Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Сформирована коллекция клинических образцов возбудителей инфекций репродуктивного тракта (ИРТ): изолятов N. gonorrhoeae, T. pallidum, Ureaplasma sp и Mycoplasma sp., включающая образцы из музея ГНЦДК Минздрава РФ с глубиной хранения до 10 лет, а также биологические образцы, собранные ГНЦДК Минздрава РФ в 2015-2016 гг. Сбор образцов проводили от пациентов с клиническими и лабораторными признаками воспалительных заболеваний репродуктивного тракта: отделяемое уретры у мужчин или цервикального канала у женщин. Сформированная коллекция содержит: - образцы N. gonorrhoeae из 16 регионов РФ – 90 образцов, из них 82 резистентных или умеренно-резистентных по крайней мере к одному из лекарственных препаратов, используемых для лечения (пенициллин G, тетрациклин, цефтриаксон, ципрофлоксацин, спектиномицин, азитромицин); - образцы Ureaplasma sp., Mycoplasma sp. от пациентов из Москвы – 29 образцов, из них 14 устойчивых по крайней мере к одному из лекарственных препаратов, используемых для лечения (рокситромицин, эритромицин, азитромицин, джозамицин, пристинамицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, тетрациклин, доксициклин); - образцы T. pallidum от пациентов с первичным или вторичным сифилисом из Республики Тыва (Кызыл), Приволжского, Центрального и Сибирского федеральных округов РФ – 26 образцов, из них 3 образца, резистентных к препаратам ряда макролидов (азитромицин); всего – 145 образцов, их них образцов, демонстрирующих устойчивость по крайней мере к одному из лекарственных препаратов, используемых для лечения – 99 образцов. Из всех образцов получены препараты ДНК возбудителей ИРТ. Получены образцы геномной ДНК человека от пациентов с подтвержденным наличием N. gonorrhoeae (30 образцов) и T. pallidum (20 образцов), а также образцы геномной ДНК человека от пациентов с подтвержденным отсутствием N. gonorrhoeae и T. pallidum (100 образцов). Образцы Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma sp., Mycoplasma sp., входящие в коллекцию, охарактеризованы по ключевым антимикробным препаратам, применяемым в настоящее время для адекватной терапии этих заболеваний. Для антимикробных препаратов определены значения минимальных подавляющих концентраций (МПК, мг/л). Для изолятов N. gonorrhoeae определены МПК пенициллина G, цефтриаксона, тетрациклина, спектиномицина, азитромицина и ципрофлоксацина. Образцы Ureaplasma spp. и Mycoplasma spp. охарактеризованы по чувствительности/устойчивости к препаратам группы макролидов, фторхинолонов, тетрациклинов. Для T. pallidum молекулярно-генетическими методами (ПЦР-анализ, секвенирование) проверено наличие генетических детерминант устойчивости к макролидам: мутации в 23S RNA A2058G и A2059G/C, и тетрациклинам: наличие молекулярного маркера резистентности tetB и точечной мутации G1058C в гене, кодирующем 16S RNA. Среди 26 образцов из собранной коллекции оказалось 3 образца, несущих маркер устойчивости к макролидам – мутация A2058G. Ни в одном из образцов не обнаружены мутации 23S РНК в положении 2059. Не обнаружено образцов, имеющих маркеры резистентности к тетрациклинам. Проведен биоинформационный анализа данных полногеномного секвенирования N. gonorrhoeae T. pallidum, Mycoplasma spp. и Ureaplasma spp, доступных их баз данных. Рассчитаны критерии dn/ds c использованием ряда моделей для генов N. gonorrhoeae, кодирующих факторы патогенности: белок OmpA, белки Pil пилей (фимбрий), Opa-белки, порины, белок перестройки и репарации (recA), белок P III, гликозилтрансферазы (гены lgt), трансферрин-связывающий белок. Для генов lgt, ompA, opa1-opa3, opa5-opa11, pilC, pilE, pilF, pilJ, pilM, pilN, pilO, pilP, pilQ, pilT, pilS, pilV, pilW, pilX, porB, tbpB получены высокие значения критерия dn/ds. Гены recA, pilU1, pilU2, pilZ, pilG, opa4, pIII, pilB N. gonorrhoeae идентичны у всех рассмотренных геномов, т.е. значение dn/ds близко к 0. Для генов, кодирующих белки внешней мембраны возбудителя сифилиса, tprA, tprC (белок-порин), tprD, tprF, tprI, tprJ, tprK, а также гена mglB наблюдали значения dn/ds более 0,7 (для гена tprL – 0,34), что показывает наличие быстрых изменений в генах. Для генов troA, tprB, а также генов, кодирующих белки BamA, TP_0435, TP_0136, TP_0155, TP_0483, TP_0453, TP_0545, TP_0574, TP_0624, TP_0750, TP_0751, значения dn/ds оказались близки к 0, т.е. гены идентичны у всех исследованных геномов T. pallidum. Для выровненных геномных последовательностей N. gonorrhoeae, T. pallidum построены филогенетические деревья. Рассчитана характеристика геномов – “выметание отбором” (selective sweep), которая показывает, как изменяются частоты однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) при рекомбинации ДНК, что позволяет локализовать участки ДНК, на которых осуществляется сильный положительный отбор. Отобраны гены, которые имеют наибольшее значение ω, т.