Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Впервые определены внутриклеточные концентрации N-ацетиласпартата (NAA), аспартата (Asp) и глутамата (Glu) в мозге человека in vivo, и исследовано влияние тяжелой черепно-мозговой травмы на процессы синтеза NAA в остром и отдаленном посттравматических периодах. В неповрежденных по данным диагностической магнитно-резонансной томографии (МРТ) лобных долях через сутки после травмы выявлено падение содержания Asp и Glu на 45% и 35%, соответственно при снижении NAA лишь на 16%. Установлена корреляционная связь между концентрацией NAA и отношением концентраций Asp/Glu. В отдаленном периоде уровень Glu нормализуется, Asp остается ниже нормы (на 60%), NAA снижается на 65% относительно нормы, достоверно уменьшается Asp/Glu. Полученные результаты выявляют ведущую роль нейронального аспартат-малатного шаттла в нарушениях синтеза NAA. Предложена новая нестационарная кинетическая модель динамики ответа мозга человека на внешнее сигнальное воздействие, которая адекватно описывает экспериментальные данные. Разработанная модель основана на представлении о многостадийности и нелинейности динамического процесса изменений концентрации N-ацетиласпарагиновой кислоты и N-ацетиласпартата в нервной ткани человека. При выводе кинетических уравнений принимаются во внимание процессы индуцированного расширения сосудов и динамика изменения концентрации N-ацетиласпартата с учетом возможного окисления через промежуточные стадии. Интегрирование выведенной системы уравнений было проведено с использованием специально разработанной программы в среде Delphi Enterprise. Решение кинетической модели позволяет визуализировать динамические ответы по всем переменным и исследовать поведение системы при варьировании параметров. Построена и исследована область триггерности системы (существование трех стационарных состояний): при малых изменениях начальных условий стационарное состояние системы существенно изменяется, что доказывает высокую чувствительность системы к начальной концентрации субстрата. Выявлено, что при высоких концентрациях N-ацетиласпартата система эволюционирует к устойчивому стационарному состоянию с низкой каталитической активностью аспартоацилазы, а при низких начальных концентрациях N-ацетиласпартата для фермента характерна высокая каталитическая активность и практически нулевой уровень N-ацетиласпартата. Показано, что при отсутствии эффекта ингибирования субстратом система неспособна выйти на исходный устойчивый стационарный уровень концентрации N-ацетиласпартата, следовательно, эффект ингибирования субстратом для предложенной системы является необходимым фактором автостабилизации N-ацетиласпартата как ключевого метаболита мозга. Кинетическое моделирование позволяет предсказать поведение метаболитов, определение концентраций которых in vivo затруднено. Выполнена новая серия расчетов энергетических профилей реакции гидролиза N-ацетиласпартата аспартоацилазой с применением улучшенных методик. Целью является определение активационных барьеров (соответственно, констант скоростей элементарных стадий реакции) с более высокой точностью, нежели в предыдущих работах. Применены следующие новые подходы: (1) проведена релаксация модельной структуры фермент-субстратного комплекса в молекулярно-динамических расчетах; (2) сопоставлены результаты вычислений энергетических профилей методом квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) с использованием в квантовой подсистеме функционалов электронной плотности, рекомендованных для расчетов активационных барьеров.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Методом функциональной протонной магнитно-резонансной спектроскопии в зрительной коре мозга человека измерено влияние видеостимуляции на in vivo концентрации компонентов N-ацетиласпартатной системы – N-ацетиласпартата, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, а также на концентрации участников метаболизма глутаминовой кислоты – глутамина и γ-аминомасляной кислоты. Видеостимуляцию проводили в течение 10 мин во время сбора спектральных данных, предъявляя испытуемым, находящимся в магнитно-резонансном томографе (напряженность постоянного магнитного поля 3 Тл) изображение шахматной доски, мигающей с частотой 8 Гц. Для регистрации перекрывающих сигналов использовали новые методы редактирования локализованных спектров мозга in vivo и новые методы обработки спектральных данных. Сравнение концентраций исследуемых метаболитов в состоянии покоя до предъявления стимула и при непрерывном видеовозбуждении показало, что использованный вид нагрузки вызывает в зрительной