Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Туберкулез с недавних пор является самым смертоносным инфекционным заболеванием. По оценке ВОЗ в 2016 году произошло 10,4 миллиона новых случаев этого заболевания, и оно стало причиной 1,8 миллионов смертей в 2016 году. Возникновение штаммов M. tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью являются основной угрозой для мирового контроля за этим заболеванием и требуют срочной разработки новых противотуберкулезных препаратов с новым механизмом действия. Пять новых соединений класса азоло[1,2,4,5]тетразинов были ранее отобраны, как способные ингибировать рост M. tuberculosis, и проявившие активность как потенциальные ингибиторы серин-треониновых протеинкиназ (СТПК) в двух оригинальных тест-системах - M. smegmatis aphVIII+ и S. lividansaphVIII+, хотя их основные биомишени остаются неизвестными. Мы использовали M. smegmatis mc2 155 в качестве модельного организма для определения биомишеней этих соединений, так как его геном содержит как минимум 6 близких гомологов СТПК M. tuberculosis. Мы определили минимальные ингибирующие концентрации (МИК) этих соединений в жидкой и на агаризованной среде. Значение МИК варьировало в пределах от 20 до 64 мкг/мл, что выше значений МИК на M. tuberculosis. Однако эти значения позволили дальнейшее использование M. smegmatis в качестве модели. Нам удалось получить мутанты M. smegmatis, устойчивые к 3,75-5 кратным значениям МИК с частотой от 4*10^-6 до1,3*10^-9 ко всем соединениям, кроме TSV-409. Мы предполагаем, что в связи с тем, что TSV-409 обладает более компактной молекулярной структурой, данное соединение может обладать меньшей специфичностью связывания и более чем одной биомишенью. Мы отобрали по 3 стабильных мутанта, устойчивых к каждому из соединений для дальнейшего анализа. Тест лекарственной чувствительности выявил некоторые статистически достоверные изменения в уровнях устойчивости к рифампицину, эритромицину, офлоксацину и имипенему, однако увеличение уровня устойчивости было небольшим. Это позволило сделать предположение о том, что механизм устойчивости к исследуемым соединениям отличается от механизма устойчивости к данным антибиотикам. В то же время, мутанты имели повышенный уровень устойчивости ко всем азоло[1,2,4,5]тетразинам за исключением TSV-409, что позволяет предположить наличие у них общей биомишени. Мы наблюдали снижение скорости роста мутантов, отобранных на соединениях TSV-395 и NIK-1283. Это позволяет предположить, что эти мутации устойчивости имеют повышенные "затраты" на поддержание жизнеспособности (fitness-cost). Мы выделили и секвенировали геномную ДНК отобранных спонтанных мутантов и обнаружили ряд уникальных мутаций, которые могут быть вовлечены в формировании лекарственной устойчивости к исследуемым соединениям. Одна мутация в гене с неизвестной функцией (MSMEG_1601), который имеет близкого гомолога в геноме M. tuberculosis, была обнаружена у 7 из 12 мутантов и представляет особый интерес для дальнейшего исследования, хотя роль всех обнаруженных мутаций еще предстоит подтвердить методами обратной генетики в течение второго года выполнения проекта. Мы не обнаружили мутаций в генах СТПК, что может свидетельствовать о том, что они не являются основными биомишенями исследуемых соединений.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Второй год проекта был направлен на подтверждение участия обнаруженных в первый год в геноме M. smegmatis мутаций в формировании лекарственной устойчивости к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам и изучение механизма формирования устойчивости. Так ранее нами были обнаружены мутации в четырех генах: MSMEG_0641 (binding-protein-dependent transporters inner membrane component) у одного мутанта, MSMEG_1380 (транскрипционный регулятор семейства TetR) у трех мутантов, MSMEG_1601 (белок с неизвестной функцией) у семи мутантов и MSMEG_2087 (transporter small conductance mechanosensitive ion channel (MscS) family protein) у одного мутанта. Мы использовали два подхода для анализа участия этих генов и их аллельных вариантов в формировании устойчивости к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам у M. smegmatis: 1. Сверхэкспрессия указанных генов в диком типе (д.