е. имеют преимущество при отборе. Для N. gonorrhoeae этими генами являются prn, minD_1, ribD, tbpA, pilX, penA, lbpA, bfr, clpb, putA, purh, dhpS. Геном с наибольшим значением ω оказался ген clpb (ω = 270); высокие значения ω (выше 10) были у генов prn, minD_1, dhpS, penA, ribD. Для T. pallidum наибольшее значение ω, оказалось у генов, кодирующих белки внешней мембраны TprC, TprD, TprI, гена, кодирующего белок TP_0858 (предполагаемый липопротеин), гена, кодирующего белок, содержащий фибронектин тип III -домен. Проведен поиск полиморфных локусов в генах человека с использованием максимальных значений составной функции правдоподобия (критерий CLR) и по максимальному значению критерия ω. Проведено таргетное секвенирование образцов ДНК человека. Для проведения секвенирования был выбран ген ceacam1 как ген, наиболее подверженный отбору по критерию CLR. Секвенировали выбранный участок 43019132-43020133 (19 хромосома) у 30 образцов ДНК человека с подтвержденным наличием N. gonorrhoeae и 30 образцов ДНК у здоровых добровольцев. На настоящий момент полученные результаты не позволяют выявить различия в последовательностях ДНК, полученных от больных с диагнозом “гонорея” и здоровых людей, т.е. не установлено взаимосвязи между заболеванием и гаплотипами рецепторов адгезинов человека. Все полученные изоляты N. gonorrhoeae охарактеризованы NG-MAST типированием. Изоляты T. pallidum типированы с использованием метода, включающего изучение количества повторов гена arp, определение полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) участка генов tpr (E, G, J) и нуклеотидную последовательность вариабельного участка гена tp0548. Результаты типирования показали, что 24 из 26 образцов T. pallidum из коллекции, в частности, все образцы, полученные в Республике Тыва (Кызыл), принадлежат к одному молекулярному субтипу – субтип 14 d/f, который, как было показано ранее, является доминирующим в РФ. Все штаммы, полученные из республики Тыва, относятся к категории дикого типа, т.е. не идентифицировано мутаций в гене 23S рРНК, определяющих резистентность к макролидам. Штаммы, полученные из Приволжского, Центрального и Сибирского федеральных округов РФ, содержали мутацию A2058G в гене 23S РНК, ассоциированную с устойчивостью к макролидам. Ни у одного из штаммов не было обнаружено мутаций в позиции 2059 гена 23S РНК. Не обнаружено штаммов T. pallidum, несущих мутации, приводящие к устойчивости к тетрациклинам: наличие гена tetB, мутации в положении 1058 16S РНК. Проведено сравнение профилей детерминант антибиотикорезистентности, сиквенс-типов по NG-MAST и паттернов фенотипической чувствительности штаммов N. gonorrhoeae. Показано, что образцы N. gonorrhoeae, изолированные на территории РФ за последние 10 лет, характеризуются высоким генетическим разнообразием, что характерно для популяции N. gonorrhoeae в РФ. Полученные 90 клинических образцов отнесены к 59 различным сиквенс-типам по результатам NG-MAST типирования. Анализ чувствительности к пенициллину, выявил 66,6 % умеренно-резистентных и 12,2 % резистентных штаммов, что демонстрирует высокий уровень резистентности. Наиболее часто встречалась мутация в гене penA – инсерция остатка Asp в положении 345 и замена Leu421-Pro в гене ponA. Все исследованные штаммы оказались чувствительными к спектиномицину и цефтриаксону. Не выявлено мутаций, приводящих к устойчивости к этим препаратам. В исследованной выборке не наблюдали штаммов, резистентных к антибиотику ряда макролидов азитромицину (84,5% чувствительных штаммов, 15,5 % умеренно-резистентных). Не выявлено мутаций в гене 23S РНК, приводящих к устойчивости к макролидам. Полученные результаты согласуются с данными многолетних наблюдений сохранения чувствительности к данным препаратам в российской популяции N. gonorrhoeae. Около 60 % исследованных изолятов N. gonorrhoeae были резистентны и умеренно-резистентны к препарату группы фторхинолонов ципрофлоксацину. Наиболее часто наблюдали мутации в гене Ser91-Phe, Asp95-Asn/Gly в гене gyrA и Ser87-Arg, Glu91-Gly в гене parC. Выявлен ряд мутаций в гене пориного белка porB, приводящих к аминокислотным заменам в положении 120-121, а также мутации в промоторной области гена mtrR (делеция А в положении -35), вызывающие увеличение экспрессии помпы эффлюкса MtrC-MtrD-MtrE, которые могут быть ассоциированы к резистентности одновременно к целому ряду антимикробных препаратов. Проведено детальное исследование резистентности изолятов N. gonorrhoeae к тетрациклину. Показано, что долговременный (с 