коре достоверный рост концентраций глутамата (Glu) и глутамина (Gln), снижение аспартата (Asp) и γ-аминомасляной кислоты (GABA) при неизменной концентрации N-ацетиласпартата (NAA). Рост [Glu] и [Gln] указывает на активацию цикла нейромедиаторов, снижение [GABA] свидетельствует о том, что эффект возбуждения достигается не только за счет увеличения концентрации возбуждающего нейромедиатора Glu, но и через уменьшение концентрации тормозного нейромедиаптора GABA. Полученные данные позволяют заключить, что при непрерывной видеостимуляции в зрительной коре угнетаются метаболические пути, требующие расхода Glu: синтез GABA и синтез Asp. Отсутствие изменений [NAA] при снижении концентрации его предшественника Asp может быть следствием инактивации гидролиза NAA. Публикация по результатам работы: P. Menshchikov A. Manzhurtsev M. Ublinskiy T. Akhadov N. Semenova “T2 measurement and quantification of cerebral white and gray matter aspartate concentrations in vivo at 3T: a MEGA‐PRESS study”, Magnetic Resonance in Medicine, 2019;1–10. doi: 10.1002/mrm.27700 (URL https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mrm.27700). Предложена кинетическая модель процесса ответа нервной ткани на внешнее сигнальное воздействие. Модель основана на представлении о многостадийности и нелинейности динамического процесса изменения концентрации N-ацетиласпарагиновой кислоты N-ацетиласпартата в нервной ткани человека. Показано, что эффект ингибирования субстратом является необходимым фактором автостабилизации N-ацетиласпартата как ключевого метаболита мозга. Существование трех стационарных состояний объясняет триггерное поведение системы. Разработана модифицированная кинетическая модель, описывающая импульс увеличения кислорода в возбужденной нервной ткани мозга человека в ответ на внешний сигнал. Модель учитывает биохимические данные и описывает экспериментальные данные по импульсному гемодинамическому ответу. Она предсказывает динамическое поведение участников процесса, предшествующих импульсу кислорода и определяющих уровень BOLD-сигнала (Blood Oxygen Level Dependent signal). Публикации по результатам работы: Sergey D. Varfolomeev, Nataliya A. Semenova, Maxim V. Ublinskiy, Valeriy I. Bykov, Svetlana B. Tsybenova « fMRI and MR-spectroscopy in research on triggering and autostabilization of N-acetylaspartate», Chemical Physics Letters 729 (2019) 84–91. doi: 10.1016/j.cplett.2019.05.033 (URL https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0009261419304312); С.Д. Варфоломеев, Н.А. Семенова, В.И. Быков, С.Б. Цыбенова «КИНЕТИКА ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В МОЗГЕ ЧЕЛОВЕКА. МОДЕЛИРОВАНИЕ BOLD-СИГНАЛА ПРИ фМРТ ИССЛЕДОВАНИИ» ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2019, том 488, № 2, с. 157–161 (URL https://journals.eco-vector.com/0869-5652/article/view/16067)/ Методами молекулярного моделирования впервые построены трехмерные полноатомные молекулярные модели фермент-субстратных комплексов для реакций переноса ацетильной группы от молекулы ацетилкофермента А (ацетил-СоА) на глутаминовую или аспарагиновую кислоту, приводящих к N-ацетилглутамату или N-ацетиласпартату для ферментов аспартат-N-ацетилтрансферазы (ANAT) и N-ацетилглутаматсинтазы (NAGS). Использованы современные методы биоинформатики, классической молекулярной динамики и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ). Для обеих систем моделирование начиналось от известной первичной последовательности аминокислотных остатков, но не от результатов рентгеноструктурного анализа кристаллов. Результаты моделирования аспартат-N-ацетилтрансферазы (ANAT) показывают, что белок находится в димерной форме и должен быть встроен в липидную мембрану, в этих условиях удается стабилизировать фермент-субстратный комплекс, содержащий большое число заряженных аминокислотных остатков около молекул реагентов. Для NAGS методами КМ/ММ описан механизм реакции, соответствующий одностадийному процессу синтеза N-ацетилглутамата в активном центре фермента при участии обобщенного основания Glu353. Полученная методами компьютерного моделирования структура системы с продуктами реакции сопоставлена с экспериментальной кристаллографической структурой PDB ID 3B8G. При наложении экспериментальной и теоретической структур получено, что среднеквадратичное отклонение по координатам Сα атомов для 144 аминокислотных остатков составляет 1.12 Å, что является очень хорошим показателем для результатов моделирования по гомологии. Анализ построенной структура фермент-субстратного комплекса для аспартат-N-ацетилтрансферазы показывает, что синтез N-ацетиласпартата в активном центре фермента должен проходить по сходному механизму, как и в N-ацетилглутаматсинтазе.