Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе выполнения первого этапа Проекта совместно с лабораторией биофотоники ИПФ РАН был отработан метод одновременной регистрации фотохимического индекса отражения (PRI) и нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ) в листе растения. Использованная для этого система включала в себя РАМ-флуориметр, спектрометр и осветительный блок. Было разработано две модификации осветительного блока: на базе люминофорного белого светодиода и двух широкополосных светофильтров (желтого и желто-зеленого) и на базе галогенной лампы. Первый осветительный блок обеспечивал освещение объекта желто-зеленым светом с минимальным вкладом фотосинтетически-активного освещения. Такой блок использовался в сочетании с красным актиничным светом РАМ-флуориметра; для устранения искажающего влияния актиничного и фонового освещения применяли периодическое включение желто-зеленого света. Второй осветительный блок обеспечивал широкополосное освещение со значительной долей фотосинтетически-активного света; такой блок использовался без дополнительного актиничного освещения и применялся в режиме непрерывного освещения. При разработке осветительных блоков было также показано, что использование комбинации двух типов светодиодов с максимумами близкими к 531 и 570 нм не является эффективным вариантом освещения при решении задачи регистрации PRI. Далее был выполнен анализ применимости метода регистрации PRI для выявления фотосинтетического стресса у сельскохозяйственных растений. Для этого у гороха, пшеницы и тыквы были получены световые зависимости PRI и NPQ. Было показано, что увеличение интенсивности красного актиничного света приводило к сдвигу PRI в отрицательную сторону и увеличению NPQ; изменения обоих показателей были тесно связаны между собой. При этом изменения PRI могли быть зарегистрированы даже при слабой интенсивности желто-зеленого света осветителя. Такой результат показывает, что все три исследованных растения могут быть использованы как модельные объекты для анализа изменений PRI в ответ на действие стрессоров. Важно отметить, что уровень PRI между отдельными растениями существенно варьировал, поэтому достоверные различия наблюдались, прежде всего, при анализе ΔPRI (величины изменения PRI относительно начального (темнового) уровня показателя). На горохе было дополнительно показано, что переходные процессы, индуцированные изменением интенсивности фотосинтетически-активного освещения, могут быть фактором, который уменьшает эффективность использования PRI в качестве показателя NPQ в условиях естественного освещения с колебаниями интенсивности; однако, такое влияние, по-видимому, не будет иметь решающего значения для измерений. При выполнении следующего блока экспериментов были изучены изменения PRI, развивающиеся при действии стрессоров на растение в целом (высокая температуры, почвенная засуха) и при распространении стрессовых сигналов электрической природы, вызванных локальным повреждением растения. Было показано, что кратковременный нагрев вызывал у пшеницы, гороха и тыквы увеличение абсолютной величины ΔPRI, которая была сильно коррелирована с возрастанием NPQ в листе. Нагрев также вызывал сдвиг фотохимического индекса отражения в отрицательную сторону; однако этот эффект наблюдался не всегда и был менее связан с изменениями NPQ. Измерение другого широко используемого спектрального индекса – вегетационного индекса (NDVI) не выявило достоверных изменений этого показателя. Исследование влияния почвенной засухи, проведенное на горохе, показало, что на начальных этапах засухи происходил сдвиг уровня PRI в отрицательную сторону; однако, затем эффект исчезал. С другой стороны, возрастание абсолютной величины ΔPRI сохранялось в течение всего исследуемого периода; такое возрастание было тесно связано с возрастанием нефотохимического тушения. Анализ NDVI показал, что засуха приводила к снижению этого показателя; однако, уменьшение вегетационного индекса происходило позже, нежели развитие изменений PRI. Таким образом, возрастание абсолютной величины ΔPRI является хорошим показателем фотосинтетического стресса при действии повышенной температуры и засухе. При исследовании влияния распространяющихся стрессовых сигналов электрической природы, прежде всего, был проведен детализированный анализ путей такого влияния на фотосинтез. Было показано, что электрические сигналы могут повышать поглощение света фотосистемой II и вызывать обратимую активацию потока электронов. Такие