2003 г.) отказ от использования тетрациклина для лечения гонококковой инфекции привел к снижению доли резистентных штаммов в РФ, включая умеренно резистентные, с 75% до 42,6%, однако доля резистентных штаммов остается высокой. Таким образом, исходя их рекомендаций ВОЗ, не следует ожидать скорого возвращения применения препаратов тетрациклинового ряда в число лекарственных средств для лечения гонококковой инфекции. Показано, что в настоящее время сохраняются множественные генетические детерминанты резистентности к тетрациклину: мутации в хромосомных генах (наиболее часто встречались замены Val57Met в гене rpsJ, Gly120Lys в гене porB, делеция delA в промоторной области гена mtrR) и наличие плазмидного гена tetM (обнаружен в 27 штаммах). Мутации в хромосомных генах приводили к увеличению МПК тетрациклина до 2-4 мг/л; МПК около 4 мг/л наблюдали при одновременном присутствии нескольких мутаций. Наличие гена tetM приводило к резкому повышению уровня устойчивости к тетрациклинам до величин МПК 8 мг/л и выше, который не достигался при наличии только хромосомных мутаций. Впервые охарактеризован тип гена tetM у изолятов, полученных в РФ. В исследованной выборке присутствовало 17 генов tetM американского и 10 – голландского типа. Таким образом, результаты, полученные для изолятов, собранных в России, отличаются от результатов по распределению tetM гена в европейских странах, где преобладает американский тип гена, а также от результатов, полученных в соседней Польше, в которой, в основном, обнаружен tetM ген голландского типа. Выявлены последовательности, гомологичные генам tetМ N. gonorrhoeae, у микроорганизмов из родов Streptococcus, Enterococcus и Mycoplasma. Построено филогенетическое древо, на котором видно разделение на два кластера, соответствующих американскому и голландскому типам генов. Полученные нами последовательности tetМ генов в образцах, собранных в РФ, внесены в базу данных, и им присвоены номера GenBank. В рамках данного проекта разрабатывается метод скрининга детерминант антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae, T pallidum, Mycoplasma spp. Ureaplasma sp. на основе гидрогелевых ДНК-микрочипов, произведенных согласно технологии, разработанной в ИМБ РАН. На данном этапе работ определены генетические детерминанты резистентности возбудителей ИРТ к антимикробным препаратам для их последующего анализа с использованием ДНК-чипа, сконструированы праймеры для проведения ПЦР-амплификации и олигонуклеотидные зонды для иммобилизации на ДНК-чипе. Полученные результаты отражены в статьях - Кубанов А.А., Барышков К.В., Честков А.В., Шаскольский Б.Л., Грядунов Д.А., Дерябин Д.Г “Генотипическое разнообразие популяции Neisseria gonorrhoeae в Архангельске (Россия): механизмы формирования и связь с устойчивостью к антимикробным препаратам”, принята в печать в журнал «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология»; - B. Shaskolskiy, E. Dementieva, A. Leinsoo, N. Petrova, A. Chestkov, A. Kubanov, D. Deryabin, D. Gryadunov “Tetracycline resistance of Neisseria gonorrhoeae in Russia, 2015-2017”, находится на второй ревизии в журнале “Infection, Genetics and Evolution”.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Продолжено формирование коллекции клинических образцов возбудителей инфекций репродуктивного тракта N. gonorrhoeae, T. pallidum, Ureaplasma sp и Mycoplasma sp. Использовали штаммы возбудителей из музея ФГБУ ГНЦДК Минздрава России и биологические образцы, собранные в 2016-2018 гг. В дополнение к коллекции, собранной на 1 этапе, получено 108 образцов (клинических изолятов), включающих 68 образцов N. gonorrhoeae, 20 образцов Ureaplasma sp., Mycoplasma sp., 20 образцов T. pallidum. Итого сформированная коллекция содержит 253 образца, их них образцов, демонстрирующих резистентность по крайней мере к одному из лекарственных препаратов, используемых для лечения – 172 (было запланировано по данному проекту 200 клинических образцов). Продолжен сбор образцов геномной ДНК человека для исследования взаимосвязей между протеканием заболевания, вызванного возбудителем ИРТ, факторами патогенности и гаплотипами рецепторов человека. Всего получено 150 образцов от пациентов с обнаруженными заболеваниями (пациенты с подтвержденным диагнозом “гонорея” или “сифилис”) и 150 образцов от здоровых добровольцев (подтверждено отсутствие заболеваний). Проанализировано генетическое разнообразие и изменения в российской популяции N. gonorrhoeae за последние 10 лет. Выявлены корреляции между уровнем фенотипической чувствительности и генетическими детерминантами устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам, включая бета-лактамные