Аннотация результатов, полученных в 2017 году
За время выполнения проекта проведена работа по ряду направлениям в области миелодиспластического синдрома (МДС) для достижения целей проекта. Проведен расширенный анализ клинических факторов, влияющих на исходы как лечения миелодиспластического синдрома гипометелирующими препаратами, так и исходов выполнения аллогенной трансплнатации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК). Понимание факторов клинических и молекулярных факторов, влияющих на конечные исследуемые точки, такие, как ответ на терапию и выживаемость, играет ключевое значение для оценки влияния на исходы новых исследуемых факторов. Кроме того, проведена подготовка к анализам результатов иммуногистохимического исследования костного мозга на молекулы системы «контрольных точек». Поскольку отсутсвуют стандарты и клинические рекомендации оценки подобных иммуногистохимеских препаратов исследовательской группе потребовалось разработать собственные алгоритм, включающий как морфологические, так и количественные показатели оценки экспрессии рецепторов и лигандов системы «контрольных точек». Третьим направлением работы по гранту была подготовка к секвенированию криоконсервированных образов ДНК. Из существующего биобанка отобрано 50 образцов пациентов, получавших гипометилирующую терапию до, так и после ТГСК. Перед выполнением секвенирования нового поколения, выполнено секвенирование наиболее часто встречающихся генов. Выявлены зоны точечных мутаций, которые позволяет в дальнейшем быть референсным контролем при выполнении биоинформатики результатов NGS.Четвертым направлением работы по гранту стала подготовка документации и одобрение этическим коммитетом независимого клинического исследования (NCT03259516), проводимого в рамках научно-исследовательской работы университета. В исследовании используется сочетание стандартной для МДС химиотерапии с низких доз ингибиторов контрольных точек. Далее представлены результаты по каждому направлению. В рамках анализа клинических и молеклярных факторов прогноза в отношении ответа на терапию и выживаемость проведены два больших исследования. В первом объединены опубликованные и доступные в открытом доступе индивидуальные данные более 1000 пациентов с МДС, которым выполнено полногеномное или полноэкзомное секвенирование. Одним из важных результатов этого мета-анализа оказалась крайне высокая генетическая гетерогенность МДС в исследованиях из разных стран, что подчеркивает важность проведения подобных исследований в РФ. Также полученные результаты отчасти подтвердили ранее опубликованные данные о более высокой вероятности ответа на терапию пациентов с мутацией в гене p53, и худшей общей выживаемостью при наличии мутаций в генах p53, TET2 и DMT3A, лучшей выживаемость у пациентов с мутацией SF3B1 (чаще всего ассоциирована с формой МДС с кольцевыми сидеробластами). Что особенно важно, при объединении данных всех исследований, выявлено что различия в вероятности и ответа на гипометилирующие препараты и выживаемости невелики. Выявленная разница в выживаемости между пациентами, например, с мутациями в генах p53 и SF3B1 составляет около 5%. Хотя параметры анализа не позволяли определить временной интервал, на котором эти различия наблюдались. Тем не менее, полученные результаты говорят о том при существующих методах лечения гипометилирующими препаратами выполнение стандарной мутационной панели, хотя и является крайне дорогостоящим, несет ограниченное прогностическое клиническое значение, что подчеркивает важность продолжения поиска новых факторов прогноза. Другим направлением изучения клинических факторов прогноза было исследование результатов аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК). На сегодняшний день это единственный медот радикального излечения МДС. Были проанализированы результаты 60-ти аллоТГСК с длительным временем