т.) и их аллельных вариантов в составе экспрессионного вектора pMINDKm- в клетках M. smegmatis mc2 155; 2. Конструирование направленных мутантов на основе штамма M. smegmatis mc2 155 с использованием «суицидальной» системы p2NIL/pGOAL19, работающей по принципу гомологичной рекомбинации. По результатам анализа экспериментов по сверхэкспрессии нами обнаружено, что лишь сверхэкспрессия гена MSMEG_1380 д.т. влияет на изменение фенотипа, повышая чувствительность клеток M. smegmatis к четырем исследуемым имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам, при этом из всех сконструированных мутантов, лишь мутанты по гену MSMEG_1380 были устойчивы к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам. Гомолог гена MSMEG_1380 у M. abscessus контролирует экспрессию оперона mmpS5-mmpL5, кодирующего белки системы эффлюкса. Мутации в гене тетрациклинового репрессора у M. abscessus приводят к сверхэкспрессии генов mmpS5-mmpL5, обеспечивая устойчивость клеток к производным тиацетазона. У M. tuberculosis также есть оперон mmpS5-mmpL5, хотя аминокислотная последовательность его тетрациклинового репрессора сильно отличается от таковых у M. smegmatis и M. abscessus, однако мутации в нем обеспечивают устойчивость M. tuberculosis к бедаквилину и клофазимину. Мы выдвинули гипотезу о том, что ген MSMEG_1380 аналогично контролирует экспрессию оперона mmpS5-mmpL5 у M. smegmatis (гены MSMEG_1381 и MSMEG_1382) и подтвердили ее исследованием транскрипционной активности этих трех генов методом количественной ПЦР в реальном времени. Так, сверхэкспрессия гена MSMEG_1380 д.т. подавляла экспрессию генов оперона mmpS5-mmpL5 у M. smegmatis, при этом мы наблюдали сверхэкспрессию генов оперона mmpS5-mmpL5 (в 64,6-541 раз) у мутантных штаммов, полученных в первый год. Нами также обнаружено повышение экспрессии гена MSMEG_1380 у мутантных штаммов, относительно штамма д.т. в 3,4-47,4 раза, что говорит о возможной авторегуляции экспрессии гена MSMEG_1380 за счет связывания с тем же промотором/оператором. Мы также обнаружили, что добавление субингибирующих концентраций TSV-395 дозозависимо повышает уровень экспрессии генов MSMEG_1381 и MSMEG_1382, что может говорить о возможном связывании данных соединений с белком MSMEG_1380 и его ингибировании, приводящем к индукции экспрессии генов оперона mmpS5-mmpL5, аналогично работе индуцируемых тетрациклиновых промоторов. Дополнительное секвенирование геномов мутантных штаммов M. smegmatis, полученных в первый год выполнения проекта, позволило закрыть «дыры» в покрытии и обнаружить различные мутации в гене MSMEG_1380 у всех мутантных штаммов. Таким образом, нами показано, что основным механизмом устойчивости M. smegmatis к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам являются мутации, приводящие к усилению эффлюкса соединений из клетки. В третий год проекта мы планируем сконструировать штамм M. smegmatis с делецией в опероне mmpS5-mmpL5 и получить на его основе мутанты с иным механизмом устойчивости, предположительно заключающимся в мутациях в генах, кодирующих биомишени исследуемых соединений.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение первых двух лет проведения проекта нами был исследован механизм устойчивости микобактерий к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам. Было установлено, что мутации в гене MSMEG_1380 приводят к сверхэкспрессии оперона mmpS5-mmpL5 и усиленному эффлюксу соединений из бактериальной клетки. Таким образом, система эффлюкса MmpS5-MmpL5 является важной МЛУ-помпой, способной обеспечивать устойчивость микобактерий к различным антибиотикам: бедаквилину, клофазимину, азолам, производным тиацетазона и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам. Для дальнейшего исследования механизма действия имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов в третий год проекта нами сконструирован штамм M. smegmatis dmmp5, с делецией 2828 п.