изменения, вероятно, связаны с закислением люмена хлоропластов; это означает, что электрические сигналы должны влиять на PRI. Действительно, дальнейший анализ показал, что электрические сигналы вызывали обратимый сдвиг PRI в отрицательную сторону; амплитуда такого сдвига была сильно коррелирована с амплитудой возрастания NPQ. Полученный результат показывает, что изменения PRI могут быть использованы и для мониторинга системного фотосинтетического ответа, вызванного распространением стрессовых сигналов. Массивы экспериментальных результатов, полученных по каждому виду в различных условиях, были объединены с целью построения регрессионной модели связи между фотохимическим индексом отражения и нефотохимическим тушением. Было показано, что у всех трех видов ΔPRI линейно зависел от величины общего нефотохимического тушения и от его быстрой (энергозависимой) компоненты. Хорошая линейная связь сохранялась и при объединении результатов все трех видов. В то же время, связь уровня PRI с нефотохимическим тушением была достаточно слаба и не могла быть описана регрессионной моделью. В рамках Проекта был также выполнен ряд дополнительных блоков. Во-первых, был проведен мета-анализ литературных данных, которые показал, что эффективность использования PRI в качестве показателя NPQ могут влиять как условия измерения, так и особенности распределения уровня фотосинтетического стресса в исследуемой выборке растений. Во-вторых, было показано, что развитие засухи приводит к существенному изменению пространственного распределения NPQ в листе; этот предварительный результат показывает перспективность исследований пространственного распределения уровня фотосинтетического стресса и значений PRI по листу для диагностики поражения растения. В-третьих, совместно с лабораторией биофотоники ИПФ РАН предложены предварительные технические решения для реализации системы измерения и визуализации пространственного распределения PRI в растении. В целом, полученные в течение первого года выполнения Проекта результаты показывают, что изменения фотохимического индекса отражения являются хорошим индикатором фотосинтетического стресса, вызванного избыточным освещением, нагревом, засухой или распространением стрессовых сигналов. При этом очень важно, что наиболее эффективным показателем фотосинтетического стресса является не абсолютный уровень PRI, а его изменения (ΔPRI). Такой результат показывает необходимость сосредоточить дальнейшие исследования на изучении пространственного распределения PRI (оценка ΔPRI между участками растения) и/или на изучении изменений PRI при изменении уровня освещения (оценка ΔPRI при изменении освещения). По результатам первого года Проекта опубликовано или принято к печати три статьи в журналах, индексируемых Web of Science и Scopus, включая два журнала из Q1. Сделаны доклады на конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основными задачами второго года выполнения Проекта была разработка системы измерения и визуализации пространственного распределения фотохимического индекса отражения (PRI) и оценка ее эффективности; адаптация разработанной системы для определения нефотохимического тушения флуоресценции; выявление особенностей изменений нефотохимического тушения и фотохимического индекса отражения при действии стрессоров (почвенная засуха, температурный стресс), включая анализ пространственного распределения изменений; исследование возможности развития быстрых сдвигов PRI в условиях кратковременного освещения и оценка применимости таких сдвигов для диагностики стрессовых ответов растения. В рамках решения первой задачи, совместно с ООО «Нижегородский лазерный центр» была разработана, технически реализована и предварительно протестирована система измерения и визуализации пространственного распределения PRI растений; разработано базовое программное обеспечение к ней. Разработанная система включала в себя две цифровые камеры с синхронизацией, оборудованные интерференционными фильтрами со светопропусканием на 531 и 570 нм, светоделительную пластинку, обеспечивающую общий «вход» для получения изображения, систему светодиодов для подсветки объектов желто-зеленым светом, контроллер, осуществляющий управление системой и ряд других компонент. Важной особенностью разработанной системы стало применение импульсного освещения объектов желто-зеленым измерительным светом, что позволило минимизировать искажающее влияние фонового освещения. Максимальное поле визуализации разработанной системы составило 