наблюдения после трансплантации. В настоящий момент существует ряд прогностических индексов, которые позволяют предсказывать эффективность терапии при МДС (IPSS, IPSS-R, WPSS) и ряд трансплантационных индексов, которые прогнозируют эффективность трансплантации (EBMT, DRI, HCT-CI, Armand et al., Kroeger et al.). Однако, в литературе имеется крайне ограниченное количество статей, где валидируются эти индексы у пациентов с МДС, получающих аллоТГСК. На репрезентативном клиническом материале показано, что наилучшей пргностической значимостью обладает индекс риска заболевания (DRI), и именно этот параметр может использоваться как корегирующий кофактор при многофакторном анализе значимости мутаций микроокружения и экспрессии молекул контрольных точек при аллоТГСК. Другими значимыми клиническими ко-факторами оказались развитие легкой острой РТПХ (1-2 степени) и инфекционные осложнения в ранний период после ТКМ. Таким образом, был подготовлен базис для анализа экспериментальных данных. В направлении иммуногистохимического исследования молекул «контрольных точек» проведена работа по определению подходов к интерпретации полученных данных. В настоящий момент отсутствуют стандарты патологоанатомических результатов в этой области. Была разработана система бальной оценки как количественной экспрессии PD-1, так и качественных характеристик лимфоцитарных инфильтратов. На первом этапе подсчитывали количество и долю клеток (среди всех миелокариоцитов и среди CD3+ клеток) с ярким окрашиванием (m=3), окрашиванием средней интенсивности (m=2) и слабым окрашиванием (m=1). Степень окрашивания оценивалась визуально. Интенсивность экспрессии (M) рассчитывалась по формуле: M = ΣV*m/N, где V – доля PD-1+ клеток, m – степень экспрессии, N – количество случаев в группе. Также учитывалось наличие локальных скоплений PD-1 позитивных лифоцитов, что свидетельствовало о локальном подавлении иммунного ответа через систему «контрольных точек». Следующим этапом планируется применить эту систему для оценки влияния экспрессии молекул «контрольных точек» на выживаемость. В качестве подготовки к анализу и интерпретации результатов анализа проб ДНК методом NGS проведено выборочное секвенирование генов DMT3A, TET2, ASXL1 и TP53 по Сэнгеру. Выборочно исследовались следующие гены: DNMT3A (18 пациентов), ASXL1 (21 пациент), TP53 (6 пациентов) и SF3B1 (13 пациентов). В генах DNMT3A и TP53 у исследуемых пациентов мутаций обнаружено не было. В гене SF3B1 у двух пациентов были обнаружены точечные миссенс-мутации p.H662Q и p.K700E. В гене ASXL1 у 33% пациентов были обнаружены мутации c.1773C>G, c.1879dupG, c.1900_1922del., с.1934dupG, c.1935dupT, c.1954G>A. Полученные результаты будут положительным контролем при анализе результатов NGS. Последним направлением деятельности в рамках тематики гранта была инициация независимого клинического исследования (NCT03259516), проводимого в рамках научно-исследовательской работы университета. В этом пилотном исследовании планируется сочетать низкие дозы ингибитора «контрольной точки» ниволумаба с химиотерапией (малыми дозами цитозара, мелфаланом, азацитидином, лимфодеплецией). В исследования включаются пациенты не кандидаты на аллоТГСК, либо рецидивировавшие после ТГСК и не ответившие по крайней мере на 1 линию терапии (гипометилирующие или леналидомид). Данная группа пациентов имеет крайне неблагоприятный прогноз и продолжительность жизни менее 3-6 месяцев несмотря на проводимое лечение. На момент написания отчета пролечено 2 пациента без неожиданных побочных эффектов. Наиболее впечатляющим результатом был регресс клона с цитогентической поломкой (5q-) со 100% до 70% (по цитогенетике и FISH) и восстановление нормального кроветворного клона, что говорит об потенциальной эффективности иммунотерапии при МДС. Первые клинические результаты свидетельствуют, что для достижения стойкого ответа и излечения от МДС требуется дальнейшее изучение взаимодействия опухолевого клона и иммунной системы под воздействием ингибиторов «контрольных точек». Основная часть исследований по оценке иммуногистохимической экспрессии молекул и лигандов «контрольных точек» PD-1, LAG3, CTLA4, B7, TIM3, а также секвенированию с помощью NGS панели генов DROSHA, DICER1, SBDS и LET-7, PD-1, ASXL1, DNMT3A, TP53, SF3B1 запланирована на вторую половину мая-июнь 2018 в связи с задержкой поставок в университет необходимых реактивов для имумногистохимии и секвенирования.