Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Данный проект направлен на комплексный структурно-функциональный анализ метаболической активности, рН, ультраструктуры цитоскелета и вязкости цитоплазматической мембраны в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека при направленных дифференцировках. При выполнении первого этапа проекта получены следующие результаты: Была проведена направленная дифференцировка ИПСК в нейральном направлении. Изначально линия IPS-KYOU была охарактеризована нами при помощи иммуноцитохимического (ИЦХ) анализа и количественного ОТ-ПЦР в реальном времени, по экспрессии специфических маркеров Oct4, Sox2, SSEA4, Tra-1-60 (определение наличия антителами при ИЦХ) и Oct4, Nanog, TDGF1, LIN28 (измерение уровня экспрессии при помощи OT-ПЦР). В результате было показано наличие маркеров Oct4, Sox2, SSEA4, Tra-1-60 в клетках IPS-KYOU. Также мы показали значительную экспрессию генов Oct4, Nanog, TDGF1, LIN28 в IPS-KYOU в сравнении с нейральными стволовыми клетками NSC-KYOU, нейронами N-KYOU и эндотелиальными клетками EC-KYOU. Таким образом мы убедились в том, что клетки линии ISPС-KYOU являются плюрипотентными стволовыми клетками. При помощи метода DUAL SMAD ингибирования, культура ИПСК была продифференцирована в направлении клеток центральной нервной системы, с получением культур нейральных стволовых клеток (НСК). НСК в дальнейшем были подвергнуты терминальной дифференцировке с получением зрелых нейронов. Полученные культуры NSC-KYOU и зрелых нейронов были охарактеризованы при помощи ИЦХ анализа по наличию маркеров нейральных стволовых клеток и зрелых нейронов и метода количественного ОТ-ПЦР в реальном времени по экcпрессии генов. В результате нами было показано наличие маркеров Nestin, Sox2, Pax6 в клетках NS-KYOU. Также мы показали значительную экспрессию генов Nestin, Sox1, Musashi 1 в NS-KYOU в сравнении с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками IPS-KYOU, нейронами N-KYOU и эндотелиальными клетками EC-KYOU. Таким образом мы убедились в том, что клетки линии NS-KYOU являются нейральными стволовыми клетками. Нами было показано наличие Tuj1, hNCAM, Syn I, SYP в полученных клетках N-KYOU. Также мы показали значительную экспрессию генов Tuj1, MAPT, MAP2 в N-KYOU в сравнении с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками IPS-KYOU, нейральными стволовыми клетками N-KYOU и эндотелиальными клетками EC-KYOU. Таким образом мы убедились в том, что полученные клетки N-KYOU являются культурой нейронов человека. Методом двухстадийной дифференцировки, предложенным Christoph Patsch с соавт., IPS-KYOU были направлены в эндотелиальную дифференцировку Полученные культуры эндотелиальных клеток EC-KYOU были охарактеризованы при помощи ИЦХ анализа по наличию маркеров эндотелиальных клеток и метода количественного ОТ-ПЦР в реальном времени по экcпрессии генов. В результате нами было показано наличие маркеров VE-cadherin, PECAM-1 в клетках EC-KYOU. Также мы показали значительную экспрессию генов VCAM-1, PECAM-1 в клетках EC-KYOU в сравнении с IPS-KYOU, нейральными стволовыми клетками N-KYOU и нейронами N-KYOU. Таким образом мы убедились в том, что полученные клетки EC-KYOU являются культурой эндотелиальных клеток человека. Таким образом, все полученные линии и культуры клеток были охарактеризованы двумя независимыми методами в полном соответствии с заявленным планом работ. Получены данные по изменению внутриклеточного рН ИПСК при нейральной и эндотелиальной дифференцировках на основе флуоресцентной микроскопии и генетически – кодируемого рН-сенсора SypHer-2. Для получения трансфицированных линий ИПСК с SypHer-2 было апробировано 2 вида трансфекции. Нейроны, экспрессирующие SypHer-2, получали при терминальной дифференцировке НСК-SypHer-2 в нейроны согласно описанной ранее методике. Для получения трансфицированных SypHer-2 клеток ПМ и эндотелиальных клеток использовали оба варианта трансфекции. В предварительных экспериментах была проведена калибровка с pH-сенсором SypHer-2 для перевода условных единиц рН в абсолютные единицы. В соответствии с полученными данными были построены калибровочные кривые зависимости соотношений интенсивности флуоресценции от величины рН. Полученные калибровочные кривые описывались уравнением экспоненциальной зависимости. Среднее значение соотношений интенсивностей флуоресценции в ИПСК