Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект направлен на разработку генной терапии муковисцидоза с помощью нового инструмента – геномного редактирования. Муковисцидоз – тяжелое наследственное заболевание, симптомы которого появляются уже в детстве. Средняя продолжительность жизни около 35 лет, основной причиной смерти является поражение легких и дыхательная недостаточность. Классическая генная терапия оказалась неэффективной в случае этого заболевания. Недавно появился новый метод генной терапии – геномное редактирование (CRISPR/Cas9), позволяющее прицельно исправить мутацию в гене CFTR, вызывающую заболевание. Для этого в клетку нужно временно ввести бактериальный фермент Cas9, который отсутствует у человека, и направляющую РНК, способную распознать нужный участок ДНК. Оба эти компонента обеспечивают узнавание и разрезание нужного гена, при этом другие гены не затрагиваются. Для лечения наследственных болезней систему CRISPR/Cas9 можно немного изменить, добавив в нее третий компонент – правильный ген, который встраивается в геном вместо поврежденного, после того как CRISPR/Cas9 разрезает ген точно в месте мутации. Важно отметить, что исправление мутации происходит необратимо, то есть исправив мутацию один раз, правильный ген сохраняется в организме точно на своём месте и нет необходимости в дополнительном лечении. Исправить мутацию можно как непосредственно в организме человека, так и в клетках, полученных от больного. Клетки с исправленным геном трансплантируют обратно пациенту. Для разработки такого лечения необходимо провести ряд исследований на клеточных культурах и затем на животных, чтобы показать эффективность и безопасность такого подхода. Данный проект сфокусирован на исследованиях на клеточных культурах. Мы разработали пять эффективных генетических конструкций, которые попав в клетку, распознают мутацию (в нашем случае самую частую мутацию при муковисцидозе – F508del) и разрезают ген CFTR в месте мутации. Наибольшая эффективность разрезания гена получена для одной из конструкций – saCas9-saCFTR#3 – 29%. Мы создали генетические конструкции (плазмиду и короткие последовательности ДНК) с правильным геном для встраивания в геном вместо поврежденного. Не так давно был открыт способ получения стволовых клеток, то есть клеток, способных давать начало разным типам клеток, например, клеткам легких, печени, мышц и т.д. из клеток взрослых людей. Такой подход позволяет получить из клеток кожи стволовые клетки (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – ИПСК) путем их репрограммирования. В дальнейшем из этих стволовых клеток можно получить любые другие клетки, в том числе клетки легких. Нами отработан протокол получения ИПСК из клеток кожи пациентов с мутацией F508del и получены клетки от одного пациента. В дальнейшем в этих клетках мы исправим мутацию F508del в гене CFTR, затем получим из них клетки легкого для дальнейшей трансплантации пациенту. Научным коллективом за отчетный период написано три статьи: обзор по современным методам лечения муковисцидоза и две статьи с результатами работы по проекту. По результатам работы получено четыре устных доклада на Европейской конференции по муковисцидозу (ECFS 2018) и конференции «Геномное редактирование в медицинской генетике 2018» (MGEditing'18, Москва, июнь 2018) и два постерных доклада на Европейской конференции по генетике человека (ESHG 2018).