Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для изучения взаимосвязи между генерацией сероводорода и метаболизмом цистеина сконструированы штаммы E.coli с измененной экспрессией генов, контролирующих синтез (cysB, cysK, cysE) и транспорт (tcyP, tcyJ, ydeD) цистеина. Методом ПЦР в реальном времени определен уровень экспрессии генов cysB, cysK, cysE, tcyP, tcyJ, ydeD в бактериях дикого типа и мутанте с нарушенной продукцией H2S (∆mstA) и мутанте со сверхпродукцией H2S (Ptet-mstA). Показано, что у мутанта Ptet-mstA с высоким уровнем генерации H2S экспрессия CysB-регулируемых генов повышена, тогда как у мутанта дефектного по продукции H2S экспрессия этих генов снижена до базального уровня и не подвержена позитивной регуляции белком CysB. Продемонстрировано снижение уровня генерации H2S мутантом Ptet-mstA в результате инактивации гена cysB, кодирующего транскрипционный активатор CysB семейства генов синтеза и транспорта цистеина и гена cysE, ответственного за синтез О-ацетилсерина, который служит позитивным эффектором белка CysB. Инактивация находящихся под контролем белка CysB генов tcyP и tcyJ, кодирующих белки транспортеры цистеина в цитоплазму, также приводила к снижению продукции H2S мутантом Ptet-mstA, тогда как у делеционных мутантов cysK и ydeD она оставалась на прежнем уровне. Установлено, что конститутивная экспрессия транспортера TcyP под контролем промотора Ptet приводит к повышению продукции H2S, в то время как конститутивная экспрессия транспортера YdeD, ответственного за экспорт цистеина из цитоплазмы в периплазму, напротив, приводила к снижению генерации H2S. На основании полученных данных делается заключение о том, что основным предшественником эндогенного H2S является цистеин, поступающий в клетку из внешней среды. В различные положения фактора терминации транскрипции Rho Escherichia coli введен генетически кодируемый пептид Avitag, биотинилируемый in vivo биотин-лигазой BirA. Показано, что экспрессия гибридных конструкций, кодирующих фактор с заменой экспонированной наружу полипептидной петли на Avitag или его слияние с С-концом Rho, имеет те же фенотипические проявления, что и при экспрессии гена Rho дикого типа. Продемонстрирована эффективная одностадийная очистка фактора Rho с использованием аффинной хроматографии. Установлена роль Rho-зависимой терминации транскрипции в аттенюации гена cysE, участвующего на первом этапе пути биосинтеза цистеина. Сконструированы штаммы E.coli с делециями генов малых РНК rybB, fnrS и гена РНК-связывающего белка hfq. Получено несколько трансгенных линий Drosophila melanogaster, которые несут в своём геноме два (из четырёх) дополнительных гена, участвующих у этого вида в контроле синтеза сероводорода и других активных форм серы (АФС). Эти трансгенные линии («бинарная система») позволяют изучать роль конститутивной и индуцируемой мифепристоном суперэкспрессии этих генов во всём теле или в отдельных органах в ответе на различные формы стресса, а также в контроле продолжительности жизни и других важнейших физиологических процессах таких как плодовитость и др. Предварительные опыты по исследованию продолжительности жизни у мух, с суперэкспрессией генов контролирующих синтез АФС во всём теле, показали перспективность такого подхода. Разработан экспериментальный подход для получения делеций по всем четырём генам, участвующим в продукции АФС с помощью системы CRISPR/Cas9 на основе вектора pCFD. В ходе разработки этого подхода в дополнение к запланированным опытам получена линия с делецией гена (HSR), который по данным лаб. Нудлера играет важную роль в ответе на тепловой шок и другие формы стресса в клетках человека и дрозофилы. В дополнение к заявленному плану были начаты работы по изучению влияния АФС на активность убиквитин-протеасомальной системы, отвечающей за деградацию большинства клеточных белков и поддержание белкового гомеостаза клетки. Проводили разработку подходов и дизайн экспериментов для изучения влияния различных концентраций донора сероводорода GYY4137 на активность и субъединичный состав протеасом в клетках нейронального происхождения в присутствии веществ, вызывающих окислительный стресс клеток. Проведен анализ экспрессии генов Cbs, Cth и Mst, ответственных за продукцию H2S, в молодых и старых мезенхимальных стволовых клетках мыши. Полученные данные показывают наличие модуляции экспрессии этих генов при переходе от гипоксии и нормоксии, а также при старении клеток в культуре. Активация или ингибирование сигнального пути АМФК в молодых клетках не оказывает воздействия на экспрессию указанных генов, однако определенная модуляция их экспрессии наблюдалась при активации АМФК в старых клетках.