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Методами функциональной магнитно-резонансной томографии и спектроскопии динамического поведения N-ацетиласпартатной системы мозга человека проведен анализ динамики концентраций глутамина (Gln) и глутаминовой кислоты (Glu) – участников цикла нейромедиаторов и метаболизма N-ацетиласпартата, в ответ на короткий единичный видеостимул [Menshchikov P., Ivantsova A., Manzhurtsev A., Ublinskiy M., Yakovlev A., Melnikov I., Kupriyanov D., Akhadov T., Semenova N. «Separate N-acetyl aspartyl glutamate, N-acetyl aspartate, aspartate, and glutamate quantification after pediatric mild traumatic brain injury in the acute phase», Magnetic Resonance in Medicine (Q1), 2020, 84 (6), 2918-2931. DOI: 10.1002/mrm.28332]. В зрительной коре мозга человека методом 1Н ЯМР in vivo (1Н МРС) измерены временные зависимости концентрации Glu и Gln и интенсивности сигнала гемодинамического ответа (BOLD, Blood Oxygenation Level Dependent signal) на стимул. Зрительную кору активировали, предъявляя через систему зеркал испытуемому, находящемуся в магните магнитно-резонанасного томографа, изображение мерцающей с частотой 4 Гц шахматной доски. Длительность стимула составляла 3 с. Все измерения проводили на магнитно-резонансном (МР) томографе Phillips Achieva dStream 3Т. Спектры обрабатывали в программе LCmodel, которая анализирует in vivo спектр как линейную комбинацию базового набора априорных данных, сформированного с помощью модельных спектров растворов всех метаболитов, содержащихся в мозге, либо симулированного программными методами. Получали относительные концентрации Glx/Cr для каждой временной точки (Glx - суммарная концентрация Glu (60%) и Gln, (40%)). Статистически достоверное увеличение [Glx] на 2.5% зафиксировано на первой и третьей секундах после стимула, далее значения [Glx] в пределах ошибки не отличаются от исходных. Причиной роста [Glx] может быть увеличение скоростей цикла Кребса в нервных клетках, а также скорости глутамин-глутаматного цикла, поскольку эти метаболические системы пополняют пул основного возбуждающего нейромедиатора глутамата в пресинаптических нервных терминалах после стимула. Обратимый рост [Glx] на первых секундах после стимула является следствием выброса Glu из везикул в синаптическую щель с последующим включением Glu в цикл нейромедиаторов. Таким образом, обнаруженный на 1 – 3 секундах после стимула рост суммарной концентрации Gln и Glu является проявлением нейромедиаторной функции Glu. Нейромедиатор Glu участвует во множестве процессов, протекающих в клетках, в том числе, он является предшественником основного тормозного нейромедиатора  - аминомасляной кислоты [Яковлев А.Н., Манжурцев А.В., Меньщиков П.Е., Ублинский М., Божко О., Ахадов Т.А., Семенова Н.А. “Эффект зрительной стимуляции на уровни ГАМК и макромолекул в головном мозге человека in vivo”, Биофизика 2020, 65(1), 61-68. DOI: 10.31857/S000630292001007Х]. В соответствии с формально-кинетической схемой превращений изменения BOLD-сигнала [Varfolomeev S.D., Bykov V.I., Semenova N.A., Tsybenova S.B. «Kinetic Modeling of the Blood Oxygenation Level Dependent (BOLD) Signals and Biocatalytic Reactions Observed in the Human Brain Using MRI: An Analysis of Normal and Pathological Conditions», ACS Chemical Neuroscience (Q1), 2020, 11 (5), 763-771. DOI: 10.1021/acschemneuro.9b00671] модифицирована кинетическая модель, которая предусматривает отключение одного из сигнальных путей вазодиталации за счет ингибирования лекарственными препаратами. В соответствии с общей направленностью проекта на исследование химической кинетики биопроцессов в центральной нервной системе (ЦНС) человека в работах отчетного года рассмотрены процессы в ацетилхолиновых синапсах, использующие ацетилхолин в качестве нейромедиатора. Разработана кинетическая модель, описывающая динамику биопроцессов, участвующих в химической передаче сигналов в холинергическом синапсе [Варфоломеев С.Д., Быков В.И., Цыбенова С.Б. «Кинетическое моделирование динамических процессов в холинергическом синапсе», Известия Академии наук. Серия химическая, 2020, 8, 1585–1593; Варфоломеев С.Д., Быков В.И., Цыбенова С.Б. «Кинетика химических процессов в мозге человека. Холинергический синапс – механизмы функционирования и методы управления», Доклады Российской академии наук, Науки о жизни, 2020, 492, 305-309. DOI: 10.31857/S268673892003021X; Варфоломеев С.Д., Быков В.И., Цыбенова С.