КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-75-20095

НазваниеРазработка эффективного способа коррекции мутации F508del при муковисцидозе с помощью геномного редактирования

РуководительСмирнихина Светлана Анатольевна, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова", г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2020 

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-402 - Медицинская генетика

Ключевые словаТерапия муковисцидоза, геномное редактирование, CRISPR/Cas9, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, ИПСК

Код ГРНТИ34.15.23, 76.03.39, 34.15.27


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Несмотря на существенные успехи, достигнутые в последние годы в лечении самого частого наследственного заболевания – муковисцидоза (разработка патогенетического лечения, усовершенствование симптоматической терапии), это заболевание остается неизлечимым. Между тем, развитие недавно появившихся методов геномного редактирования с использованием специфических нуклеаз открывает новые горизонты в разработке этиотропного лечения наследственных заболеваний, включая муковисцидоз (МВ). Геномное редактирование, в том числе CRISPR/Cas9, позволяет редактировать, «исправить» мутацию в гене, и, в отличие от традиционной генной терапии, демонстрирует довольно высокую эффективность и, что самое главное, позволяет закрепить «скорректированный» аллель в геноме. Несмотря на существование довольно сильной конкуренции как среди научных групп, так и среди коммерческих компаний в области разработки лечения МВ с использованием геномного редактирования, постоянно развивающиеся технологии позволяют усовершенствовать данный подход, увеличивая его эффективность и специфичность, что делает исследования в этой области перспективными и актуальными, даже в условиях сильной конкуренции. Целью данного проекта является разработка способа таргетной коррекции самой частой при МВ мутации p.F508del в гене CFTR с помощью технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9. В данном проекте мы планируем разработать два подхода к исправлению мутации F508del: 1. редактирование мутации в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИСПК), полученных от пациентов с МВ; 2. коррекцию мутации в клетках респираторного эпителия, полученного из нередактированных ИПСК, или в культуре иммортализованного эпителия трахеи (CFTE29о-) с помощью аденоассоциированного вирусного вектора, несущего компоненты CRISPR/Cas9. Мы выбрали клетки респираторного эпителия в качестве клеточной модели МВ, так как в клинической картине зачастую решающую роль в определении тяжести заболевания играет повреждение легкого. После разработки и отладки работы генно-инженерных конструкций с ферментом редактирования и направляющей РНК, а также со вставкой для направленной гомологичной репарации нормальной (скорректированной) последовательности гена CFTR, полученная система будет применена к редактированию ИПСК, полученных из фибробластов больных МВ с гомозиготной мутацией F508del. Далее ИПСК с редактированной мутацией будут дифференцированы в клетки респираторного эпителия, в которых мы покажем восстановление функции белка CFTR, а также дадим детальную характеристику этих клеток как на геномном, так и на транскриптомном уровнях. Для разработки системного способа редактирования мутации F508del, не привязанного к работе с пациент-специфичными клеточными культурами и последующей трансплантацией, мы планируем использовать вирусный метод доставки компонентов CRISPR/Cas9 на основе аденоассоциированного вирусного вектора (ААВ) 6 серотипа, имеющего тропность к клеткам легкого человека, несущий компоненты CRISPR/Cas9. В целях отработки метода для трансдукции будут использованы полученные из ИПСК клетки респираторного эпителия или клетки CFTE29о-. Коллектив исполнителей владеет всеми ключевыми методиками, необходимыми для реализации различных этапов данного проекта. В случае успешного завершения запланированных работ необходимо будет начать проведение доклинических/клинических исследований, которые в случае успеха приведут к получению уникальной медицинской технологии для лечения частого наследственного заболевания и послужат толчком к развитию аналогичных технологий для многих других болезней.