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Получена коллекция штаммов E.coli с измененной экспрессией генов cyoB, cydB, cydD, контролирующих синтез терминальных оксидаз и изучена их способность к генерации H2S. Показано, что усиление экспрессии гена cydD приводит к заметному увеличению продукции H2S и одновременно обусловливает повышенную чувствительность бактерий к окислительному стрессу. Обнаружен дополнительный путь генерации H2S в клетках E.coli, активность которого находится под контролем транскрипционного регулятора CysB. Выявлена мутация в гене lpcA, которая приводит к суперчувствительности бактерий к ряду антибиотиков (налидиксовая кислота, рифампицин). Результаты РТ-ПЦР экспериментов выявили разный ответ терминальных оксидаз на окислительный стресс и уровень генерации H2S в бактериальной клетке. Полученные данные указывают на участие терминальных оксидаз и генов, вовлеченных в генерацию H2S, в поддержании редокс-статуса бактериальной клетки. Результаты протеомного анализа показали, что в клетках штамма с делецией гена lpcA наблюдается увеличение фракций, соответствующих белкам Ivy и OsmY, принимающих участие в защите от осмотического стресса и стабилизации пептидогликана клеточной стенки. Обнаружено значительное изменение редокс-статуса клеток и снижение жизнеспособности E.coli в результате точковой мутации или делеции гена lpcA, кодирующем белок седогептулозо-7 фосфат изомеразу, которая катализирует первый этап в биосинтезе основного компонента липополисахаридов. Делеция lpcA приводит к возрастанию восстановленных тиолов, в том числе глутатиона и цистеина, в 3-4 раза, вызывает рост АФК и более чем в 10 раз повышает процент мертвых клеток в популяции. Таким образом, нарушение работы lpcА, приводя к значительному изменению внутриклеточного редокс-статуса, существенно снижает жизнеспособность клеток бактерий, что свидетельствует о перспективности создания ингбиторов lpcA для антибактериальной терапии. Выполнены ковалентные химические сшивки фактора Rho с белками-партнерами с использованием дисукцинимидил суберата и формальдегида. В качестве белковых партнеров Rho, помимо субъединиц РНК-полимеразы, установлены факторы элонгации NusA и NusG, киназа srkA и ряд белков с неизвестной функцией. Были суперпродуцированы и очищены факторы Rho и NusA и кор РНК-полимеразы E.coli. Обнаружено, что для стабилизации комплекса гексамера Rho с РНК-полимеразой необходим фактор NusA. Были проведены пилотные эксперименты по выбору оптимального способа исследования межмолекулярных взаимодействий данных белков с помощью биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса и микромасштабного термофореза. Охарактеризовано действие донора сероводорода NaHS и активатора АМФК (АИКАР) на клетки нейробластомы человека линии SH-SY-5Y. Установлено, что данные вещества усиливают антиоксидантную защиту клетки, приводя к возрастанию уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона. Совместное использование донора сероводорода и АИКАР оказывает существенно большее влияние на редокс-статус клеток, чем их использование по отдельности. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о перспективности совместного использования доноров сероводорода и АИКАР для усиления антиоксидантной защиты нейрональных клеток. Исследованы эффекты конститутивной повсеместной сверхэкспрессии генов контроля биосинтеза сероводорода CBS и CSE на максимальную продолжительность жизни, плодовитость, стрессоустойчивость и локомоторную активность самцов Drosophila melanogaster. Геропротекторный эффект выявлен только при повсеместной сверхэкспрессии CBS. Отмечены как благоприятные так и негативные эффекты сверхэкспрессии CSE и CBS на локомоторную активность и устойчивость к разным неблагоприятным воздействиям (гипертермия, окислительный стресс, сочетание обезвоживания и голодания). Результаты исследования могут быть использованы при поиске потенциальных мишеней фармакологической коррекции продолжительности жизни и увеличения здорового долголетия. С использованием 3 видов рода Drosophila, различающихся по максимальной продолжительности жизни, нами были исследованы механизмы геропротекторных эффектов N-ацетил-L-цистеина (NAC) и проведена оценка соответствия NAC критериям геропротекторов. Установлено, что NAC не соответствует критериям геропротекторов в полной мере, поскольку его эффекты на продолжительность жизни находятся в зависимости от пола и видовой принадлежности особи. Результаты анализа уровней экспрессии генов контроля антиоксидантной защиты (Cat/CG6871, Sod1/CG11793) и генов, участвующих в контроле биосинтеза сероводорода (Cbs/CG1753, Eip55E/CG5345, Nfs1/CG12264) предполагают, что геропротекторные свойства NAC взаимосвязаны с активацией механизмов антиоксидантной защиты, биосинтеза сероводорода и обусловлены механизмами гормезиса. Полученные результаты могут быть использованы для описания механизмов действия геропротекторов, а также для выявления геропротекторных эффектов у известных препаратов. Разработаны и получены конструкции для CRISPR экспериментов с целью получения делеций основных генов контролирующих метаболизм серы у дрозофилы. С использованием этих конструкций получено по 3-4 линии с делецией каждого гена. Начаты скрещивания для получения двойных гомозигот по парам изучаемых нами генов (например, CBS и CSE). Проводятся опыты для выяснения роли изучаемых генов при различных формах стресса, а также их роль в процессе старения. Установлено, что в клетках SH-SY5Y под действием GYY4137 снижается активность протеасом, однако не происходит изменения содержания как структурных, так и каталитических субъединиц протеасом. При этом иммунные субъединицы в этих клетках практически не выявляются. В клетках SH-SY5Y под действием GYY4137 не происходит изменения уровней экспрессии каталитических субъединиц протеасом. Таким образом, наблюдаемые изменения активности протеасом, вероятно, связаны с пострансляционными модификациями субъединиц протеасом и их кофакторов. Завершены исследования роли гена HSR, который по данным, полученным на культуре клеток дрозофилы, продуцирует длинную некодирующую РНК, являющуюся термосенсором. Показали, что мухи гомозиготные по гену HSR, достоверно не отличаются по термоустойчивости от контрольных мух дикого типа. С использованием линии нейробластомы человека и нескольких других культур клеток исследовали защитное действие доноров активных форм серы (медленный-GYY4137 и быстрый-NaHS) при действии бактериального эндотоксина LPS. Проведенные эксперименты показали, что использованные компаунды эффективно защищают все использованные в работе типы клеток от действия LPS. Замечательно, что применение этих доноров оказалось эффективным и понижало уровень TNFα, активных форм кислорода (АФК) и оксида азота (NO) как в опытах с профилактическим введением (до токсина), так и при введении после токсина. Проведены эксперименты по длительному культивированию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) мыши в условиях гипоксии (5% О2) и нормоксии (21% О2) в присутствии донора сероводорода NaHS. Показано, что оптимальные концентрации донора сероводорода NaHS замедляют старение МСК в культуре и стимулируют пролиферацию старых МСК как при гипоксии, так и, в особенности, при нормоксии. При этом высокие концентрации NaHS, наоборот, способны тормозить дозозависимым образом пролиферацию МСК. Показано, что донор сероводорода NaHS защищает меланомные клетки и МСК от негативного действия инфракрасного лазерного излучения. Проведены эксперименты по совместному действию NaHS и активатора АМФК АИКАР на МСК мыши. Получены данные, свидетельствующие о существовании взаимодействия между сигнальными путями, в которых участвуют АМФК и сероводород. Созданы ретро- и лентивирусные конструкции для оверэкспресии гена CBS мыши в МСК. Созданы лентивирусные конструкции для инактивации гена CBS мыши в МСК с помощью технологии CRISPR.