Б. «Кинетика химических процессов в мозге человека. Протонная блокада ацетилхолинэстеразы и pH-импульс в механизме функционирования холинергетического синапса», Доклады Российской академии наук, Науки о жизни, 2020, 491, 189-193. DOI: 10.31857/S2686738920020274]. Принципиальной особенностью функционирования холинергического синапса является продукция в синаптической щели ионов водорода в результате образования достаточно сильной уксусной кислоты (pKa  4). Очистка синапса от продуцированных ацетилхолинэстеразой протонов может происходить в первую очередь путем диффузии протонов из полисахаридного геля синаптической щели. Для описания динамики биопроцессов, участвующих в химической передаче сигналов в холинергическом синапсе, предложена система дифференциальных уравнений химической кинетики, учитывающая инжекцию нейромедиатора в синаптическую щель, скорость его ферментативного гидролиза, pH-зависимость каталитической активности фермента, ингибирование фермента ионами водорода и избытком субстрата, диффузионное рассеивание и нейтрализацию ионов водорода. Использованные для численного решения кинетических уравнений параметры включают константы скорости катализа и ингибирования фермента, константу Михаэлиса и константу равновесия связывания протона с имидазольной группой гистидина каталитической триады активного центра ацетилхолинэстеразы. Показано, что процесс продукции протонов ацетилхолинэстеразой драматически сказывается на кинетическом поведении системы. Полученные зависимости динамики “разряда” ацетилхолинового синапса при различных значениях концентрации фермента в синаптической щели демонстрируют, что синхронно с вводом в синаптическую щель нейромедиатора растет концентрация протонов и pH падает практически до 5, причем продолжительность импульса строго коррелирует со временем гидролиза нейромедиатора. Решение модельных кинетических уравнений позволяет описать функционирование ацетилхолинового синапса при инактивации и реактивации ацетилхолинэстеразы, кинетическое поведение холинергических синапсов и ряд физиологических феноменов: отравление нервно-паралитическими ядами, нервно-мышечный паралич, применение токсина Botox при лечении инсультных параличей, механизм записи и хранения информации в нейрологической памяти, болезнь Альцгеймера. Предложенная кинетическая модель может быть названа базовой, поскольку позволяет описывать основные процессы холинергического синапса и допускает обобщение на более широкий класс химических реакций с участием других метаболитов. Впервые построена трехмерная полноатомная молекулярная модель фермента аспартат-N-ацетилтрансферазы (ANAT), синтезирующего N-ацетиласпартат [Polyakov I.V., Kniga A.E., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V. «Structure of the brain N acetylaspartate biosynthetic enzyme NAT8L revealed by computer modeling», ACS Chemical Neuroscience (Q1), 2020, 11 (15), 2296-2302. DOI: 10.1021/acschemneuro.0c00250]. Полученная модельная система содержит в активном центре реактанты - молекулы аспартата и ацетил-кофермента А. Таким образом, решена наиболее сложная задача всего проекта по направлению суперкомпьютерного молекулярного моделирования, поскольку в данном случае отсутствовал подходящий структурный шаблон - в базе данных белковых структур (Protein Data Bank) нет структуры соответствующего мембрано-ассоциированного белка ни с аналогами субстрата, ни в апо-форме. В качестве исходной информации использовались данные о первичной последовательности аминокислотных остатков белка, кодированного геном NAT8L (N-acetyltransferase-8-like). Методами биоинформатики и молекулярной динамики получена пространственная структура белка в липидных слоях и сольватных оболочках молекул воды. После добавления в модельную систему реактантов методами молекулярной динамики и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) определена структура активного центра фермента в конфигурации фермент-субстратного комплекса. Характеристики модели верифицированы при сопоставлении данных моделирования с результатами экспериментальных исследований влияния точечных мутаций NAT8L на кинетику ферментативной реакции. Расчеты методом КМ/ММ энергетических профилей реакции синтеза N-ацетиласпартата и N-ацетилглутамата [Поляков И.В., Книга А.Е., Григоренко Б.Л., Немухин А.В., Варфоломеев С.Д. «Компьютерное моделирование N-ацетилглутаматсинтазы: От первичной последовательности до элементарных стадий катализа», Доклады Российской академии наук, Науки о жизни, 2020, 495, 95-99. DOI: 10.31857/S2686738920060219] аспартат-N-ацетилтрансферазами позволяют оценить константу скорости химической стадии реакции, которая проходит по механизму субстрат-ассистирующего катализа.