Ожидаемые результаты
В итоге проведенной работы ожидается получить генетически скорректированные ИПСК и преддифференцированные из них энтодермальные клетки и клетки предшественники легочного эпителия и протоколы получения таких клеток из фибробластов больных муковисцидозом с мутацией F508del. Данные клетки будут проверены на этапах репрограммирования и дифференцировки на предмет сохранности их специфических свойств и генетической безопасности проведенного геномного редактирования, а также дифференцировочного потенциала. Мы проведем коррекцию мутации в клетках респираторного эпителия, полученного из нередактированных ИПСК (или CFTE29o- клеток), с помощью аденоассоциированного вирусного вектора, несущего компоненты CRISPR/Cas9 и покажем эффективность такого подхода редактирования мутации F508del. Несмотря на существование нескольких зарубежных конкурентов, разрабатывающих лечение муковисцидоза с использованием технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9, мы планируем использовать более специфичные ферменты для редактирования генома, что повышает безопасность технологии, а также планируем использовать другой способ, вирусный, для доставки компонентов CRISPR/Cas9 в клетки. В случае успешного завершения запланированных работ, необходимо будет начать проведение доклинических/клинических исследований, которые в случае успеха приведут к получению уникальной медицинской технологии для лечения частого наследственного заболевания и послужат толчком к развитию аналогичных технологий для многих других болезней.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект направлен на разработку генной терапии муковисцидоза с помощью нового инструмента – геномного редактирования. Муковисцидоз – тяжелое наследственное заболевание, симптомы которого появляются уже в детстве. Средняя продолжительность жизни около 35 лет, основной причиной смерти является поражение легких и дыхательная недостаточность. Классическая генная терапия оказалась неэффективной в случае этого заболевания. Недавно появился новый метод генной терапии – геномное редактирование (CRISPR/Cas9), позволяющее прицельно исправить мутацию в гене CFTR, вызывающую заболевание. Для этого в клетку нужно временно ввести бактериальный фермент Cas9, который отсутствует у человека, и направляющую РНК, способную распознать нужный участок ДНК. Оба эти компонента обеспечивают узнавание и разрезание нужного гена, при этом другие гены не затрагиваются. Для лечения наследственных болезней систему CRISPR/Cas9 можно немного изменить, добавив в нее третий компонент – правильный ген, который встраивается в геном вместо поврежденного, после того как CRISPR/Cas9 разрезает ген точно в месте мутации. Важно отметить, что исправление мутации происходит необратимо, то есть исправив мутацию один раз, правильный ген сохраняется в организме точно на своём месте и нет необходимости в дополнительном лечении. Исправить мутацию можно как непосредственно в организме человека, так и в клетках, полученных от больного. Клетки с исправленным геном трансплантируют обратно пациенту. Для разработки такого лечения необходимо провести ряд исследований на клеточных культурах и затем на животных, чтобы показать эффективность и безопасность такого подхода. Данный проект сфокусирован на исследованиях на клеточных культурах. Мы разработали пять эффективных генетических конструкций, которые попав в клетку, распознают мутацию (в нашем случае самую частую мутацию при муковисцидозе – F508del) и разрезают ген CFTR в месте мутации. Наибольшая эффективность разрезания гена получена для одной из конструкций – saCas9-saCFTR#3 – 29%. Мы создали генетические конструкции (плазмиду и короткие последовательности ДНК) с правильным геном для встраивания в геном вместо поврежденного. Не так давно был открыт способ получения стволовых клеток, то есть клеток, способных давать начало разным типам клеток, например, клеткам легких, печени, мышц и т.д. из клеток взрослых людей. Такой подход позволяет получить из клеток кожи стволовые клетки (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – ИПСК) путем их репрограммирования. В дальнейшем из этих стволовых клеток можно получить любые другие клетки, в том числе клетки легких. Нами отработан протокол получения ИПСК из клеток кожи пациентов с мутацией F508del и получены клетки от одного пациента. В дальнейшем в этих клетках мы исправим мутацию F508del в гене CFTR, затем получим из них клетки легкого для дальнейшей трансплантации пациенту. Научным коллективом за отчетный период написано три статьи: обзор по современным методам лечения муковисцидоза и две статьи с результатами работы по проекту. По результатам работы получено четыре устных доклада на Европейской конференции по муковисцидозу (ECFS 2018) и конференции «Геномное редактирование в медицинской генетике 2018» (MGEditing'18, Москва, июнь 2018) и два постерных доклада на Европейской конференции по генетике человека (ESHG 2018).

 

Публикации

1. Смирнихина С.А., Анучина А.А., Кочергин-Никитский К.С., Адильгереева Э.П., Якушина В.Д., Лавров А.В. Коррекция мутации F508del при муковисцидозе с помощью CRISPR/Cas9 Вестник РГМУ, 2018, №2 (год публикации - 2018).