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Изучена взаимосвязь между активностью генов, ответственных за транспорт цистеина (tcyP, eamA), продукцией H2S (мутанты ∆mstA и Ptet-mstA) и функционированием терминальной оксидазы CydDC. Представлены экспериментальные доказательства, что комплекс CydDC не принимает участие в экспорте цистеина из цитоплазмы в периплазму, как это предполагалось ранее. Показано, что присутствие в геноме бактерий делеции ∆cydD приводит к повышению устойчивости клеток к окислительному стрессу, вызванному пероксидом водорода и сопровождается повышением уровня транскрипции генов sodА, sodB и katG. Из этого следует, что инактивация cydDC приводит к возникновению окислительного стресса и увеличению уровня генерации ROS в клетке. Представленные результаты позволяют заключить, что комплекс CydDC способствует восстановлению цистина в цистеин и это приводит к промотированию реакции Фентона и генотоксическому стрессу. Таким образом, терминальная оксидаза CydDC играет важную роль в поддержании редокс-баланса бактериальной клетки. Исследован эффект мутаций cyoA и cydA E.coli, нарушающих активность терминальных оксидаз bo' и bd-I соответственно, на продолжительность жизни нематод C. elegans. Показано, что средняя продолжительность жизни нематод при выращивании на мутантах cyoA увеличивалась на 15.5%, а на мутантах cydA – на 12.8%. Известно, что мутанты cyoА и cydА характеризуются повышенным уровнем генерации активных форм кислорода. Мы предполагаем, что увеличение продолжительности жизни C.elegans обусловлено умеренным окислительным стрессом, который возникает в организме нематод при культивировании на этих мутантных бактериях. В настоящей работе мы подтвердили полученные ранее данные о том, что делеция гена lpcA (gmhA) в клетках E.coli приводит к изменению нормального метаболизма низкомолекулярных тиолов и, как следствие, нарушению редокс-баланса клетки. Продемонстрировано, что мутант ∆lpcA проявляет повышенную чувствительность к окислительному стрессу, вызванному паракватом, но не пероксидом водорода. Кроме того, мутант ∆lpcA характеризуется повышенной чувствительностью к действию хинолонов, таких как налидиксовая кислота и рифампицину, ингибирующему ДНК-зависимую РНК-полимеразу, что может быть связано с генотоксическим стрессом, вызванным повышенной генерацией АФК. На основании анализа данных, полученных с помощью редокс-сенсора ro-GFP и внутриклеточного красителя на АФК, установлено, что делеция гена lpcА приводит к снижению содержания полисульфидов в бактериальных клетках с делецией генов mstA и lpcA по сравнению с контролем, причем наибольшее снижение наблюдается в случае делеции lpcA. Методом ЯМР установлено, что клеточные небелковые экстракты содержат в основном восстановленный глутатион, количество других небелковых тиолов, цистеина и меркаптопирувата, существенно ниже и практически не вносит вклада в пул определяемых небелковых тиолов. При этом доля окисленного глутатиона составляет менее 5% от количества восстановленного. Обнаружено, что делеция lpcА приводит к снижению уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона более чем в 2 раза. Таким образом, наблюдаемое ранее возрастание внутриклеточных тиолов при инактивации или делеции lpcА наблюдалось за счет снижения полисульфидов и возрастания пула восстановленных белковых тиолов, в то время как уровень восстановленного глутатиона существенно снижается. Можно заключить, что эти изменения являлись одной из причин снижения жизнеспособности клеток. Определена роль генов mstA и lpcA в процессе редокс-модификаций белков (сульфгидрирования и глутатионилирования) в клетках E.coli. Показано, что делеция ∆mstA и, в меньшей степени, делеция ∆lpcA приводит к снижению общего уровня сульфгидрирования белков. Обнаружилось, что наибольшие изменения в паттерне глутатионилирования наблюдались при делеции гена ∆lpcA. Показано, что мажорная полоса глутатионилирования соответствует белку GAPDH, который необходимым для энергетического обмена и продукции АТФ и пирувата посредством гликолиза. В клетках с делецией ∆lpcA и двойной делецией ∆mstA ∆lpcA происходит существенное возрастание уровня GAPDH, при этом его глутатионилирование снижается. Таким