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном году совместно с ФГУ НИИ Пульмонологии ФМБА России было отобрано шесть пациентов старше 18 лет с муковисцидозом. От всех пациентов было получено информированное согласие на участие в этой НИР. У всех пациентов осуществлен забор участка кожи с передней поверхности предплечья, из которого получены культуры фибробластов. В этих культурах была проведена верификация мутаций в гене CFTR, все шесть культур фибробластов были криоконсервированы для дальнейшего репрограммирования в ИПСК. Получены культуры ИПСК от трех пациентов с муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del. Отработаны условия доставки компонентов CRISPR/Cas9 в ИПСК. Подобраны условия до оценки эффективности коррекции мутации F508del. Разработан протокол редактирования мутации F508del в ИПСК с помощью донорной двуцепочечной молекулы ДНК и последующим вырезанием вставки с помощью плазмиды, кодирующей транспозазу. Составлен протокол сортировки GFP+ ИПСК на сортере BioRad S3e Cell Sorter. Проведена оценка эффективности редактирования гена CFTR в области мутации F508del на трех клеточных культурах: HEK293T, CFTE29o- и ИПСК от пациента с муковисцидозом. Показано, что редактирование происходит с наибольшей эффективностью в плазмидном сайте CFTR в ИПСК (9,0-10,1%). Эффективность исправления мутации F508del в культуре CFTE29o- составила от 0% до 1,2%, в ИПСК – от 0% до 0,5%, что хорошо согласуется с литературными данными. Основываясь на имеющихся протоколах дифференцировки ИПСК в функционирующие органоиды дыхательного эпителия, мы разработали собственный протокол дифференцировки. Научным коллективом за отчетный период опубликовано три статьи: две обзорные статьи по теме проекта и одна с результатами работы по проекту. За отчетный период (май 2018 – май 2019) члены коллектива выступили на конференциях с 18 докладами о результатах работы, в том числе с устным докладом на профильной европейской конференции по муковисцидозу. Поданы тезисы на ряд всероссийских и зарубежных конференций. Получено: 3 устных доклада на международном Конгрессе «VII съезд ВОГиС, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (18-22 июня 2019 г., Санкт-Петербург); постерный доклад на Европейской конференции по муковисцидозу (ECFS 2019, 5-8 июня 2019), 2 постерных доклада на Европейской конференции по генетике человека (ESHG 2019, 15-18 июня 2019), 1 постерный доклад на FEBS 2019 (4-11 июля 2019).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В текущем году эффективность исправления мутации F508del в гене CFTR была оценена с помощью глубокого таргетного секвенирования (NGS) ампликонов. Эксперименты проводили на трех клеточных культурах (HEK293T, CFTE29o- и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), полученных от пациента с муковисцидозом), в которых оценили эффективность редактирования 48-72 часа после трансфекции компонентов CRISPR/Cas9. Среднее значение покрытия (число прочтений) анализируемого локуса CFTR составило 31585 (от 22850 до 41500). Эффективность коррекции мутации в клеточной культуре HEK293T варьировала от 0,04% до 0,44% аллелей, в зависимости от используемой комбинации CRISPR/Cas9. Точность исправления мутации (то есть коррекция мутации без привнесения дополнительных мутаций в ДНК) варьировала от 61,4% до 90,9%. Совокупная частота коррекции мутации F508del в гене CFTR в клеточной культуре CFTE29o- для двух наиболее эффективных комбинаций CRISPR/Cas9 составила 1,47% и 1,2% аллелей соответственно. Наибольшая эффективность коррекции мутации F508del в гене CFTR в ИПСК составила 3,5% для одной из комбинаций CRISPR/Cas9, однако сопровождалась внесением дополнительных мутаций в редактируемый локус в 21,4% случаев. Получена и полностью охарактеризована культура ИПСК от второго пациента с муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del в гене CFTR. Проведены эксперименты с отбором редактированных клеток ИПСК с целью получения стабильной культуры, имеющей 100% клеток с исправленной мутацией. С