антибиотики, тетрациклин, ципрофлоксацин, азитромицин, спектиномицин. Среди детерминант резистентности к пенициллинам обнаружены инсерция Asp в кодоне 345 гена penA, замена Leu421Pro в гене ponA, мутации в гене porB1b, делеция аденина в -35 положении относительно сайта инициации транскрипции гена mtrR, приводящие к образованию умеренно-резистентных штаммов. Выявленный спектр хромосомных мутаций и их сочетаний в изолятах N. gonorrhoeae подтверждает аддитивный эффект анализируемых детерминант в определении уровня устойчивости к пенициллину G. Ген blaTEM плазмидной локализации был идентифицирован только в изолятах с высоким МПК по пенициллину (МПК ≥ 8 мг/л), независимо от наличия хромосомных мутаций, подтверждая ранее описанную для N. gonorrhoeae корреляцию наличия бета-лактамаз, продуцируемых плазмидным геном, с высоким уровнем устойчивости к пенициллинам. В анализируемой выборке идентифицировано только 3 изолята с повышенным МПК по цефтриаксону (МПК = 0,12-0,25 мг/л). Ни одна из перечисленных выше детерминант или их сочетаний не ассоциирована с чувствительностью данного уровня. Секвенирование гена penA в данных изолятах не обнаружило мутаций, ассоциированных с устойчивостью к цефалоспоринам 3-го поколения, и выявило немозаичный тип гена penA. В изолятах, устойчивых к тетрациклину, наиболее часто встречались замены в кодоне 57 гена rpsJ (Val57Met), приводящие к появлению умеренно-резистентных штаммов. На устойчивость к тетрациклину оказывали влияние также мутации в генах porB, в основном, замена Gly120Lys, и в промоторной области гена mtrR. Мутации в хромосомных генах приводили к увеличению МПКтет до 2-4 мг/л. Изоляты, несущие плазмиду с геном tetM, демонстрировали высокий уровень устойчивости (МПК 16-64 мг/л). В большинстве штаммов (21 из 25), несущих плазмиду blaTEM, была обнаружена плазмида с геном tetМ. Ген tetM у N. gonorrhoeae расположен на конъюгативной плазмиде, структура которой способствует переносу в клетку других плазмид. Таким образом, при анализе механизма приобретения лекарственной устойчивости следует обращать особое внимание на штаммы N. gonorrhoeae, резистентные к тетрациклину и несущие плазмиду tetМ, поскольку ее присутствие облегчает перенос других плазмид, содержащих гены, ассоциированные с устойчивостью к другим антимикробным препаратам. Получена хорошая корреляция между уровнем устойчивости к ципрофлоксацину и наличием мутаций в генах gyrA и parC. Различные сочетания мутаций в данных локусах приводили к повышению МПК с 0,12 до 8 мг/л. Анализируемая выборка включала 9,4% устойчивых к азитромицину изолятов (МПК ≥ 0,5 мг/л). Причиной устойчивости являются мутации в генах, влияющих на поступление и эффлюкс лекарственных препаратов из клетки. Анализируемая выборка не содержала изолятов N. gonorrhoeae, устойчивых к спектиномицину, что было подтверждено отсутствием мутаций в гене 16S рРНК, ассоциированных с резистентностью к этому препарату. Установлены тренды в изменении уровней фенотипической чувствительности и встречаемости генетических детерминант лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae за десятилетний период в Российской Федерации. За период с 2005 по 2016 год нами зафиксировано существенное увеличение доли изолятов, чувствительных к пенициллину G (с 22,6% до 63,0%), тетрациклину (с 34,8% до 53,0%) и ципрофлоксацину (с 50,6% до 68,6%). Вместе с тем, выявленная доля устойчивых к данным антибиотикам изолятов не позволяет использовать их в качестве препаратов для терапии возбудителя. Поскольку в целом по России зарегистрирован высокий процент чувствительных к спектиномицину изолятов N. gonorrhoeae, этот препарат можно использовать его в качестве альтернативы цефтриаксону в регионах РФ, где доля чувствительных к спектиномицину штаммов превышает 95%. Анализ генетических детерминант устойчивости к противомикробным препаратам N. gonorrhoeae в коллекции 2005 г. в сравнении с 2016 г. показал значительное снижение числа изолятов, содержащих хромосомные мутации, что хорошо коррелирует с повышением уровня фенотипической чувствительности. Однако доля изолятов, обладающих плазмидами blaTEM и tetM, детерминирующими устойчивость высокого уровня к пенициллинам и тетрациклинам, практически не изменилась, что указывает на существование не только горизонтального переноса как механизма распространения резистентных изолятов возбудителя гонореи. Впервые для образцов РФ определен тип плазмиды и вариант фермента бета-лактамазы В изолятах, обладающих плазмидным геном blaTEM, не обнаружено мутаций в гене бета-лактамазы, которые могли бы привести к расширению спектра действия фермента – способности разрушать цефалоспорины (Met182Thr, Gly238Ser). Анализ современной российской популяции изолятов гонококковой