образом, снижение уровня глутатионилирования и сульфгидрирования белков при делеции ∆lpcА коррелирует с описанным нами в предыдущем разделе уменьшением уровня персульфидов в клетках и возрастанием восстановленных групп белков. Обнаруженное снижение уровня глутатионилирования GAPDН в делеционном мутанте lpcA вносит вклад в активацию данного белка. Проведен виртуальный скрининг программой Autodock Vina в структуре седогептулозо-7-фосфат изомеразы GmhA из E.coli 2i22 (PDB code) по участкам связывания с седогептулозо-7-фосфатом, включающая остатки 52-NGGS-55, 120T, 168-AD-169, 172Q цепи B и остатки 61H, 65E, 176I, 180H цепи C структуры 2i22. Получено десять потенциальных лигандов из базы ZINC: 00640220, 03873988, 01714434, 03954011, 01630310, 03954010, 00056857, 04366948, 05546109, 16942956 для дальнейшей экспериментальной проверки. С помощью мягкой химической фиксации в градиенте плотности глицерина (GraFix) осуществлена стабилизация элонгационного комплекса РНК-полимеразы с терминационным фактором Rho. На основе новых структурных данных c помощью системы лямбда-Red рекомбинации и CRISPR/Cas9 были сконструированы прецизионные хромосомные мутации в штамме MDS42 E.coli, кодирующие делеции полипептидных петель b(105-116) и b(483-491) и домена i9 b-субъединицы РНК-полимеразы. С помощью ПЦР в реальном времени показано in vivo снижение эффективности Rho-зависимой терминации транскрипции в штаммах, в которых в b-субъединице РНК-полимеразы сделаны делеции b(483-491) и домена i9, участвующих во взаимодействии с фактором Rho. Проведено секвенирование транскриптома долгоживущих дрозофил, содержащихся в различных контрастных условиях. Сравнивая мух-долгожителей разных генотипов (E(z)/w VS w/w) между собой, также подверженных сочетанию геропротекторных факторов, мы обнаружили сильное различие (Fold change >8) в экспрессии ряда генов, некоторые из которых были описаны ранее в связи с их возможной ролью в обеспечении долгожительства у высших организмов, включая млекопитающих. Методом CRISPR получены линии D.melanogaster, содержащие одиночные и двойные делеции всех генов, участвующих в продукции активной серы (H2S). Изучено влияние этих делеций на экспрессию генома мух (транскриптомные исследования). Изучено влияние полученных делеций, а также суперэкспрессии этих генов на различные показатели жизнедеятельности дрозофилы, включая устойчивость к различным формам стресса, включая окислительный стресс, а также повышение температуры (ТШ). Изучено также влияние полученных мутаций на продолжительность жизни отдельно самцов и самок. Показано, в частности, что хотя двойные делеции по генам метаболизма серы приводят к сокращению продолжительности жизни, мухи с двойными делециями характеризуются более высокой устойчивость к окислительному стрессу (паракват). Особый интерес имеют результаты опытов, в которых исследовали действие доноров сероводорода (GYY4137) на различные показатели мух с делециями генов метаболизма серы. В частности, было показано, у самцов и самок линии с двойными делециями (BE(1-2) отмечен положительный эффект GYY4137 на продолжительность жизни (по цензурированным данным) и выживаемость в условиях гипертермии. Проведены также исследования действия доноров сероводорода на различные показатели культивируемых клеток человека, в частности, на вызванную бактериальным токсином (ЛПС) воспалительную реакцию. Оказалось, что использование доноров сероводорода оказывает защитное действие, снижая показатели воспаления (АФК, TNFa и др.). Показано, что снижение LPS-индуцированной экспрессии иммунных субъединиц протеасом под действием донора сероводорода (GYY4137) может быть важным молекулярным механизмом, обеспечивающим цитопротекторные функции доноров сероводорода. Проведен сравнительный анализ экспрессии мРНК генов каталитических субъединиц протеасом в клетках МСК, содержащихся в культуре различные периоды времени. Продемонстрировано, что старение МСК сопровождается снижением экспрессии иммунных субъединиц протеасом, что, по-видимому, влияет на функциональное состояние клеток. Созданы лентивирусные конструкции для подавления экспрессии гена CBS в клетках млекопитающих. Помимо этого созданы ретро- и лентивирусные конструкции для оверэкспресии гена MST (MPST) мыши в МСК. Созданы лентивирусные конструкции для инактивации гена MST (MPST) мыши в МСК с помощью технологии CRISPR и продемонстрирована их эффективность.