики фторлинолонового ряда (ципрофлоксацин, энрофлоксацин, пефлоксацин, норфлоксацин), ГКР спектры которых в щелочной среде обладают максимальной интенсивностью и схожестью профилей благодаря небольшим различиям в структуре. ТСХ разделение при одинаковых условиях (пластина, подвижная фаза, время разделения) показало эффективность отделения всех использованных лекарств от матрицы мочи и позволило устранить фоновый ГКР сигнал компонентов мочи. Также изучено влияние способа получения серебряных наночастиц на эффективность усиления КР сигнала при совмещении с ТСХ разделением. Установлено, что серебряные наночастицы, синтезированные предварительно, обеспечивают интенсивный и более воспроизводимый сигнал по сравнению с серебряными наночастицами, восстановленными in situ непосредственно на ТСХ пластине. Количественное определение в моче ципрофлоксацина с использованием разработанной методики показало увеличение погрешности измерений на 10% по сравнению с коллоидными серебряными наночастицами, что мы связываем с неоднородностью распределения серебряных наночастиц на поверхности ТСХ пластины. 5) Проведено исследование фонового ГКР сигнала плазмы крови в зависимости от типа антикоагулянта, использованного для стабилизации крови, а также от значения рН и разбавления плазмы. В кислой среде ГКР сигнал билирубина является доминирующим независимо от использованного антикоагулянта и уровня разбавления плазмы. Фоновый ГКР сигнал плазмы в нейтральной и щелочной средах обусловлен только сигналом антикоагулянта. Анализ спектров плазмы с добавкой цефтриаксона показал, что ГКР полосы аналита можно зарегистрировать только в щелочной и нейтральной средах, причём разбавление приводит к увеличению сигнала за счет уменьшения концентрации компонентов плазмы и их конкуренции с аналитом за поверхность серебряных наночастиц. Определен оптимальный для ГКР анализа антикоагулянт (цитрат натрия), поскольку он оказывает минимальное и умеренное влияние на аналитический сигнал, что позволяет разрабатывать более универсальные протоколы анализа. 6) Проведены квантово-химические исследования различных сульфаниламидных препаратов и их комплексов с кластерами серебра (20 атомов), изучены электронное строение, реакционная способность, электронные и колебательные спектры данных объектов. Исследование возбужденных состояний комплексов аналитов с кластерами серебра показало значительную вероятность переноса заряда на протонированные молекулы аналита при возбуждении полосы плазмонного резонанса кластеров в видимой области спектра. Анализ изменения электронной плотности на атомах молекул и расчет КР спектров показали, что сульфаниламидная часть протонированных антибиотиков является основным акцептором электрона при переносе заряда и происходит активация её КР полос, независимо от дополнительной функциональной группы, присоединенной через сульфонамидную связь. Таким образом, впервые экспериментально и теоретически показано, что варьирование условий регистрации ГКР сигнала позволяет генерировать одинаковые спектры структурно-родственных препаратов, что открывает возможность создания универсального протокола анализа, пригодного для определения как отдельных сульфаниламидов, так и их суммарного содержания. Также предложено объяснение влияния рН среды на ГКР спектры сульфаниламидов: отсутствие ГКР спектров в нейтральной среде связано с формированием димеров молекул за счет межмолекулярных водородных связей, которые при повышении/понижении рН разрушаются в связи с (де)протонирование молекул, приводя к взаимодействию мономеров с ГКР подложкой и возникновению ГКР сигнала.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Экспериментальные направления работы 1.1. Разработан ГКР-активный сорбент на основе оксида алюминия со встроенными наночастицами серебра (OА-СНЧ), который использован для твердофазной экстракции (ТФЭ) и ГКР определения (протокол ТФЭ-ГКР) противоопухолевого препарата метотрексата (МТК) в моче. МТК имеет сильный ГКР сигнал только в щелочной среде, что затрудняет его определение в моче из-за сильного фонового сигнала, вызванного присутствием креатинина (КРН). Применение этапа ТФЭ позволило очистить и сконцентрировать аналит, делая возможным его определение. Также, применение одного и того