составило 0,227 ± 0,022 условных единиц, что по калибровочной кривой соответствовало абсолютным значениям рН – 7.2±0.1. При дифференцировке ИПСК в нейральном направлении наблюдали смещение значений рН в щелочную сторону. В нейральных стволовых клетках значение внутриклеточного рН составило 7.3±0.13, а в нейронах 7.4±0.13 (статистически значимые отличия с ИПСК, р≤0.05). Получены данные по изменению вязкости цитоплазматической мембраны ИПСК при нейральной и эпителиальной дифференцировках на основе метода FLIM и молекулярного ротора BODIPY 2. Анализ микровязкости цитоплазматической мембраны клеток был проведен по изменению времени жизни молекулярного ротора BODIPY 2. В соответствии с калибровочной кривой полученные времена жизни флуоресценции переводили в значения вязкости сПз. В соответствии с калибровочной кривой вязкость в ИПСК составила 397,4±54,51 сПз. При эндотелиальной и нейрональной дифференцировке в клетках ПМ и НСК наблюдали снижение вязкости (305,9±45,08 и 340,9±94,09 сПз соответственно) по сравнению с недифференцированными ИПСК (статистически значимые различия, р≤0.05). В дифференцированных клетках нейронах и эндотелиальных клетках было обнаружено повышение микровязкости цитоплазматической мембраны (474,3±113,04 и 419,9±59,96 сПз соответственно). Таким образом в нашей работе показано, что по сравнению с ИПСК эндотелиальные клетки и нейроны имеют более вязкую мембрану (статистически значимые различия, р≤0.05). Получены данные по изменению ультраструктуры цитоскелета ИПСК при нейральной и эпителиальной дифференцировках на основе флуоресцентного репортера SiR-actin и высокоразрешающей микроскопии PALM/STORM. В ИПСК актиновый цитоскелет представлен обширной сетью волокон, заполняющих всю клетку целиком. На поверхности цитоплазмы хорошо дифференцируются отдельные стресс-фибриллы. В НСК актин образует звездчатоподобную структуру из тонких разнонаправленных нитей. В данной культуре наблюдается плотное расположение самих клеток и большое количество межклеточных контактов. Нейроны имеют сходную с НСК морфологию, однако обладают более крупными размерами, а также ядро детектируется эксцентрически относительно самого тела клетки. Актин в нейрональных клетках представляет собой длинные нити, придающие клеткам исчерченность. Клетки ПМ характеризовались сходной с ИПСК ультраструктурой цитоскелета и также имели обширную сеть микрофиламентов, простирающихся через всю клетку. В то же время ЭК имели веретеновидную форму. Актин при этом заполнял цитоплазму, формируя тонкие микровилии по краям клеток. Кроме того, можно детектировать длинные упорядоченно расположенные микрофиламенты в кортикальном слое клеток. Таким образом, на основе полученных данных об ультраструктуре цитоскелета, вязкости плазматических мембран и внутриклеточного рН в ИПСК при нейральной и эпителиальной дифференцировках определяли специфичный параметр, изменения которого проявлялись бы ранее других на ранних сроках. Стоит отметить, что в клетках ПМ мы наблюдали значимые изменения только по одному параметру –вязкости плазматической мембраны. Мы наблюдали ее снижение от 397,4 сПз в ИПСК до 305,9 сПз в клетках ПМ. В случае НСК выявлены изменения по всем трем параметрам: внутриклеточный рН увеличивался от 7.2 в ИПСК до 7.3 в НСК, вязкость плазматической мембраны снижалась от 397,4 сПз в ИПСК до 340,9 сПз в НСК, актиновый цитоскелет в НСК образовывал звездчатоподобную структуру из тонких разнонаправленных нитей по сравнению с обширной сетью актиновых волокон, заполняющих всю клетку целиком в ИПСК. Таким образом, учитывая изменения каждого из параметров, наблюдаемые в клетках ПМ и в НСК, мы считаем, что возможным специфичным параметром для двух дифференцировок можно назвать вязкость. Однако стоит учитывать, что дифференцировка стволовых клеток сложный процесс и сопровождается серьезной перестройкой как функциональных, так и структурных показателей. Так, эффективный контроль дифференцировки стволовых клеток является большой проблемой из-за сложных взаимосвязей между различными сигнальными путями, внеклеточным микроокружением и метаболическими требованиями клетки. На наш взгляд только комплексный анализ данных показателей позволит выявить степень дифференцировки стволовых клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Данный проект направлен на комплексный структурно-функциональный анализ метаболической активности, рН, ультраструктуры цитоскелета и вязкости цитоплазматической мембраны в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека при направленных дифференцировках. При выполнении второго этапа проекта получены следующие результаты: Была проведена направленная дифференцировка ИПСК в дермальном и эпидермальном направлениях. В ходе работы получали специализированную популяцию клеток дермы – клетки дермальной папиллы волосяного фолликула и эпидермальные кератиноциты. В работе необходимые клетки получали путем направленной дифференцировки ИПСК линии Kyoto. Для получения клеток дермальной папиллы и эпидермальных кератиноцитов, несущих метку SypHer 2, использовали линии ИПСК-SypHer 2. В качестве положительного контроля при подтверждении дифференцировки использовали первичные клетки дермальной папиллы человека и первичные кератиноциты человека, соответственно. При дермальной дифференцировке результаты количественного ПЦР анализа показали снижение маркеров плюрипотентности в течение дифференцировки – SOX2, OCT4 и NANOG. На стадии нейральных прогениторных клеток возрастала экспрессия маркеров нейральных клеток – PAX6, NESTIN и β3 TUBULIN. После стадии нейральных прогениторных клеток при мезенхимной дифференцировке экспрессия данных маркеров снижалась. В то же время наблюдали возрастание специфических мезенхимных маркеров – виментина, гладкомышечного актина (αSMA) и фибронектина (FN1). По уровню экспрессии данных маркеров полученные в результате дифференцировки клетки дермальной папиллы соответствовали первичным клеткам человека. Результаты количественного ПЦР анализа подтвердились при помощи иммуногистохимического окрашивания. Результаты показали соответствующее снижение экспрессии маркеров плюрипотентности, повышение продукции нейральных маркеров на стадии нейральных прогениторных клеток. К терминальной стадии дифференцировки возрастает экспрессия специфических мезенхимных маркеров и специфических маркеров клеток дермальной папиллы. Результаты количественного ПЦР анализа в реальном времени при дифференцировке кератиноцитов показали исчезновение экспрессии маркеров плюрипотентности и повышение экспрессии специфических эпидермальных маркеров. Повышалась экспрессия ключевого регулятора эпидермальной дифференцировки, транскрипционного фактора Р63. Экспрессия специфического цитокератина 18 достигала своего пика на стадии предшественников эпидермальных кератиноцитов. Экспрессия цитокератина 14 повышалась при созревании эпидермальных кератиноцитов. Результаты количественного ПЦР анализа подтвердись иммуногистохимическим окрашиванием. Таким образом, все полученные линии и культуры клеток были охарактеризованы двумя независимыми методами в полном соответствии с заявленным планом работ Получены данные по изменению внутриклеточного рН в ИПСК в процессе дермальной (дермальные МСК) и эпидермальной дифференцировок (предшественники кератиноцитов и кератиноциты) с использованием pH-сенсора SypHer 2 и флуоресцентной микроскопии. В предварительных экспериментах была проведена калибровка с pH-сенсором SypHer-2 для перевода условных единиц рН в абсолютные единицы. Среднее значение соотношений интенсивностей флуоресценции в ИПСК составило 0,343±0,058 условных единиц, что по калибровочной кривой соответствовало абсолютным значениям рН – 7.39±0.02. На промежуточной стадии дифференцировки ИПСК в дермальные МСК - в нейральных прогениторных клетках - наблюдали схожие значения рН (7.3±0.02). В дифференцированных клетках (клетках дермальной папиллы) значения рН незначительно смещались в кислую сторону – 7.28±0.02. В предшественниках кератиноцитов и кератиноцитах в соответствии с калибровкой были получены значения рН - 7.4 ±0.01 и 7.8 ±0.01 соответственно. На данном этапе проекта нами продолжены работы по анализу внутриклеточного рН в клетках первичной мезодермы (ПМ) и эндотелиальных клетках. Были получены линии трансфицированных SypHer2 клеток ПМ и эндотелиальных клеток с высоким процентом выживаемости в соответствии с адаптированной методикой. В клетках ПМ и эндотелиальных клетках в соответствии с калибровочной кривой были получены значения рН =7.47±0.01 и рН =7.1±0.02 соответственно. Получены данные о вязкости цитоплазмы (цитоплазматической мембраны) на разных стадиях дермальной и эпидермальной дифференцировки ИПСК с использованием флуоресцентного молекулярного