о. в опероне mmpS5-mmpL5, исключающей спонтанное восстановление функции данной системы эффлюкса. Мы предполагали получить на основе данного штамма спонтанных мутантов, устойчивых к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам, с иным механизмом устойчивости, что могло бы указать на возможную биомишень. Как и ожидалось, штамм M. smegmatis dmmp5 отличался от штамма дикого типа повышенной чувствительностью к исследуемым соединениям, однако получить на его основе мутантов, устойчивых к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам не удалось, даже несмотря на применение мутагенов, способствующих повышению частоты спонтанного мутагенеза. Это может свидетельствовать о том, что для устойчивости может требоваться более одной мутации (несколько биомишеней, либо широкий спектр токсичности соединений), либо мутации, которые могли бы привести к устойчивости, являются летальными для микобактерий. Показана возможность использования пары штаммов M. smegmatis mc2 155 и M. smegmatis dmmp5 в качестве тест-системы: сравнение чувствительности этих штаммов к кандидатам в антимикобактериальные соединения может быть использовано для установления возможного участия системы эффлюкса MmpS5-MmpL5 в формировании устойчивости на ранних стадиях скрининга. В экспрессионный вектор клонированы гены mmpS5-mmpL5 M. tuberculosis. При экспрессии данных генов в штамме M. smegmatis dmmp5 показана тенденция к повышению устойчивости к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам и повышение устойчивости к бедаквилину. Эффект свидетельствует о том, что помпа MmpS5-MmpL5 M. tuberculosis также способна обеспечивать устойчивость микобактерий к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам, как и ее гомолог в M. smegmatis. Эффект был не сильно выраженным, вероятнее всего из-за большого количества редких кодонов в клонированном с геномной ДНК гене. Для преодоления этого эффекта оперон mmpS5-mmpL5 синтезирован с адаптацией кодонов. Исследование цитотоксичности МТТ-тестом на клетках фибробластом эмбриона человека (кожно-мышечная ткань) показало, что при схожей активности в отношении M. tuberculosis, соединения TSV-402 и AVK-22 выглядят привлекательнее TSV-395 за счет меньшей токсичности. Однако TSV-395 обладает гораздо лучшей растворимостью, что существенно облегчает работу с данным соединением при исследовании механизма действия данного класса соединений. В связи с невозможностью установления биомишени и механизма действия путем получения и дальнейшего анализа устойчивых спонтанных мутантов, мы провели пилотный эксперимент по анализу транскриптома в условиях воздействия на культуру микобактерий четырехкратным МИК одного из исследуемых соединений (данные по секвенированию тотальной РНК депонированы в базу данных NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA615922). Всего нами обнаружено изменение экспрессии минимум в 2 раза 1387 генов. На фоне общего снижения экспрессии генов многих систем метаболизма клетки, выделялась группа генов, отвечающих за рекомбинацию и репарацию ДНК, экспрессия которых была повышена. Ряд антибиотиков в том или ином виде воздействуют на комплекс репликации/рекомбинации/репарации ДНК, приводя к повреждениям ДНК и гибели клетки. Возможно, имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины имеют несколько биомишеней в клетке или действует опосредованно, путем связывания с элементами данного комплекса и блокировки репликации ДНК. Изменение экспрессии также наблюдалось у генов пяти серин-треониновых протеин киназ (СТПК) – изначально предполагаемых биомишеней имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов. Однако точно установить, что именно является первичным эффектом от действия TSV-395, а что - последствием ингибирования роста культуры можно будет лишь при более детальном исследовании изменения профиля транскрипции по мере увеличения концентрации TSV-395, от субингибирующей до ингибирующей, что позволит выявить начальные стадии клеточного ответа и сузить спектр дифференциально экспрессирующихся генов. Данную работу мы планируем провести в случае продления данного проекта. В рамках проекта создан задел для будущих исследований – начата совместная работа с исследователями из Южно-Африканского Национального Института Биоинформатики (SANBI, Кейп-Таун, ЮАР), в рамках которой проведено моделирование структуры помпы MmpL5 и виртуальный скрининг ее ингибиторов – потенциальных препаратов, способных предотвратить развитие лекарственной устойчивости за счет данной помпы. Отобраны и заказаны для дальнейших in vitro исследований 5 хит соединений.