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведено определение чувствительности мутанта ∆lpcA к широкому спектру антибиотиков разнообразной химической природы и различными механизмами действия. Показано, что мутанты ∆lpcA проявляют суперчувствительность к антибиотикам группы ингибиторов гиразы (налидиксовая кислота, моксифлоксацин), аминогликозидам (канамицин, гентамицин), ингибиторам синтеза белка (тетрациклин, хлорамфеникол), а также к рифампицину, ингибирующему синтез РНК. Полученные результаты позволяют заключить, что активность седогептулозо-7 фосфат изомеразы определяет устойчивость клеток E.coli к широкому спектру антибактериальных препаратов. Модулирование активности данного фермента может помочь в решении проблемы множественной лекарственной устойчивости. Проведено клонирование гена lpcA в составе экспрессионного вектора pET15b, что позволило получить ген lpcA, содержащий на N-конце последовательность His-Tag. Осуществлена экспрессия белка His-Tag-LpcA в клетках штамма E.coli BL21 и проведена очистка препаративных количеств этого белка методом афинной хроматографии на колонках Hi-Trap GE Healthcare c помощью хроматографической системы AKTA pure 150 GE. Охарактеризовано действие потенциальных ингибиторов белка LpcA (GmhA) – inh 35, inh 38, inh 39 на активность фермента. Показано, что соединения inh38 и inh39 ингибируют фермент с константами ингибирования около 10-20 мкМ. Впервые продемонстрирована т роль ионов цинка в формировании активного фермента GmhA. Оценены параметры связывания адениновых нуклеотидов и субстрата с ферментом. Установлено, что связывание субстрата – седогептулозо-7 фосфата происходит только в присутствии адениновых нуклеотидов. Показано, что соединения, inh38 и inh39, являющиеся производными продукта реакции, связываются с ферментом GmhA. В присутствии данных соединений нарушается связывание субстрата, что свидетельствует о конкурентном характере ингибирования. В опытах in vivo продемонстрировано, что соединения inh38 и inh39 усиливают токсический эффект антибиотиков налидиксовой кислоты, гентамицина и рифампицина на рост бактерий E.coli дикого типа. Продемонстрирован негативный эффект антиоксидантов глутатиона и N-ацетилцистеина на жизнеспособность нематод Caenorhabditis elegans. Показано, что добавление к газону бактерий, на котором культивируются нематоды, глутатиона и N-ацетилцистеина сокращает продолжительность их жизни на 10-15%. Построена модель предтерминационного комплекса, который включает фактор терминации Rho, общие элонгационные факторы NusA, NusG и элонгационный комплекс РНК-полимеразы. Показано, что в штаммах с делецией в beta-субъединице РНК-полимеразы участков, образующих белок-белковые взаимодействия с Rho, эффективность терминации снижена в 2.5 раза. Сделано заключение, что прямое взаимодействие РНК-полимеразы с Rho является критически важным в Rho-зависимой терминации транскрипции. А опытах in vitro показано, что NusA усиливает терминацию и вызывает сдвиг сайтов терминации дальше по ходу транскрипции. Структурная информация, подкрепленная генетическими и биохимическими данными, легла в основу новой молекулярной модели Rho-зависимой терминации транскрипции. С использованием специально сконструированных линий D.melanogaster установлено, что повсеместная конститутивная сверхэкспрессия генов контроля биосинтеза сероводорода CBS и CSE в сочетании с фармакологическим действием предшественников биосинтеза H2S N-ацетил-L-цистеинома (NAC) и цистеина приводит к суммарному геропротекторному эффекту, выраженному у самцов с избыточной экспрессией CBS, содержавшихся на питательной среде с добавлением (NAC), а также у самцов и самок со сверхэкпрессией CSE, получавших в питательной среде NAC и дополнительный цистеин. Впервые показано, что совместная кондиционная активация экспрессии генов CBS и CSE в клетках нервной системы D. melanogaster оказывает геропротекторный эффект на самцов и самок (Shaposhnikov M. et al. 2018a, Shaposhnikov M. et al. 