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
За отчетный период проведено развернутое исследование трепанобиоптатов 27 реципиентов аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и 30 пациентов с МДС, получавших консервативную терапию. Была разработана оригинальная система оценки экспрессии белков «контрольных точек» в препаратах: 0,5 балла - единичные клетки, в отдельных полях зрения. 1 балл - единичные клетки, встречаются в каждом поле зрения. 1,5 балла – В части полей зрения - умеренное количество позитивных клеток, в части полей – единичные клетки. 2 балла – Умеренное количество позитивных клеток, диффузное распределение. 2,5 балла – в части полей зрения количество позитивных клеток >50% миелокариоцитов, в части полей – умеренное количество. 3 балла – количество позитивных клеток больше 50%, образуют скопления из 5 и более клеток. 4 балла - экспрессия антигена на более чем 90% клеток. Экспрессия считалась положительной, если визуализировалось мембранное окрашивание. Допускалось мембранно-цитоплазматическое окрашивание. Ядерное окрашивание считать сомнительным. Данная система использовалась при оценке результатов. Проводилась окраска на следующие молекулы системы контрольных точек: PD-1, PD-1L, PD-2L, CD80 (лиганд CTLA4), TIM3, Galectin 9, LAG3. Доля пациентов у которых наблюдалась экспрессия ингибиторов контрольных точек на 1 бал и более (более 10% клеток или, по крайней мере, 1 позитивная клетка на поле зрения) составила: 44% для PD-1 положительных лимфоцитов, 6% для PD-1L, 46% для PD-2L, 4% для LAG-3, 100% для TIM3, 89% для Gal9, 31% для CD80 (лиганд CTLA4). Выявлена достоверная положительная корреляция в уровне экспрессии PD-2L и TIM3 (р=0.0003). Также выявлена взаимосвязь между уровенем экспрессии PD-2L и CD80. У пациентов с высокой экспрессией PD-2L также наблюдалась и повышенная экспрессия CD80 (p=0.001). Достоверной взаимосвязи между уровнем экспрессии других молекул контрольных точек не выявлено, т.е. экспрессия различных лигандов и рецепторов ингибиторов контрольных точек является независимой. Для вовлеченных сигнальных систем PD-2L и TIM3 не было выявлено статистически достоверной связи с клиническими характеристиками заболевания, включая количество бластов, цитогентический риск, прогностические шкалы. Уровень экспрессии TIM3 несмотря на высокую экспрессию у всех пациентов, тем не менее, достоверно не влиял на общую (р=0.97) и безрецидивную выживаемость (р=0.38). В то же время высокая экспрссия PD-2L и CD80 были значимыми предикторами плохой 2-летней выживаемости пациентов (89% против 63%, р=0.06 и 93% против 67%, р=0.04, соответственно). Был начат набор пациентов с проспективную группу, в которой выполняется комплексная оценка экспрессии лигандов (CD152, CD80, CD272-CD276) на миелоидных клетка и супрессорных популяциях, а также рецепторов контрольных точек на лимфоцитах и NK клетках. На момент написания отчета обследовано 17, что составляет четверть от запланированного объема пациентов. Предварительные результаты проточной цитометрии показали, что у пациентов с МДС наблюдаются значимые популяции CD4 и CD8 лимфоцитов, экспрессирующие PD-1 (16% и 24% от общего числа) и TIM3 (1% и 5%), соответственно, что свидетельствует о подавлении противоопухолевого иммунитета посредством PD-1 и TIM3 системы. Около 