2. Смирнихина С.А., Банников А.В., Анучина А.А., Кочергин-Никитский К.С., Адильгереева Э.П., Лавров А.В. Факторы, влияющие на эффективность CRISPR/Cas9 для коррекции мутации F508del при муковисцидозе Медицинская генетика, Т.16, № 11 (185), с. 32-37 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном году совместно с ФГУ НИИ Пульмонологии ФМБА России было отобрано шесть пациентов старше 18 лет с муковисцидозом. От всех пациентов было получено информированное согласие на участие в этой НИР. У всех пациентов осуществлен забор участка кожи с передней поверхности предплечья, из которого получены культуры фибробластов. В этих культурах была проведена верификация мутаций в гене CFTR, все шесть культур фибробластов были криоконсервированы для дальнейшего репрограммирования в ИПСК. Получены культуры ИПСК от трех пациентов с муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del. Отработаны условия доставки компонентов CRISPR/Cas9 в ИПСК. Подобраны условия до оценки эффективности коррекции мутации F508del. Разработан протокол редактирования мутации F508del в ИПСК с помощью донорной двуцепочечной молекулы ДНК и последующим вырезанием вставки с помощью плазмиды, кодирующей транспозазу. Составлен протокол сортировки GFP+ ИПСК на сортере BioRad S3e Cell Sorter. Проведена оценка эффективности редактирования гена CFTR в области мутации F508del на трех клеточных культурах: HEK293T, CFTE29o- и ИПСК от пациента с муковисцидозом. Показано, что редактирование происходит с наибольшей эффективностью в плазмидном сайте CFTR в ИПСК (9,0-10,1%). Эффективность исправления мутации F508del в культуре CFTE29o- составила от 0% до 1,2%, в ИПСК – от 0% до 0,5%, что хорошо согласуется с литературными данными. Основываясь на имеющихся протоколах дифференцировки ИПСК в функционирующие органоиды дыхательного эпителия, мы разработали собственный протокол дифференцировки. Научным коллективом за отчетный период опубликовано три статьи: две обзорные статьи по теме проекта и одна с результатами работы по проекту. За отчетный период (май 2018 – май 2019) члены коллектива выступили на конференциях с 18 докладами о результатах работы, в том числе с устным докладом на профильной европейской конференции по муковисцидозу. Поданы тезисы на ряд всероссийских и зарубежных конференций. Получено: 3 устных доклада на международном Конгрессе «VII съезд ВОГиС, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (18-22 июня 2019 г., Санкт-Петербург); постерный доклад на Европейской конференции по муковисцидозу (ECFS 2019, 5-8 июня 2019), 2 постерных доклада на Европейской конференции по генетике человека (ESHG 2019, 15-18 июня 2019), 1 постерный доклад на FEBS 2019 (4-11 июля 2019).

 

Публикации

1. - Светлана Смирнихина: редактировать геном в России начнут через четыре года РИА новости, Интервью 17.08.2018 (год публикации - ).

2. - В ФГБНУ "Медико-генетический научный центр" начали редактировать геном стволовых клеток Портал «Genetics-info», 09.09.2018 (год публикации - ).

3. - Генетикам ФГБНУ "МГНЦ" удалось с высокой эффективностью исправить мутацию при муковисцидозе Портал «Genetics-info», 15.01.2019 (год публикации - ).

4. - Светлана Смирнихина: редактировать геном в России начнут через четыре года Портал «Genetics-info», 22.08.2018 (год публикации - ).

5. Кондратьева Е.В., Адильгереева Э.П., Амелина Е.Л., Табаков В.Ю., Анучина А.А., Устинов К.Д., Ясиновский М.И., Воронина Е.С., Лавров А.В., Смирнихина С.А. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов пациента с муковисцидозом Сибирское медицинское обозрение, № 2, стр. 95-101 (год публикации - 2019).

6. Смирнихина С.А., Анучина А.А., Кочергин-Никитский К.С., Адильгереева Э.П., Якушина В.Д., Лавров А.В. Экспериментальные подходы к таргетному редактированию гена CFTR с помощью CRISPR-Cas9 Вестник РГМУ, №2, с. 15-21 (год публикации - 2018).

7. Смирнихина С.А., Анучина А.А., Лавров А.В. Ways of improving precise knock-in by genome editing technologies Human Genetics, Nov 2. doi: 10.1007/s00439-018-1953-5 (год публикации - 2018).

8. Смирнихина С.А., Лавров А.В. Современное патогенетическое лечение и разработка новых методов генной и клеточной терапии муковисцидоза Гены & Клетки, Том XIV, №3, стр. 22-31 (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В текущем году эффективность исправления мутации F508del в гене CFTR была оценена с помощью глубокого таргетного секвенирования (NGS) ампликонов. Эксперименты проводили на трех клеточных культурах (HEK293T, CFTE29o- и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), полученных от пациента с муковисцидозом), в которых оценили эффективность редактирования 48-72 часа после трансфекции компонентов CRISPR/Cas9. Среднее значение покрытия (число прочтений) анализируемого локуса CFTR составило 31585 (от 22850 до 41500). Эффективность коррекции мутации в клеточной культуре HEK293T варьировала от 0,04% до 0,44% аллелей, в зависимости от используемой комбинации CRISPR/Cas9. Точность исправления мутации (то есть коррекция мутации без привнесения дополнительных мутаций в ДНК) варьировала от 61,4% до 90,9%. Совокупная частота коррекции мутации F508del в гене CFTR в клеточной культуре CFTE29o- для двух наиболее эффективных комбинаций CRISPR/Cas9 составила 1,47% и 1,2% аллелей соответственно. Наибольшая эффективность коррекции мутации F508del в гене CFTR в ИПСК составила 3,5% для одной из комбинаций CRISPR/Cas9, однако сопровождалась внесением дополнительных мутаций в редактируемый локус в 21,4% случаев. Получена и полностью охарактеризована культура ИПСК от второго пациента с муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del в гене CFTR. Проведены эксперименты с отбором редактированных клеток ИПСК с целью получения стабильной культуры, имеющей 100% клеток с исправленной мутацией. С помощью программы Cas-OFFinder был составлен перечень генов, которые потенциально могут быть изменены из-за неспецифического действия CRISPR/Cas9. Было обнаружено пять таких регионов в геноме человека. Два из них расположены в последовательности генов, кодирующих белки, остальные три – в пределах одной длинной некодирующей РНК. Расчетная эффективность исправления мутации F508del в гене CFTR с использованием плазмиды в качестве матрицы для репарации без сортировки составила 0,04-0,07%. Такие значения не позволяют использовать данный метод для коррекции мутации F508del. Начата работа по дифференцировке ИПСК в дыхательные органоиды, однако остановлена из-за ограничений, связанных с пандемией. Основываясь на литературных данных по тропизму разных серотипов аденоассоциированных векторов (ААВ) были выбраны три серотипа (5, 6 и 9) для доставки компонентов CRISPR/Cas9 в клетки дыхательного эпителия. Исходные плазмиды для сборки ААВ векторов всех трех серотипов были получены и охарактеризованы. На основе этих плазмид были собраны три вирусных вектора с репортерным геном GFP и определен инфекционный титр для одного из них. Клеточная культура CFTE29о- была успешно трансдуцирована вирусным вектором с геном GFP. За отчетный период (май 2019 – май 2020) члены коллектива выступили на конференциях с 12 докладами о результатах работы, в том числе с двумя устными докладами на профильных европейских конференциях по муковисцидозу. Публикации по теме гранта (май 2019 – май 2020): 1. Anuchina A.A., Lavrov A.V., Smirnikhina S.A. TIRR: a potential front runner in HDR race − hypotheses and perspectives. Molecular Biology Reports, Mol Biol Rep 47, 2371–2379 (2020). https://doi.org/10.1007/s11033-020-05285-x. Web of Science, Scopus, Q3. 2. Kondrateva E. V., Anuchina A. A., Adilgereeva E. P., Amelina E. L., Ustinov K. D., Yasinovsky M. I., Kochergin-Nikitsky K. S., Zainitdinova M. I., Mozgovoy I. V., Lavrov A. V., Smirnikhina S. A. E-P16.02 - F508del editing in patient-derived iPSCs by CRISPR/Cas9. ESHG 2019. European Journal of Human Genetics (2019) 27: 1907-1908, doi: 10.1038/s41431-019-0493-3. Web of Science. 3. Smirnikhina S. A., Kondrateva E. V., Anuchina A. A., Adilgereeva E. P., Amelina E. L., Ustinov K. D., Yasinovsky M. I., Kochergin-Nikitsky K. S., Zainitdinova I., Mozgovoy V., Lavrov A. V. P16.31C - F508del correction in CFTE29o- cell line by CRISPR/Cas9. ESHG 2019. European Journal of Human Genetics (2019) 27: 1700, doi: 10.1038/s41431-019-0494-2. Web of Science. 4. Smirnikhina S.A., Anuchina A., Kochergin-Nikitsky K., Adilgereeva E., Lavrov A. Improving of CRISPR/Cas9 efficacy for F508del mutation correction in cystic fibrosis. ESHG 2018, P03.21D. European Journal of Human Genetics (2019) 27: 80-81. doi: 10.1038/s41431-019-0404-7. Web of Science. 5. Smirnikhina S., Anuchina A., Adilgereeva E., Amelina E., Kondrateva E., Ustinov K., Yasinovsky M., Kochergin-Nikitsky K., Zainitdinova M., Slesarenko Y., Mozgovoy I., Lavrov A. F508del editing in CFTE29o- cell line and iPSCs from patient with cystic fibrosis by CRISPR/Cas9. FEBS Open Bio 9(Suppl. 1) (2019) 65–431; pp. 397-398. DOI: 10.1002/2211-5463.12675. Web of Science. Выступления в СМИ: 1. РИА наука. "Это мой единственный шанс". Ученый разрабатывает препарат от своей болезни. 05.07.2019. https://ria.ru/20190705/1556204064.html 2. Портал «Genetics-info». «Это мой единственный шанс». Ученый разрабатывает препарат от своей болезни. 07.07.2019. https://genetics-info.ru/blogs/eto_moy_edinstvennyy_shans_uchenyy_razrabatyvaet_preparat_ot_svoey_bolezni-5d21b9bf4ae5c/ 3. Мультимедийный портал ПОИСК. «Как вылечить муковисцидоз?». 07.2019. https://www.poisknews.ru/video/kak-vylechit-mukovisczidoz/