инфекции показал отсутствие в ней мультирезистентных клонов, демонстрирующих высокий уровень устойчивости к цефалоспоринам III поколения, таких как штаммы H041 и F89, выявленные в ЕС, США, Японии. Незначительное число изолятов со сниженной чувствительностью к цефтриаксону и отсуствие у них детерминант, ассоциированных с устойчивостью к цефалоспоринам 3-го поколения, является основанием для сохранения рекомендаций по использованию цефтриаксона в качестве препарата первой линии терапии. Построено филогенетическое древо для NG-MAST-типов образцов N. gonorrhoeae, собранных в РФ и в мире. Для анализируемых образцов не наблюдалось выраженного географического тропизма. Филогенетически близкие и даже одинаковые сиквенс-типы встречались в разных странах. Для российских изолятов была обнаружена группа из 2-х типов 12444 и 387, не встречающаяся в других странах и отстающая от других кластеров достаточно далеко. Группа для типа 15644 также встречалась только в России. В РФ обнаружен только 1 образец распространенного в Европе и мире и пандемически значимого молекулярного типа 1407. Таким образом, наблюдаются две тенденции: глобальное распространение линейки филогенетически близких штаммов и автохтонное существование и эволюция местных штаммов. Для анализа уровня генетического разнообразия и роли давления отбора в формировании паттернов неравновесного сцепления рассчитаны значения статистического критерия ω в популяции возбудителей Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis – филогенетически близких бактерий, возбудителей гонореи и менингита у человека. Анализ выполнен с использованием 1302 геномов N. gonorrhoeae и 489 геномов N. meningitidis, взятых из доступной базы данных https://pathogen.watch. Выявлены гены возбудителей, которые имеют преимущество при отборе (ω > 10): 19 генов N. gonorrhoeae и более 50 генов N. meningitidis, определены и проанализированы функции белков, кодируемых данными генами. Для N. gonorrhoeae наиболее важными вариациями генома являются изменения, способствующие усилению иммунного ответа и резистентности к антимикробным препаратам (группа генов, кодирующих белки, принимающие участие в клеточном метаболизме железа, группа генов, кодирующих белки, принимающие участие в образовании и модификации пилей – ключевого адгезина гонококков, гены и участки ДНК, отвечающие за вывод антимикробных препаратов из клетки и ассоциированные с лекарственной устойчивостью), а для N. meningitidis гены с наибольшей изменчивостью принадлежат белкам, участвующим в биосинтезе аминокислот, белкам транспортных систем и белкам превращения и репарации ДНК. Построены филогенетические деревья методом максимального правдоподобия: филогенетическое древо для core-геномов N. gonorrhoeae (1302 генома из стран Европы и США) и отдельно древо для core-геномов N. gonorrhoeae из стран Европы (1054 генома из коллекции EUROGASP); филогенетические древа для core-геномов N. gonorrhoeae из стран Европы с обозначением устойчивости изолятов к азитромицину, ципрофлоксацину, цефиксиму; филогенетическое древо для core-геномов N. meningitidis (489 геномов из Нидерландов, Ганы, Буркина-Фасо и России). Анализ геномов N. gonorrhoeae показал генетическую гетерогенность популяций внутри анализируемых стран. Устойчивость к антимикробным препаратам соответствовала устойчивости ближайших соседей на филогенетическом древе, что может свидетельствовать об их общем происхождении от относительно близкого предка. В случае изолятов N. meningitidis заметно чёткое разделение африканских и европейских изолятов. Для уточнения роли изменений в геноме N. gonorrhoeae в формировании устойчивости к антимикробным препаратам методами обратной генетики получены следующие мутантные формы N. gonorrhoeae: (1) N. gonorrhoeae, несущая аминокислотную замену Ser87Arg в гене parC; (2) N. gonorrhoeae с инсерцией ТТ в промоторной области гена mtrR; (3) N. gonorrhoeae, содержащая плазмидную детерминанту blaTEM, несущую мутации Met182Thr и Gly238Ser. На основе анализа генетического разнообразия изолятов N. gonorrhoeae в российской популяции выбраны 10 изолятов-кандидатов для проведения полногеномного секвенирования: изоляты N. gonorrhoeae с множественной лекарственной устойчивостью, в том числе, изоляты, в которых выявлено несоответствие между обнаруженными детерминантами устойчивости и фенотипическими характеристиками. Продолжена разработка ДНК-чипа для одновременного определения детерминант антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae, T. pallidum, Mycoplasma spp. Ureaplasma spp. и тест-системы на его основе. Биочип содержит 113 ячеек с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, 8 ячеек, не содержащих зондов, для