1% субпопуляций NK клеток также экспрессируют TIM3. В то же время, на миелоидных клетках и Т-регуляторах определяются PD-1L и PD-2L лиганды, причем PD-1L превалирует. Отсутствие высокой экспрессии PD-1L в трепонобиоптатах свидетельствует о том, что методика окраски может быть не применима к трепанобиоптатам из-за особенностей этого гистологического материала, указанного выше. Важным наблюдением было то, что количество клеток экспрессирующих TIM3 в зоне миелоидных предшественников было значимо больше, чем количество лимфоцитов с экспрессией данного рецептора. В связи с этим, нельзя исключить роль TIM3 не только в рамках подавления противоопухолевого ответа, но и в качестве механизма, вызывающего апоптоз и неэффективный гемопоэз при МДС. Таким образом, в ходе исследований выявлена значимое влияние экспрессии PD-2L и CD80 на прогрессию МДС, причем у части пациентов эти два лиганда контрольных точек ко-экспрессируются, и у всех пациентов они ко-экспрессируются с TIM3. Таким образом полученные результаты говорят о клинической рациональности двойной или тройном блокады «контрольных точек». Наиболее перспективным является разработка комбинации анти-TIM3 терапии в сочетании анти-PD1 терапии. В рамках выполнения проекта продолжена совершенствование клинических подходов в лечение МДС. Проводилось два независимых клинических исследования. Первое (NCT03259516) оценивало эффективность ингибиторов контрольных точек в сочетании с лимфодеплецией или гипометилирующими препаратами у пациентов с МДС высокого риска, рефрактерным к стандартной терапии. Отмечалось крайне медленный набор пациентов, учитывая быструю трансформацию в лейкоз у рефрактерных пациентов, что было критерием невключения. Лучший ответ полученный у включенных пациентов была стабилизация заболевания. Оглашение данных исследований других центров со схожим дизайном, где была показана только стабилизация заболевания в качестве наилучшего ответа, крайне медленный набор пациентов, высокий процент неудач скрининга в исследование, а также полученные в рамках проекта данные о вовлечении нескольких систем «контрольных точек» помимо PD-1 стали основаниями для прекращения исследования. Второе (NCT02806375) оценивало эффективность новой процедуры выполнения аллогенной трансплантации: использование профилактики реакции «трансплантат против хозяина» с посттрансплантационным циклофосфаном и руксолитинибом. В пилотном независимом исследовании на 20 пациентах было показано, что данный протокол имеет низкую токсичность, хороший контроль реакции «трансплантат против хозяина» и не было зафиксировано ни одного раннего рецидива. Общая выживаемость составила 85%, что в два раза превышает результаты для группы миелопролиферативных заболеваний. В ходе исследования охарактеризованы иммунологические и фармакокинетические аспекты нового режима с использованием масс спектрометрии, иммуноферментного анализа и оценки экспрессии JAK-STAT генов с помощью количественной полимеразной реакции. Учитывая, что при МДС основной причиной неудач трансплантации являются рецидивы заболевания, разработанный подход позволит улучшить прогноз кандидатов на аллоТГСК.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Завершен биоинформатический и статистический анализ результатов секвенирования нового поколения в отношении генов процессинга микро-РНК и генов «контрольных точек», которые обычно не входят в стандартные миелоидные панели. Были проанализированы результаты секвенирования c использованием таргетной индивидуальной панели SeqCap EZ Prime Choice Probes, включающей следующие гены: ASXL1, CD274 (Programmed cell death 1 ligand 1, PD1-L1), CD276 (В7-Н3 ligand to CTLA4 and CD28 receptors), DICER1 , DNMT3A, DROSHA, EZH2, IDH1, IDH2, LAG3, MFSD11 (Major facilitator superfamily domain containing 11), PDCD1 (Programmed cell death 1 receptor), PIKFYVE (Phosphoinositide kinase, FYVE-type