же материала для ТФЭ и ГКР анализа позволило упростить и ускорить процедуру анализа. Использование стадии разбавления мочи с аналитом перед проведением ТФЭ-ГКР предложено для достижения максимальной надежности анализа путем уменьшения разброса фонового сигнала между мочой, собранной в утреннее и дневное время. Дополнительно проведены физико-химические исследования для оценки влияния основных внутренних компонентов мочи (солей, мочевины, КРН) и их смесей на аналитический сигнал. Оптимизированный протокол анализа позволяет определять МТК в моче человека в диапазоне концентраций, необходимом для клинического анализа (20–300 мкг/мл), с удовлетворительной точностью (sr 11–19%), правильностью (97–104%) и пределом обнаружения (4.2 мкг/мл). Учитывая, что для анализа требуется менее 15 минут и портативный КР спектрометр, протокол является многообещающим для терапевтического лекарственного мониторинга в больницах для своевременного выявления низкого клиренса МТК и минимизации побочных эффектов терапии. 1.2. Проведено выявление основных фонообразующих компонентов плазмы крови и разработка подходов по устранению их негативного влияния на аналитический сигнал. Так в кислой среде ГКР сигнал билирубина (БРБ) является доминирующим независимо от уровня разбавления плазмы. Фоновый ГКР сигнал плазмы в нейтральной и щелочной средах отсутствует. С использованием ЦТР проведено исследование влияния каждого отдельного компонента плазмы на интенсивность аналитического сигнала в нейтральной и щелочной средах. Установлено, что в нейтральной среде только присутствие БСА существенно влияет на интенсивность сигнала ЦТР (за счет блокирования поверхности ГКР подложки), причём интенсивности сигнала ЦТР в плазме и в водном растворе БСА практически полностью совпадают (независимо от разбавления). В щелочной среде все компоненты нелинейно влияют на интенсивность сигнала, также не было выявлено конкретного компонента плазмы, ответственного за уменьшение аналитического сигнала ЦТР, что, возможно, связано с коллективным вкладом нескольких компонентов. В качестве подходов по устранению влияния компонентов плазмы на аналитический сигнал лекарств использовали: (1) варьирование рН и степени разбавления плазмы, (2) уменьшение концентрации белка плазмы путём его осаждения, (3) применение ТФЭ для отделения аналитов от компонентов плазмы. Отметим, что все подходы обеспечили значения ПрО ниже нижней границы определяемых содержаний. Хотя осаждение белков является простой методикой, данный подход требует наибольшего материала для анализа (по объему), а также продемонстрировал наименьшую правильность анализа для всех лекарств, что предположительно связано частичным захватом молекул аналита осаждаемыми белками. Для определения сульфаниламидов и МТК наибольшую эффективность продемонстрировал подход ТФЭ-ГКР с использованием ГКР-активных сорбентов на основе СаСО3 и ОА, соответственно. В случае цефалоспоринов наиболее оптимальной методикой ГКР определения является сочетание разбавления плазмы и корректировка рН при ГКР измерениях. При этом достигается наименьший расход плазмы при проведении анализа, а также обеспечивается универсальность протокола для определения трёх представителей цефалоспориновых антибиотиков (по сравнению с ТФЭ-ГКР). Для определения фторхинолоновых антибиотиков сработал только подход предварительного проведения неудерживающей ТФЭ с использованием оксида алюминия с молекулярными отпечатками КРН. 1.3. Для детектирования лекарств в слюне протестированы те же подходы, что и для плазмы крови. Разбавление и корректировка рН не позволяют провести детектирование ГКР спектров каких-либо аналитов, поскольку муцин слюны препятствует как сорбции низкомолекулярных соединений на поверхности СНЧ, так и агрегации СНЧ, необходимой для получения усиленного ГКР сигнала. Удаление муцина из слюны позволило зарегистрировать спектры только сульфаниламидов (при регистрации в кислой среде). Дополнительное удаление белков слюны осаждением сульфатом меди показало возможность детектирования спектров цефалоспоринов. Тестирование ТФЭ-ГКР и НТФЭ-ГКР методик продемонстрировало эффективность только для определения в слюне МТК (с использованием ОА-СНЧ). Для регистрации спектров фторхинолонов и сульфаниламидов использовали методику совмещения ГКР и ЖЖЭ с использованием дихлорметана и хлороформа, соответственно. Установлено, что этап ЖЖЭ помогает отделить аналит от всех высокомолекулярных компонентов слюны. 