ротора BODIPY C3++ и FLIM микроскопии. Для улучшения качества окрашивания клеток на данном этапе проекта нами был использован новый ротор BODIPY C3++. Анализ микровязкости цитоплазматической мембраны ИПСК, направленных в дермальном и эпидермальном направлениях был проведен по изменению времени жизни молекулярного ротора BODIPY C3++ в соответствии с калибровочной кривой. Вязкость мембраны в ИПСК составила 482.41±81.7 сПз. Отличие полученного значения вязкости мембраны ИПСК, окрашенных BODIPY 2 (первый год выполнения проекта), вероятно связано с лучшей растворимостью ротора BODIPY C3++ и соответственно лучшим прокрашиванием клеток. При дермальной дифференцировке ИПСК в нейральных прогениторных клетках и в дифференцированных клетках дермальной папиллы наблюдали снижение вязкости (375.2±82.4 и 298.64±83.28 сПз, соответственно) по сравнению с недифференцированными ИПСК (статистически значимые различия, р≤0.05). При эпидермальной дифференцировке ИПСК также был обнаружен статистически значимый сдвиг в сторону уменьшения вязкости мембран предшественников кератиноцитов (384.04±83.73 сПз) и кератиноцитов (331.58±83.4 сПз). Получены данные об изменениях в ультраструктуре цитоскелета клеток-предшественников (предшественников кератиноцитов) и дифференцированных клеток (кератиноцитов и дермальных МСК) с использованием флуоресцентного красителя Sir-actin и флуоресцентной микроскопии. На первом этапе проекта было показано, что в ИПСК актиновый цитоскелет представлен обширной сетью волокон, заполняющих всю клетку целиком. В примембранном пространстве хорошо дифференцируются отдельные стресс-фибриллы. При эпидермальной дифференцировке ИПСК можно наблюдать высокую концентрацию актиновых фибрилл в местах клеточных контактов на периферии клеток. В зрелых кератиноцитах показаны плотные тяжи фибрилл актина, равномерно располагающиеся как вокруг ядра, так и в периферической области клеток. В нейральных прогениторных клетках – предшественниках клеток дермальной папиллы - актин образовывал звездчатоподобную структуру из тонких разнонаправленных нитей. В данной культуре наблюдали плотное расположение самих клеток и большое количество межклеточных контактов (данные получены на первом этапе проекта). Клетки же дермальной папиллы имели вытянутую форму с продольно расположенными плотными тяжами актиновых фибрилл. На основе полученных данных об ультраструктуре цитоскелета, вязкости плазматических мембран и внутриклеточного рН в ИПСК при дермальной и эпидермальной дифференцировках определяли специфичный параметр, изменения которого проявлялись бы ранее других. Значимые изменения в предшественниках дифференцированных клеток (клеток дермальной папиллы и кератиноцитов) мы наблюдали лишь по одному параметру - вязкости цитоплазматической мембраны. Аналогичный результат был получен и в первый год выполнения проекта для нейральной и эпителиальной дифференцировок ИПСК. Основываясь на данных недавней статьи (Takahisa Matsuzaki et al., 2018), где авторы также продемонстрировали, что изменения мембранной вязкости и жесткости предшествуют изменению уровня поверхностных маркеров, мы полагаем, что данный показатель является чувствительным и может быть эффективен при оценке клеток, выходящих из плюрипотентного состояния. Несомненно, полученные в первый и второй год проекта результаты по комплексному структурно-функциональному анализу ИПСК при направленных дифференцировках, носят более фундаментальный характер. Однако стоит отметить, что в проекте изучены новые специфичные показатели дифференцировки ИПСК и предложены высокотехнологичные подходы к их анализу, которые в дальнейшем могут использоваться в прикладном аспекте для задач регенеративной медицины. Более того, на третьем этапе проекта с использованием полученных данных будет разработан эффективный малоинвазивный метод отбора дифференцированных стволовых клеток с дальнейшей трансляцией в клеточную медицину. По результатам выполнения второго этапа проекта 1 статья принята в печать (журнал Methods and Applications in Fluorescencе, IF =2.165, Q1, WOS и SCOPUS), 1 статья находится на втором этапе рецензирования (Molecular Biology Reports, IF= 1.8, WOS и SCOPUS), 1 статья подана в журнал (Scientific Reports, IF=4.609, WOS и SCOPUS). Научные результаты проекта представлены на 4х международных конференциях с устными докладами.