помощью программы Cas-OFFinder был составлен перечень генов, которые потенциально могут быть изменены из-за неспецифического действия CRISPR/Cas9. Было обнаружено пять таких регионов в геноме человека. Два из них расположены в последовательности генов, кодирующих белки, остальные три – в пределах одной длинной некодирующей РНК. Расчетная эффективность исправления мутации F508del в гене CFTR с использованием плазмиды в качестве матрицы для репарации без сортировки составила 0,04-0,07%. Такие значения не позволяют использовать данный метод для коррекции мутации F508del. Начата работа по дифференцировке ИПСК в дыхательные органоиды, однако остановлена из-за ограничений, связанных с пандемией. Основываясь на литературных данных по тропизму разных серотипов аденоассоциированных векторов (ААВ) были выбраны три серотипа (5, 6 и 9) для доставки компонентов CRISPR/Cas9 в клетки дыхательного эпителия. Исходные плазмиды для сборки ААВ векторов всех трех серотипов были получены и охарактеризованы. На основе этих плазмид были собраны три вирусных вектора с репортерным геном GFP и определен инфекционный титр для одного из них. Клеточная культура CFTE29о- была успешно трансдуцирована вирусным вектором с геном GFP. За отчетный период (май 2019 – май 2020) члены коллектива выступили на конференциях с 12 докладами о результатах работы, в том числе с двумя устными докладами на профильных европейских конференциях по муковисцидозу. Публикации по теме гранта (май 2019 – май 2020): 1. Anuchina A.A., Lavrov A.V., Smirnikhina S.A. TIRR: a potential front runner in HDR race − hypotheses and perspectives. Molecular Biology Reports, Mol Biol Rep 47, 2371–2379 (2020). https://doi.org/10.1007/s11033-020-05285-x. Web of Science, Scopus, Q3. 2. Kondrateva E. V., Anuchina A. A., Adilgereeva E. P., Amelina E. L., Ustinov K. D., Yasinovsky M. I., Kochergin-Nikitsky K. S., Zainitdinova M. I., Mozgovoy I. V., Lavrov A. V., Smirnikhina S. A. E-P16.02 - F508del editing in patient-derived iPSCs by CRISPR/Cas9. ESHG 2019. European Journal of Human Genetics (2019) 27: 1907-1908, doi: 10.1038/s41431-019-0493-3. Web of Science. 3. Smirnikhina S. A., Kondrateva E. V., Anuchina A. A., Adilgereeva E. P., Amelina E. L., Ustinov K. D., Yasinovsky M. I., Kochergin-Nikitsky K. S., Zainitdinova I., Mozgovoy V., Lavrov A. V. P16.31C - F508del correction in CFTE29o- cell line by CRISPR/Cas9. ESHG 2019. European Journal of Human Genetics (2019) 27: 1700, doi: 10.1038/s41431-019-0494-2. Web of Science. 4. Smirnikhina S.A., Anuchina A., Kochergin-Nikitsky K., Adilgereeva E., Lavrov A. Improving of CRISPR/Cas9 efficacy for F508del mutation correction in cystic fibrosis. ESHG 2018, P03.21D. European Journal of Human Genetics (2019) 27: 80-81. doi: 10.1038/s41431-019-0404-7. Web of Science. 5. Smirnikhina S., Anuchina A., Adilgereeva E., Amelina E., Kondrateva E., Ustinov K., Yasinovsky M., Kochergin-Nikitsky K., Zainitdinova M., Slesarenko Y., Mozgovoy I., Lavrov A. F508del editing in CFTE29o- cell line and iPSCs from patient with cystic fibrosis by CRISPR/Cas9. FEBS Open Bio 9(Suppl. 1) (2019) 65–431; pp. 397-398. DOI: 10.1002/2211-5463.12675. Web of Science. Выступления в СМИ: 1. РИА наука. "Это мой единственный шанс". Ученый разрабатывает препарат от своей болезни. 05.07.2019. https://ria.ru/20190705/1556204064.html 2. Портал «Genetics-info». «Это мой единственный шанс». Ученый разрабатывает препарат от своей болезни. 07.07.2019. https://genetics-info.ru/blogs/eto_moy_edinstvennyy_shans_uchenyy_razrabatyvaet_preparat_ot_svoey_bolezni-5d21b9bf4ae5c/ 3. Мультимедийный портал ПОИСК. «Как вылечить муковисцидоз?». 07.2019. https://www.poisknews.ru/video/kak-vylechit-mukovisczidoz/