1.4. Проведено изучение адсорбции различных аналитов на поверхность медных и серебряных наночастиц (НЧ) в водных растворах. Установлено, что все изотермы адсорбции имеют тип изотерм Фрейндлиха, что согласуется с результатами, полученными при анализе профилей градуировочных зависимостей при ГКР измерениях. Данный результат объясняется тем, что адсорбция на НЧ является адсорбцией на поверхности с энергетически гетерогенными адсорбционными центрами, для которых теплота адсорбции экспоненциально зависит от степени заполнения поверхности адсорбированными молекулами. Таким образом, зависимость «сигнал–концентрация» определяется только адсорбцией аналита на поверхности НЧ и что механизм усиления КР сигнала не зависит от концентрации аналита. 2. Теоретические направления работы Проведены квантово-химические исследования для двух групп антибактериальных препаратов (фторхинолоновые и цефалоспориновые антибиотики) и для основных компонентов биожидкостей, которые обладают интенсивными ГКР спектрами (КРН, БРБ, уробилин (УБЛ)), изучены их комплексы с кластерами серебра и меди, электронное строение, реакционная способность, электронные и колебательные спектры. Сопоставление теоретических и экспериментальных результатов показало, что основной формой КРН, преимущественно участвующей в формировании ГКР сигнала, является имино таутомер. Установлено, что основной ГКР активной формой КРН при использовании длинноволнового возбуждающего излучения (>633 нм) является имино таутомер, в то время как протонированный КРН играет ключевую роль при использовании коротковолнового лазерного излучения. Согласно экспериментальным данным изменение длины волны возбуждающего излучения приводит к существенному изменению профиля ГКР спектра БРБ. В результате расчетов установлено, что при увеличении энергии фотонов происходит существенный внутримолекулярный перенос заряда на пиррольные фрагменты, которые участвуют в формировании внутримолекулярных водородных связей с карбоксильными группами. Это приводит к значительному увеличению КР активности колебательных мод данных групп, в то время как активность остальных мод меняется незначительно. Помимо этого, основными акцепторами электронов при переносе заряда от НЧ металла к молекуле также становятся пиррольные фрагменты. Результаты и выводы для УБЛ принципиально схожи с таковыми для БРБ, что вызвано высокой структурной родственностью обеих молекул. Изучение (де)протонирования показало, что оно не сильно влияет на ГКР активность БРБ и УБЛ и зависимость их спектров от возбуждающего лазера, что осложняет подбор условий пробоподготовки для подавления сигнала этих компонентов биожидкостей. Квантово-химическое исследование фторхинолоновых антибиотиков показало, что сильное различие профилей ГКР спектров фторхинолонов в кислых и нейтральных средах вызвано варьированием степени протонирования пиперзинового фрагмента, поскольку этот параметр достаточно сильно зависит от заместителя. Также уменьшение различия в спектрах фторхинолонов в щелочных средах обусловлено депротонированием, которое приводит к уменьшению влияния протонирования и, как следствие, уменьшению разброса величины переноса заряда и степени усиления КР сигнала. Поэтому щелочная среда предпочтительнее для регистрации спектров с целью детектирования лекарств с учётом структурной родственности и разработки универсального протокола анализа. Изучение представителей цефалоспоринов показало, что именно заместители β-лактамного цикла (основного структурно-родственного фрагмента) в первую очередь ответственны за генерацию усиленного КР сигнала. Также показано, что гидролиз цефалоспоринов и раскрытие β-лактамного цикла приводит к изменению интенсивности и соотношения ГКР пиков, особенно в щелочных средах. Поэтому для исключения влияния конкурентных взаимодействий между гидролизованными и негидролизованными формами аналитов на поверхности ГКР подложек, проведение определения цефалоспоринов следует проводить при искусственно установленном высоком уровне рН для полного перевода аналитов в гидролизованную форму.