30х22 см2, минимальное время между измерениями – 5 с, максимальное количество измерений в серии – 9 999. Разработанная система была использована для решения последующих задач. Путем совместных измерений пространственного распределения PRI с использованием разработанной системы и измерений пространственного распределения NPQ с использованием серийных системы РАМ-имиджинга было показано, что разработанная система позволяет эффективно оценивать величину нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ) на основании измерения светоиндуцированных изменений PRI (ΔPRI) в минутном диапазоне у растений с относительно крупными листьями (горох, тыква); несколько менее эффективным оказалось использование изменений PRI для оценки NPQ у растений с малым размером листьев (в частности, у пшеницы, которая имеет узкие листья). Для количественного описания связей между ΔPRI и NPQ были получены линейные регрессионные уравнения, которые оказались близки к аналогичным уравнениям, полученным при анализе интегральных величин PRI и NPQ в листьях растений. Далее разработанная система была использована для оценки изменения PRI в условиях развития почвенной засухи и действия повышенной температуры, являющихся значимыми для сельского хозяйства стрессорами. Прежде всего, было показано, что светоиндуцированное ΔPRI в минутном диапазоне является достаточно чувствительным показателем развития фотосинтетического стресса в этих условиях; между ΔPRI и NPQ сохраняются сильные линейные связи. Такой результат показывает, что анализ светоиндуцированных изменений PRI в минутном диапазоне является перспективным подходом для выявления развития стрессовых изменений в фотосинтетическом аппарате при мониторинге состояния растений в условиях теплицы или лаборатории. В то же время, использование такого показателя для мониторинга состояния растений в полевых условиях имеет значительные ограничения (реализация освещения объектов актиничным светом в течение нескольких минут является сложной задачей при полевых измерениях); поэтому был осуществлен поиск альтернативных подходов к выявлению стрессовых ответов растений с использованием разработанной системы. Было обнаружено, что показатели, отражающие вариабельность PRI в исследованных участках (стандартное отклонения, разность максимального и минимального значения) значительно повышаются в условиях развития почвенной засухи. Такое возрастание хорошо коррелирует с увеличением NPQ и, по-видимому, отражает развитие стрессовых изменений растения в условиях водного дефицита. В то же время, подобное возрастание вариабельности отсутствует после кратковременного действия повышенной температуры; т.е. выявленные изменения обладают определенной специфичностью. Важно отметить, что такие изменения могут быть выявлены без использования калибровочной белой поверхности; это повышает перспективы использования такого показателя для мониторинга состояния растений в полевых условиях. Другим альтернативным показателем может стать величина быстрого сдвига PRI (секундный диапазон), которое было показано с использованием различной длительности освещения растения измерительным желто-зеленым светом. В частности, было установлено, что сдвиг PRI в секундном диапазоне уменьшается при развитии почвенной засухи и практически полностью подавляется при действии повышенной температуры. Обнаружение такого эффекта и его зависимость от типа стрессора также создает предпосылки для использования этого показателя для мониторинга состояния растений в условиях поля. Дополнительно, следует отметить, что анализ пространственного распределения NPQ по площади листа также показал наличие характерных особенностей такого распределения и его динамики в случае действия засухи и нагрева; однако, измерение пространственного распределения PRI в различных участках листовой пластинки не обладает достаточной точностью, чтобы использовать этот подход. В целом, полученные результаты показывают, что разработанная система может осуществлять эффективное измерение фотохимического индекса отражения и динамики его изменения; изменения PRI, в свою очередь, могут быть использованы в качестве показателя развития стрессовых изменений у сельскохозяйственных растений (т.