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью проекта 2019-2020 гг являлось комплексное исследование структурно-функциональных изменений в индуцированных плюрипотентных клетках человека при направленных дифференцировках и разработка метода эффективного малоинвазивного отбора стволовых клеток для задач регенеративной медицины. Все заявленные в проекте задачи и публикационные индикаторы выполнены полностью. Более того, были проведены дополнительные исследования и выполнен задел для продления проекта. При выполнении третьего этапа проекта получены следующие результаты: Была проведена направленная дифференцировка ИПСК линии Kyoto в нейральном, эндотелиальном, дермальном и эпидермальном направлениях. В дальнейшем исследовали метаболический статус ИПСК, клеток-предшественников (нейральных предшественников, клеток первичной мезодермы, предшественников кератиноцитов) и дифференцированных клеток (нейронов, эндотелиальных клеток, кератиноцитов и дермальных МСК) В ходе работы были измерены интенсивности флуоресценции, времена жизни флуоресценции и вклады времен жизни флуоресценции клеточных метаболитов энергетического обмена НАД(Ф)Н и ФАД во всех клеточных линях. Значительное снижение редокс-отношения ФАД/НАД(Ф)Н как в НСК, так и в нейронах по сравнению с ИПСК, а также увеличение вклада связанной формы НАДН и НАДФН в НСК и нейронах и уменьшение времени жизни флуоресценции свободной формы НАДН в нейронах свидетельствовали о гликолитических фенотипах НСК и более окислительном состоянии нейронов, а также усилении синтетической активности в ИПСК в процессе нейральной дифференцировки. Дополнительно (сверх плана), полученный результат с использованием метаболического FLIM имиджинга был подтвержден стандартными биохимическими методами. Анализ метаболического статуса клеток при эндотелиальной дифференцировке показал снижение редокс-отношения в клетках первичной мезодермы и его увеличение в ЭК по сравнению с ИПСК. В то же время значимые изменения вкладов времени жизни флуоресценции связанной форм НАД(Ф)Н наблюдали только в ЭК. Исходя из полученных результатов, мы предполагаем, что увеличивается вклад окислительного фосфорилирования в энергетический метаболизм в процессе эндотелиальной дифференцировки. При дермальной и эпидермальной дифференцировке наблюдали значительное увеличения редокс-отношения в дермальных фибробластах по сравнению с ИПСК (р<0,05), в то время как клетки-предшественники кератиноцитов продемонстрировали лишь незначительное увеличение редокс-отношения; значимое увеличение наблюдалось в кератиноцитах. Оценка вкладов времен жизни флуоресценции НАД(Ф)Н и ФАД выявила: увеличение вкладов связанной формы НАД(Ф)Н в дермальных фибробластах, в предшественниках кератиноцитов и зрелых кератиноцитах по сравнению с ИПСК; увеличение вклада времени жизни закрытой формы ФАД в дермальных фибробластах и отсутствие изменения вклада закрытой формы ФАД в клетках предшественниках кератиноцитов по сравнению с ИПСК. Увеличение вклада связанной формы НАД(Ф)Н и увеличение вклада закрытой формы ФАД в этих клетках говорит о преобладании окислительного фосфорилирования (ОКФОС) в энергетических процессах. Был проведен сравнительный анализ данных по эффективности использования эндогенных флуорофоров для оценки метаболизма в ИПСК и мезенхимных стволовых клетках. FLIM метод более чувствительный по сравнению с флуоресцентной микроскопией, оценивающей интенсивности флуоресценции НАД(Ф)Н и ФАД (redox отношение). На основании полученных данных по изменению метаболического статуса в качестве основного критерия отбора дифференцированных клеток от недифференцированных ИПСК было определено сочетание времен жизни флуоресценции и вкладов времен жизни флуоресценции. Для эффективного определения метаболического статуса как результативный флуорофор был определен кофактор НАД(Ф)Н. С учетом выявленных критериев был разработан метод отбора дифференцированных клеток от недифференцированных ИПСК. Кроме того, были проведены дополнительные эксперименты по изучению метаболического статуса различных субпопуляций гетерогенных культур, полученных при дермальной и эндотелиальной дифференцировках ИПСК. В качестве задела для продления проекта проведены дополнительные исследования (не заявленные в плане работ) по оценке метаболического статуса и уровня оксигенации 3D моделей ИПСК при нейральной дифференцировке (нейросферах).