zinc finger containing), RUNX1, SF3B1, SRSF2, TET2, TET2 and TP53. Выявлено, что среди генов, ассоциированных с клональным гемопоэзом, наибольшая частота мутаций наблюдалась в генах ASXL1 и TET2, что полностью соответствует литературным данным. Однако, было выявлено, что ген DICER1 имеет схожее число мутаций с ASXL1, умеренное число мутаций также наблюдалось в гене DROSHA. Среди генов «контрольных точек» наибольшее количество мутаций наблюдалось гене PD-1L и B7-H3, у 86% и 80% пациентов, соответственно. Ген PD-1 рецептора был мутирован у 14% пациентов, CTLA4 и LAG3 у 11% каждый. Был выполнен кластерный анализ и разделение всех пациентов на 2 кластера. В отношении времени до прогрессирования известные эпигенетические мутации позволяли статистически достоверно выделять группы неблагоприятного прогноза. Медиана времени до прогрессирования при отсутствии мутации в гене SF3B1 составила 35 месяцев, при наличии мутации в гене SF3B1 медиана ВП не достигнута (р=0.043). При наличии ≥2 мутаций в генах метилирования – 12 месяцев, в других случаях медиана не достигнута (р=0.024). При наличии мутации в гене TP53 – 6 месяцев, при отсутствии – 43 месяца (р=0.023). В многофакторном анализе наличие мутации в генах TP53 или ≥2 мутаций в генах метилирования сохранили свое неблагоприятное значение в отношении времени до прогрессирования вне зависимости от проведенного консервативного лечения или аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) (отношение рисков 7,1; 95%ДИ 2,6-19,6; p=0.0001). Тем не менее, только эпигенетические мутации в условиях проводимой консервативной терапии и алло-ТГСК не позволяли прогнозировать общую выживаемость, которая составила 50% и 57% в вышеуказанных группах с и без 2 мутаций/р53 (р=0.4). Поэтому, полученные данные в результате кластеризации были оценены в отношении клинического течения и прогноза. В определенных кластерах наблюдалась сходная клиническая картина за исключением различий в уровне нейтрофилов (р=0.013) и тромбоцитов (р=0.085) в дебюте заболевания. Тем не менее, выявлены значительные различия в выживаемости пациентов: 72% (95%CI 42-89%) vs 27% (95%CI 8-51%), причем, эти различия оставались достоверными при коррекции по клинической шкале риска IPSS-R (отношение рисков 4.2, 95%ДИ 1.3-13.6, p=0.016). Анализ того, как взаимодействуют между собой «классические» для МДС мутации и выявленные в генах DICER1, DROSHA и генах контрольных точек, показал относительно равномерное распределение мутаций DICER1, DROSHA и генов «контрольных точек» у пациентов с мутациями ASXL1, EZH2, RUNX1, TET2 и IDH1 (Рисунок 6 дополнительных материалов). Это свидетельствует, что мутации в DICER1 не являются сцепленными патогентическими механизмами с эпигенетическими мутациями, а накапливаются параллельно. Тем не менее, учитывая выявленное значительное ухудшение общей выживаемости могут вносить негативный вклад в эффективность терапии, в том числе гипометилирующих препаратов и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Второй крупный блок работ включал анализ результатов оценки состояния системы «контрольных точек» в костном мозге у пациентов с миелодиспластическим синдромом. В анализ вошли 57 проспективных пациентов с МДС, которым в 2019-2020 гг. выполнено исследование аспирата костного мозга. Среди лимфоидных популяций обращал на себя внимание крайне высокий процент PD-1 положительных лимфоцитов (10,5±8,0% от всех ядросодержащих клеток), включая PD-1 положительные CD4 лимфоциты (6,3±3,7%) и CD8 лимфоциты (4,7±3,5%) (Таблица 1 дополнительных материалов). Интересно, что в среднем 63±34% всех лифоцитов являются PD-1 положительными, что свидетельствует о крайней степени истощения лимфоцитарного Т-клеточного иммунитета и значимой эксплуатиции PD-1 системы злокачественной опухолью. Среди лигандов PD-1 системы преобладает PD-1L, который хотя и присутствует на