вычисления фонового сигнала, 3 ячейки, содержащие иммобилизованный флуоресцентный маркер. Проведена оптимизация проведения мультиплексной амплификации и гибридизации при анализе с использованием биочипа. Отработаны условия автоматического получения результатов анализа с использованием Универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК) для анализа биологических микрочипов (разработан в ИМБ РАН). Определены диагностическая чувствительность (Sn) и специфичность (Sp) биологических микрочипов при анализе резистентности клинических изолятов N. gonorrhoeae к тетрациклину, пенициллину, ципрофлоксацину и азитромицину в сравнении с референсным методом (фенотипическим анализом). Значения Sn оказались в диапазоне 89-92%, Sp 93-95%, что соответствует значениям, характеризующим лучшие зарубежные молекулярные тесты для идентификации генетических детерминант лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae. Полученные в рамках проекта результаты доложены на трех международных (43rd FEBS Congress, Prague, 14th International Conference on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases (MEEGID), Sitges, Spain; Молекулярная диагностика 2018, Минск) и двух российских конференциях (IV Российский конгресс лабораторной медицины, Москва; XVIII Всероссийский Съезд дерматовенерологов и косметологов, Москва).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведен анализ антибиотикорезистентности изолятов N. gonorrhoeae, полученных в 2018-2019 гг. из 17 регионов РФ, географически распределенных по всей территории страны, всего в – 274 клинических изолята: 151 образец 2018 г. и 123 образца 2019 г. Все образцы охарактеризованы по чувствительности к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, спектиномицину, азитромицину, цефтриаксону, измерены МПК этих препаратов. Для идентификации генетических детерминант резистентности использовали лабораторный прототип тест-системы на основе гидрогелевых биочипов, разработанный в рамках данного проекта РНФ, таргетное секвенирование, а также полногеномное секвенирование. Установлены основные тенденции в профилях детерминант антибиотикорезистентности и паттернах фенотипической чувствительности изолятов N. gonorrhoeae на территории РФ за последние годы, обусловленных селективным давлением антимикробных препаратов. В 2018-2019 гг. не обнаружено изолятов, устойчивых к цефтриаксону, выявлено два изолята с повышенным уровнем МПК. Секвенирование данных образцов не выявило мутаций, которые могли бы привести к устойчивости к цефалоспоринам 3-го поколения, в частности, показано, что ген penA имеет немозаичную структуру, отсутствуют замены остатка Ala в немозаичных аллелях гене penA. Все клинические изоляты российской популяции N. gonorrhoeae 2018-2019 гг. оказались чувствительными к спектиномицину, что подтверждено отсутствием соответствующих детерминант резистентности в гене 16S рРНК. Показано, что устойчивость к пенициллинам, которые не используются в РФ для лечения гонококковой инфекции в течение более 15 лет, сохраняется стабильно высокой. Только 39,4% исследованных изолятов 2018-2019 гг. оказались чувствительными к пенициллину. Основными выявленными детерминантами, приводящими к устойчивости к препаратам пенициллинового ряда, являлись инсерция аспартата в 345 положение пенициллин-связывающего белка 2 (наиболее частая мутация), замена Leu421Pro в пенициллин-связывающем белке 1 (ген ponA), а также мутации в гене поринового белка Gly120Lys, Ala121Asn,Gly и промоторном участке гена mtrR (увеличение экспрессии помпы эффлюкса MtrCDE). В гене mtrR, помимо делеции -35delA, впервые в российских клинических изолятах идентифицирована инсерция T (insT, 2 образца). В 4-х образцах обнаружена плазмида blaTEM, несущая ген бета-лактамазы (африканский тип), присутствие которой приводит к высокому уровню резистентности (МПКпен 8-32 мг/л). Показано, что устойчивость к фторхинолонам в изолятах, выявленная в 33,1% образцов, обусловлена наличием мутаций в гене gyrA, приводящим к аминокислотным заменам Ser91Phe и Asp95Asn,Gly, и в гене parC, приводящим к заменам Ser87Asn,Arg,Ile и Glu91Gly. Долговременное неиспользование тетрациклина для лечения гонококковой инфекции в РФ привело к снижению доли резистентных к тетрациклину штаммов с 75% до 50,5%, однако устойчивость к тетрациклину в настоящее время остаётся на высоком уровне, что связано с наличием мутаций в хромосомных генах: rpsJ (замена Val57Met), porB (замены Gly120Lys и Ala121Gly), делецией delA в промоторной области гена mtrR, а также с присутствием плазмиды с геном tetM. Показана тенденция к снижению устойчивости изолятов РФ к макролидам: обнаружено 5,5 % резистентных и умеренно-резистентных