2018b). Были проведены обширные транскриптомные исследования с использованием Illuminae технологии для изучения роли генов, участвующих в продукции активных форм серы (сероводорода-H2S), как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. В работе использовали гидросульфид натрия, характеризующийся быстрым выходом сероводорода («быстрый донор»), и искусственный компаунд GYY4137, широко используемый в исследованиях в качестве «медленного донора», а также две человеческие культуры клеток. Клетки нейронального происхождения (нейробластома SH-SY-5Y) и промоноцитарную культуру человека THP-1. Были получены транскриптомные библиотеки после воздействия ЛПС, GYY4137 и сочетанного воздействия медленного донора сероводорода GYY4137 и ЛПС, причём изучали введение донора сероводорода и до и после введения ЛПС. С использованием биоинформатических методов был проведен анализ секвенированных библиотек, что позволило описать сигнальные пути и гены, отвечающие на действие GYY4137 и ЛПС, а также на комбинированное воздействие этих двух агентов на культуру промоноцитов человека THP-1 (Yurinskaya et al., 2020). Для исследования роли сероводорода на уровне организма использовали полученные нами линии с делециями трёх основных генов, участвующих в метаболизме цистеина и отвечающих за продукцию сероводорода как у высших организмов так и бактерий (делеции по CBS, CSE и MST). Проведенный транскриптомный анализ показал, что у мух с делециями нарушена экспрессия генов участвующих в окислительно-восстановительных процессах, стресс- генов, генов, кодирующих синтез глутатиона, эффекторов TNF-a, генов, участвующих в репродукции и обонянии, а также могих других генов «клеточного хозяйства». Характерно, что максимальные отличия в экспресси от контрольной линии были обнаружены при анализе транскриптомов линий, несущих делеции гена cbs. Обнаружены значительные гендерные различия в экспрессии изучаемых генов, а также характерные различия между экспрессией в целом теле и головах мух. Некоторые гены-кандидаты, достоверно изменившие уровень экспрессии в линиях с делециями были подтверждены с помощью РТПЦР (Zatsepina et al., 2020). Проведенный анализ позволил также выявить адаптивные системы, взаимодействующие с системой генов, отвечающих за продукцию сероводорода. Охарактеризовано действие GYY4137 на общую химотрипсинподобную активность, а также специфическую активность субъединицы иммунопротеасом β5i в клетках THP-1. Показано, что при длительной инкубации GYY4137 повышает активности протеасом, однако при совместном действии с LPS общая химотрипсинподобная активность протеасом в целом и химотрипсинподобная активность иммунопротеасом в частности, снижаются. Полученные результаты, уточняют полученные на предыдущем этапе проекта данные, указывающие на дополнительный цитопротекторный механизм GYY4137, основанный на снижении экспрессии иммуннопротеасом и, как следствие, влиянии на развитие LPS-индуцированных воспалительных реакций. В дополнение к заявленному плану изучено влияние аденозинтрифосфата (АТФ) как свободного, так и в комплексе с ионами Mg2+ на активность очищенных препаратов конститутивных и иммуных 20S протеасом. Полученные результаты указывают на то, что свободный АТФ и Mg2+ разнонаправленно влияют на деградацию различных субстратов 20S протеасомами, вероятно, в зависимости от их размера и заряда. Кроме того, в клетках может существовать механизм регуляции активности протеасом, основанный на балансе между свободным АТФ и Mg2+. Продемонстрировано, что оверэкспрессия гена MST в мезенхимальных стволовых клетках мыши (МСК) имеет небольшой позитивный эффект на скорость пролиферации и число пройденных популяционных удвоений в условиях гипоксии, в то время как оверэкспрессия гена CBS более существенно увеличивала это число, а также привела к увеличению предельного времени существования МСК в культуре, что можно рассматривать как торможение старения этих клеток in vitro. Эффекты замедления старения МСК под действием оверэкспрессии этих генов были заметно более выражены в условиях нормоксии, что свидетельствует в пользу того, что повышенная экспрессия CBS и MST способствует повышению устойчивости МСК мыши к окислительному стрессу.