 

Публикации

1. - "Это мой единственный шанс". Ученый разрабатывает препарат от своей болезни. РИА наука, 05.07.2019 (год публикации - ).

2. - «Это мой единственный шанс». Ученый разрабатывает препарат от своей болезни. Портал «Genetics-info», 07.07.2019 (год публикации - ).

3. - Как вылечить муковисцидоз? Мультимедийный портал ПОИСК, 07.2019 (год публикации - ).

4. Анучина А.А., Лавров А.В., Смирнихина С.А. TIRR: a potential front runner in HDR race−hypotheses and perspectives Molecular Biology Reports, 47, 2371–2379. (год публикации - 2020).

5. Кондратьева Е., Адильгереева Э., Амелина Е., Табаков В., Демченко А., Устинов К., Ясиновский М., Воронина Е., Лавров А., Смирнихина С. Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi001-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with p.F508del mutation Stem Cell Research, - (год публикации - 2020).

6. Кондратьева Е., Демченко А., Лавров А., Смирнихина С. An overview of currently available molecular Cas-tools for precise genome modification Gene, 145225 (год публикации - 2020).

7. Кондратьева Е.В., Анучина А.А., Адильгереева Э.П., Амелина Е.Л., Устинов К.Д., Ясиновский М.И., Кочергин-Никитский К.С., Зайнитдинова М.И., Мозговой И.В., Лавров А.В., Смирнихина С.А. F508del editing in patient-derived iPSCs by CRISPR/Cas9 European Journal of Human Genetics, 27: 1907-1908 (год публикации - 2019).

8. Слесаренко Я.С., Лавров А.В., Смирнихина С.А. Клинические исследования для лечения наследственных заболеваний методами геномного редактирования Гены и клетки, Том XV, №2, с. 51-57 (год публикации - 2020).

9. Смирнихина С., Анучина А., Адильгереева Э., Амелина Е., Кондратьева Е., Устинов К., Ясиновский М., Кочергин-Никитский К., Зайнитдинова М., Слесаренко Я., Мозговой И., Лавров А. F508del editing in CFTE29o- cell line and iPSCs from patient with cystic fibrosis by CRISPR/Cas9 FEBS Open Bio, 9(Suppl. 1) (2019) 65–431; pp. 397-398 (год публикации - 2019).

10. Смирнихина С.А., Анучина А.А., Кочергин-Никитский К., Адильгереева Э., Лавров А. Improving of CRISPR/Cas9 efficacy for F508del mutation correction in cystic fibrosis European Journal of Human Genetics, 27: 80-81 (год публикации - 2019).

11. Смирнихина С.А., Кондратьева Е.В., Адильгереева Э.П., Анучина А.А., Зайнитдинова М.И., Слесаренко Я.С., Ершова А.С., Устинов К.Д., Ясиновский М.И., Амелина Е.Л., Воронина Е.С., Якушина В.Д., Табаков В.Ю., Лавров А.В. P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients PLoS ONE, 15(11): e0242094 (год публикации - 2020).

12. Смирнихина С.А., Кондратьева Е.В., Анучина А.А., Адильгереева Э.П., Амелина Е.Л., Устинов К.Д., Ясиновский М.И., Кочергин-Никитский К.С., Зайнитдинова М.И., Мозговой И.В., Лавров А.В. F508del correction in CFTE29o- cell line by CRISPR/Cas9 European Journal of Human Genetics, 27: 1700 (год публикации - 2019).