штаммов. Резистентность ассоциирована только с мутациями промоторной области гена mtrR, в то время как гене 23S рРНК мутации отсутствовали. Проведено NG-MAST типирование современных российских клинических изолятов N. gonorrhoeae путем анализа нуклеотидных последовательностей вариабельных участков генов porB (490 bp) и tbpB (390 bp) в соответствии с протоколом NG-MAST. Определены NG-MAST типы, наиболее часто встречающиеся в РФ: NG-MAST 807, 9486, 1993, 228, 5714, 1751. В 2019 г. на первом месте по распространенности в РФ оказался NG-MAST 807 (8,1 %), на втором – уникальный российский сиквенс-тип 9486 (5,7%). Доля NG-MAST 228, который занимал первое место по встречаемости в 2018 г., уменьшилась в 2019 г. с 14,6% до 3,3 %. В 2018-2019 гг. не обнаружено образцов пандемически значимого молекулярного типа 1407, который представляет большую опасность из-за наличия множественных детерминант резистентности к антимикробным препаратам и является доминирующим во многих странах ЕС и в Японии. NG-MAST типирование российских клинических изолятов N. gonorrhoeae показало их существенное отличие от современных популяций возбудителей гонококковой инфекции в странах ЕС. Популяция N. gonorrhoeae Японии сильно отличается как от российской, так и от европейской. Построены филогенетические древа по максимальному правдоподобию для (1) NG-MAST типов клинических изолятов N. gonorrhoeae Европы и России, (2) отдельно для NG-MAST типов российских изолятов. Анализ филогенетических деревьев показал отсутствие близкого филогенетического родства между наиболее распространенными европейскими сиквенс-типами NG-MAST 1407, 2992, 2400, 4995, 21, 225, а также близкого родства между наиболее распространенными европейскими и российскими сиквенс-типами, такими как NG-MAST 807, 1152, 5941. Результаты сравнительного филогенетического анализа позволяют сделать вывод о том, что географически разделенные популяции N. gonorrhoeae эволюционируют относительно локально, что может быть служить причиной различий в уровне и динамике заболеваемости гонококковой инфекцией в России и странах ЕС. Обнаружены ассоциации лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae с сиквенс-типами изолятов. Филогенетический анализ сиквенс-типов, обнаруженных в российских образцах, выявил семь основных геногрупп РФ, включающих наиболее часто встречающиеся сиквенс-типы. Самая большая геногруппа G807 содержала 21,5% от всех образцов, относящихся к 27 сиквенс-типам, включая три наиболее часто встречающихся в России сиквенс-типа 807, 228 и 1544. Вторая по величине геногруппа G1993 содержала 9,6%, принадлежащих к 13 сиквенс-типам. Российские изоляты, принадлежащие к разным геногруппам, имели разные профили лекарственной устойчивости. Наиболее распространенный в РФ сиквенс-тип 807 и филогенетически близкие представители геногруппы G807 демонстрировали высокую чувствительность к цефтриаксону (100%), спектиномицину (100%) и ципрофлоксацину (98,3%); 78% изолятов этой геногруппы были чувствительны к азитромицину. На сегодняшний день генетические особенности российских изолятов не привели к развитию устойчивости к цефалоспоринам 3-го поколения. Продолжен биоинформационный анализ факторов патогенности N. gonorrhoeae и N. meningitidis на основе данных полногеномного секвенирования 1302 геномов N. gonorrhoeae и 489 геномов N. meningitidis. Для генов с высоким значением статистического критерия “выметание отбором” ω, выявленных на предыдущих этапах работы, определены значения dn/ds – отношение числа несинонимичных замен и синонимичных замен. Величины dn/ds показали, что изменения в генах с высокими значениями ω происходят медленнее, чем в других (за исключением генов белков-пилинов), однако быстрее, чем в генах белков домашнего хозяйства. Значения критерия dn/ds у белков N. gonorrhoeae и N. meningitidis с одинаковыми функциями (PilV, рибонуклеаза BN, трансферрин-связывающий белок) оказались близки, что указывает на примерно одинаковую скорость изменения в генах сходных белков у обоих возбудителей. Проведен подробный анализ аминокислотных замен в 14 белках N. gonorrhoeae: белок ApbC, бактериоферритин B, шаперон Clpb, цитохром С, белки-пилины PilX, PilV, FimA, белок помпы эффлюкса MexA, УДФ-N-ацетилмурамилтрипептидсинтетаза, аденилосукцинатлиаза, рибонуклеаза BN, инозитол-1-монофосфатаза, трансферрин-связывающий белок, НАД(Ф)Н нитроредуктаза, кодируемых генами с высокими значениями ω. Наименьшее число замен оказалось у бактериоферритина B, наибольшее выявлено для белков-пилинов (гены fimA, pilX, pilV). У 13 из 14 исследованных белков замены в точках неравновесного либо отсутствовали, либо их наблюдалось очень мало. Исключение составил белок, кодируемый геном murE, для