е. использоваться в мониторинге их состояния). Уточнение и совершенствование предложенных подходов является общей задачей дальнейшего развития Проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Первой задачей, которая решалась на третьем этапе проекта, была модификация и улучшение программного обеспечения разработанной системы по измерению пространственного распределения фотохимического индекса отражения (PRI) у растений (системы PRI-имиджинга). В рамках такой модификации была разработана версия программы Pri 2.0, в которой был реализован ряд новых возможностей. В первую очередь была реализована калибровочная процедура, позволяющая минимизировать техническую ошибку, связанную с различным пространственным расположением исследуемых растений. Во-вторых, была реализована процедура снижения ошибки, обусловленной стохастической неоднородностью чувствительности пикселей матрицы камер. Для этого в новой версии программы была реализована возможность пространственного усреднения получаемых результатов методом скользящего среднего. Были реализованы три варианта – без усреднения, усреднение по квадрату 3х3 и усреднение по квадрату 5х5. В-третьих, был реализован ряд новых возможностей, связанных с анализом получаемых изображений. В частности, Pri 2.0 обеспечивает возможность выставления ROI на полученном системой пространственном распределении PRI, оценки средних значений и стандартного отклонения PRI в таких ROI, получения временной динамики исследуемых значений. Полученные результаты могут быть представлены в виде графика или таблица в программе; также имеется возможность для их сохранения в качестве отдельных файлов. Вторая задача была направлена на детальный анализ механизмов и перспектив прикладного применения изменений PRI, индуцированных освещением в секундном диапазоне. В качестве модельного объекта использовали растения гороха. В рамках решения этой задачи было показано, что светоиндуцированные изменения PRI могут быть разделены на три компоненты: медленные, быстрые и сверхбыстрые. Медленные изменения развиваются в минутном диапазоне освещения; их релаксация в таком временном диапазоне отсутствует. Динамика изменений этой компонент показывает, что она, по-видимому, обусловлена переходами в ксантофилловом цикле. Быстрые изменения PRI развиваются и релаксируют в течении нескольких десятков секунд. Динамика таких изменения сильно коррелирует с динамикой изменений светопропускания на длине волны 535 нм в диапазоне десятков секунд, которая отражает изменения рассеяния света хлоропластами на длине волны 530-545 нм, связанные с закислением люмена хлоропластов. Сверхбыстрые изменения развивались в пределах нескольких секунд освещения; они включали в себя быстрое снижение PRI (500-1000 мс) и последующую полную или частичную релаксацию его величины. Сверхбыстрые изменения PRI коррелировали с развитием электрохромного сдвига и были, по-видимому, связаны с изменениями градиента электрического потенциала на тилакоидной мембране. Учитывая, что сверхбыстрые компоненты изменения PRI могут быть вызваны освещением растений желто-зеленым измерительным светом системы в течении нескольких секунд, с технической точки зрения, такие компоненты являлись наиболее перспективными для использования в оценке состояния растений. Анализ влияния условий измерений на регистрацию сверхбыстрой компоненты изменений показал, что такие изменения могут быть измерены в различных условиях (наличие/отсутствие пространственной фиксации листьев, контролируемые/естественные условия измерения). При этом, амплитуда сверхбыстрых измерений PRI была несколько выше в условиях затемнения. Последующий анализ возможности использования сверхбыстрой компоненты изменения PRI для оценки поражения растений при засухе показал, что развитие водного стресса действительно вызывало достоверные изменения амплитуды такой компоненты: снижение амплитуды при умеренной засухе и увеличение амплитуды при сильной засухе. В то же время, величина таких изменений была относительно мала, что ограничивает возможность использования этого показателя в дистанционном мониторинге. Третья задача была направлена на адаптацию методов применения разработанной системы PRI-имиджинга для оценки стрессовых изменений растений при засухе в условиях открытого грунта и естественного освещения. В качестве модельного объекта использовали растения гороха. Прежде всего, решение этой задачи позволило выявить некоторые технические проблемы и дополнительные возможности при таком типе анализа. Было показано, что основным фактором вносящим ошибку в измерения PRI в естественных условиях являются порывы ветра, вызывающие быстрее колебания пространственного расположения листьев и стеблей. Для решения этой проблемы были использованы короткие серии измерений PRI (11 повторов), среди которых выбирали для дальнейшего анализа результат с наименьшим уровнем стандартного отклонения у полученного изображения. Было также выявлено, что анализ PRI у массива побегов растений, которые образуют достаточно плотный растительный покров, позволяет использовать стандартное расположение зон для анализа (ROI). Это дает возможность избежать процедуры ручного или автоматизированного поиска листьев и расположения на них ROI, т.