ранних миелоидных предшественниках в небольшом количестве (2,2±0,39% от ядросодержащих клеток), тем не менее, большая часть PD-1L лиганда экспрессируется на гранулоцитах в процессе их дифференцировки из миелоидных предшественников (5,8±4,1% от ядросодержащих клеток), причем у некторых пациентов доля таких гранулоцитов доходит до 23%. При этом на клетках моноцитарного ряда PD-1L практически не экспрессируется, а экспрессируется CD80, лиганд к CTLA4 (1.6±0.7% от ядросодержащих клеток). Интересно, что несмотря на наличие экспрессии CD80 на моноцитарных и дендритных клетках, рецептор к этому лиганду на Т-лимфоцитах практически отсутствует. Доля таких клеток составляет всего 0,02±0,01%, то есть экспрессия CD80 обеспечивает скорее активацию лифоцитов через взаимодействие с CD28, а не подавление иммунного ответа через CD152. Таким образом, можно констатировать, что CTLA4 не имеет клинически значимой роли при МДС. Одновременно, зафиксировано определенное количество TIM3 положительных лимфоцитов, доля которых составляет 0,42±0,16%, а процент лимфоцитов, несущих этот рецептор составила 3,6±1,2%. Тем не менее, значимо большая экспрессия TIM выявлена на NK клетках. Доля таких клеток составила 1,3±0,6% от всех ядросодержащих, при этом 30% от всех NK клеток несли на себе TIM3 рецептор. Известно, что помимо функции «контрольных точек» миелоидные опухоли эксплуатируют GAL9-TIM3 систему для увеличения пролиферативной активности. Точные биологические механизмы этого не известны. Несмотря на выраженную окраску на TIM3 миелоидных клеток при иммуногистохимии, при проточной цитометрии зафиксировано только 0.1% клеток из ранних миелоидных предшественников, которые экспрессировали TIM3 рецептор, в то же время доля TIM3 положительных миелоидных клеток увеличивается в процессе созревания. Точно так же, как и в случае с PD-1L. Экспрессия Gal9 была незначительной, так как это секретируемый в межклеточное пространство белок. Лишь небольшой процент связан с клеточной мембраной. Анализ корреляционной матрицы показал, синхронные изменения в костном мозге количества большинства Т-клеточных популяций. Отмечена негативная корреляция уровня миелоидных опухолевых предшественников, активно экспрессирующих лиганды «контрольных точек» и активированных Т-клеток, экспрессирующих ICOS (CD223), NK клеток, NKT. Общее количество миелоидных опухолевых предшественников положительно коррелировало с количеством PD-1-положительных лимфоцитов. Таким образом, выявлено, что экспрессия лигандов «контрольных точек» опухолевыми клетками при МДС способствует подавлению активации Т-клеток, снижению количества инфильтрирующих костный мозг лимфоцитов и способствует увеличению количества бластных клеток. Причем экспрессия лигандов в основном реализуется при созревании бластных клеток в гранулоциты, которые являются основной популяцией, экспрессирующей эти ингибиторные молекулы. Ведущую роль в подавлении Т-клеточного ответа при МДС играет система PD-1-PD-1L, система CTLA4 играет минорную роль. Вторая по значимости система это GAL9-TIM3, при этом в отношении NK клеток она играет большее значение, чем в отношении Т-клеток. Таким образом, полученные данные обосновывают комбинированную анти-TIM3 и aнти-PD-1 терапию при МДС высокого риска. Выявление значимого количества мутаций этих генов может быть механизмом резистентности к моноклональным антителам, что обосновывает необходимость конформационных исследований мутированных вариантов рецепторов и создание малых молекул-ингибиторов этих рецепторов, которые бы позволили обойти конформационные альтерации в результате соматических мутаций. Кроме того, выявленное нарастание количества PD-1L и TIM3 при созревании гранулоцитов в условиях клонального гемопоэза, обосновывают необходимость выявления внутриклеточных механизмов обеспечивающих эти биологические события с целью их последующего ингибирования.