которого в ключевой аминокислоте Lys135 обнаружено 492 замены Lys-Glu. Проведено моделирование трехмерных структур вышеперечисленных белков и определено расположение ключевых аминокислотных остатков (точек неравновесного сцепления) в трехмерных структурах. Исследован вклад изменений в геноме N. gonorrhoeae в формирование устойчивости к антимикробным препаратам. Установлен вклад хромосомных мутаций и их сочетаний, а также детерминант резистентности плазмидной локализации в уровень фенотипической устойчивости N. gonorrhoeae к различным антимикробным препаратам. Показано, что идентификация плазмидных генов blaTEM и tetM в изолятах N. gonorrhoeae свидетельствует об устойчивости высокого уровня к пенициллинам и тетрациклинам, соответственно, независимо от наличия генетических детерминант резистентности хромосомной локализации. Проведено сравнение результатов полногеномного секвенирования российских изолятов N. gonorrhоeae с данными полногеномного секвенирования наиболее опасных мультирезистентных штаммов, принадлежащих к молекулярному типу 1407. Изоляты РФ, использованные для секвенирования включали 10 изолятов с множественной устойчивостью и два изолята-представителя наиболее распространенного в РФ сиквенс-типа 807. Результаты секвенирования подтвердили соответствие фенотипических характеристик изолятов и обнаруженных детерминант антибиотикорезистентности. В одном из образцов обнаружена конъюгативная плазмида, несущая ген tetМ. Мультирезистентные штаммы NG-MAST 1407, циркулирующие в Европе и в мире, содержат мозаичный аллель гена penA, мутации в промоторной области гена mtrR и замены в белке-порине PorB для них также характерны множественные замены в пенициллин-связывающем белке 2 (ген penA) и пенициллин-связывающем белке 1 (ген ponA), топоизомеразе (ген parC), рибосомном белке Rpsj. В секвенированных нами образцах молекулярного типа 807, а также в штаммах других типов, полученных в РФ, не обнаружено мозаичных аллелей гена penA и других мутаций, приводящих к появлению резистентных к цефтриаксону штаммов. Результаты секвенирования показали отсутствие генов ermA/B/C/F, а также мутаций в генах rpsE, rrs, rrl, rplD, rplV, macAB и mefA, приводящих к устойчивости к спектиномицину и макролидам. Таким образом, большинство российских изолятов принадлежат геногруппам, несущих небольшое число детерминант антибиотикорезистентности. Завершена разработка лабораторного прототипа тест-системы на основе гидрогелевых биочипов, предназначенной для идентификации генетических детерминант устойчивости возбудителей инфекций репродуктивного тракта человека (ИРТ) N. gonorrhoeae, T. pallidum, Mycoplasma spp., Ureaplasma spp. к ципрофлоксацину, азитромицину, тетрациклину, спектиномицину, пенициллину, цефтриаксону. Для анализа используется ДНК возбудителей ИРТ, выделенная из клинического материала. Тест-система включает (а) комплект реагентов для проведения мультиплексной ПЦР-амплификации и флуоресцентного маркирования фрагментов геномов возбудителей; (б) комплект реагентов для проведения гибридизации на биологических микрочипах; (в) гидрогелевые биочипы с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами. Аналитическая чувствительность тест-системы составила 1х10^3 геном-экв/мкл. Среднее время проведения анализа клинических образцов с использованием тест-системы составило 8 час (без учета времени выделения ДНК). Диагностические чувствительность и специфичность тест-системы в отношении идентификации генетических детерминант лекарственной устойчивости к тетрациклину, пенициллину G, ципрофлоксацину и азитромицину составили 88,8% - 91,5% и 93,4% - 95,0%, соответственно. Разработанный метод и прототип тест-системы может быть использован для быстрого скрининга клинического материала на предмет выявления генетических детерминант лекарственной устойчивости. Разработан гидрогелевый биочип с панелью из 12 диагностических антигенов T. pallidum для одновременной детекции трепонема-специфических антител разных классов (IgG, IgM) к рекомбинантным антигенам T. рallidum в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Результаты, полученные с использованием биочипов, хорошо согласуются с данными стандартных серологических тестов. Технология с применением иммуночипа даёт перспективу расширения диагностических возможностей трепонемных тестов при контроле эффективности терапии сифилиса. Полученные в рамках проекта результаты доложены на трех международных и российских конференциях: XIX Всероссийский съезд дерматовенерологов и косметологов, г. Москва; 44 международный конгресс FEBS, Краков, Польша; Первая всероссийская междисциплинарная конференция “Микрофлюидика: современные успехи и перспективы развития”, г. Москва.