е. существенно упрощает анализ. Исследование эффективности выявления стрессовых изменений при развитии засухи в условиях открытого грунта и естественного освещения с использованием разработанной системой PRI-имиджинга, показало, что при развитии засухи абсолютные величины PRI снижаются, а стандартные отклонения индекса в пределах исследованных ROI возрастают. Изменения обоих показателей начинают развиваться на ранних стадиях засухи и достигают значительных величин при падении относительного содержания воды в растениях на 10% и более. Важно отметить, что наиболее эффективным для выявления засухи является совместное использование двух критериев – снижение абсолютного значения PRI ниже порогового уровня и возрастание стандартного отклонения PRI выше порогового уровня (для идентификации засухи было достаточно выполнения хотя бы одно из этих критериев). Четвертая задача была направлена на обобщение результатов проекта. В ее рамках было показано, что разработанная система может быть использована для получения четырех групп параметров. При этом первые три группы могут быть получены без использования дополнительных блоков. Во-первых, это измерение абсолютной величины PRI. Такое измерение эффективно при анализе вызванных засухой стрессовых изменений на уровне растительного покрова (на примере, гороха); при этом оно менее эффективно при анализе листьев с фиксированным в пространстве положением. По-видимому, основной областью применения абсолютной величины PRI является мониторинг состояния растений в условиях открытого грунта и, возможно, теплицы. Во-вторых, это изменение стандартного отклонения PRI. Такое стандартное отклонение было связано с развитием стрессовых изменений при засухе во всех вариантах экспериментов (наличие/отсутствие пространственной фиксации листьев, контролируемые/естественные условия измерения). По-видимому, этот показатель можно рассматривать как наиболее универсальный показатель развития стрессовых изменений, которые может быть использован при различных вариантах мониторинга состояния растений (лаборатория, теплица, открытый грунт). В-третьих, это сверхбыстрые изменения PRI, которые развивались при освещении растительных объектов измерительным желто-зеленым светом в течение нескольких секунд. По-видимому, сверхбыстрая компонента изменений PRI может быть использована для оценки светоиндуцированных изменений электрического потенциала на тилакоидной мембране; однако, величина таких изменений при развитии засухи относительно невелика. Таким образом, сверхбыстрые изменения PRI могут быть использованы скорее в лабораторных условиях (научные исследования, высокопроизводительное фенотипирование). В-четвертых, это изменения PRI вызванные освещением актиничным светом в диапазоне десятков секунд и минут. Измерение таких изменений требует дополнительного источника актиничного света с контролируемой интенсивностью и низкого уровня фонового освещения; т.е. оно может быть реализовано в лабораторных условиях или в условиях теплицы. Реализация такой системы в условиях открытого грунта достаточно сложна. Изменения PRI в секундном и минутном диапазоне являются эффективным инструментом для оценки фотосинтетических показателей; в частности, они могут быть использованы для определения нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла (NPQ). Количественные связи NPQ и изменений PRI были описаны в рамках проекта линейными регрессионными моделями. Областью применения таких изменений PRI могут быть научные исследования фотосинтетических процессов в лабораторных условиях, высокопроизводительное фенотипирование и, возможно, раннее выявление стрессовых изменений фотосинтетического аппарата при выращивании растений в условиях открытого грунта. По результатам проекта, подготовлена и направлена на рассмотрение заявка на получение патента в Российской Федерации на «Систему для измерения фотохимического индекса отражения PRI у растений». Опубликован ряд научных статей в журналах, индексируемых базами данных Web of Science и Scopus, включая журналы, входящие в Q1.