Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют полимерные эндопротезы для регенерации тканей стенки кишечника. Но до недавнего времени регенеративная медицина желудочно-кишечного тракта (или ЖКТ) развивалась практически без учета воздействия на восстановление тканей того же кишечника бактерий микрофлоры (или правильнее микробиоты), плотно населяющих этот орган. Точнее отношение к бактериям микрофлоры ЖКТ было традиционным – их необходимо было сразу уничтожить, причем, все без различия, потому что довлеющая в медицине парадигма, выработанная в эру антибиотиков, считала все бактерии нашими врагами. И долгое время в силу этой же парадигмы исследования в области хронических воспалительных заболеваний ЖКТ и регенерации его тканей были направлены преимущественно на выявление патогенных свойств бактерий, его населяющих. А успешное применение антибиотиков лишь укрепляло точку зрения, что взаимодействие бактерий с человеком носит, в основном, негативный характер. Должен был произойти существенный переворот в сознании, чтобы бактерии перестали восприниматься исключительно как враги. Однако появление феномена лекарственной устойчивости патогенных бактерий к антибиотикам, а затем быстрое разрастание и усугубление этой проблемы, история успешного применения пробиотиков (т.е. живых «полезных» бактерий) для лечения заболеваний ЖК-тракта и многих других болезней, примеры успешной трансплантации тканей кишечника без их дезинфекции (что обязательно практиковалось раньше), а также развитие молекулярной техники анализа состава микробиоты человека существенно обогатила копилку наших знаний о роли бактерий микробиоты в нашей жизни. Стало очевидным, насколько важны функции микробиоты ЖКТ для здоровья человека. Это «забытый орган», изучение которого теперь требует пристального внимания научной общественности, в частности, требуется другой подход для изучения повреждения и регенерации тканей ЖКТ при различных заболеваниях. Выяснилось, что микробиота критически важна для нормального функционирования иммунной системы, активирует и поддерживает иммунитет, вследствие этого регулирует воспалительные процессы, а нарушение состава микробиоты ЖКТ и кожи, прежде всего, из-за терапии антибиотиками и антибактериальными препаратами, напротив, как раз и могут вызывать различные заболевания. Оказалось, что бактерии нормальной микробиоты способны подавлять рост бактерий, характерных для труднозаживающих ран и язв, активно замещать в поврежденной области патогенные бактерии, и тем самым ускорять процессы регенерации тканей ЖКТ, прежде всего, кишечника и, более того, напрямую способствовать регенерации тканей. Но, к сожалению, исследований терапевтического воздействия пробиотических бактерий на процессы заживления повреждений стенки кишечника, особенно при его протезировании, мало. Это связано, в частности, с недостаточным развитием экспериментальных инструментов и моделей для исследования этой проблемы. С это целью в данном Проекте мы решили совместить две концепции – разработку экспериментального инструмента для изучения роли пробиотических бактерий для регенерации тканей кишечника и параллельно прототипа медицинского изделия для регенерации тканей кишечника на основе пробиотиков. Т.е. мы создаем химерную (состоящую из живых клеток и биоматериалов) конструкцию для регенерации тканей, где в качестве активного компонента используются не лекарственные вещества и терапевтические белки, как в некоторых медицинских изделиях, и не клетки человека и млекопитающих, как в тканеинженерных конструкциях, а пробиотические бактерии. Но как заставить эти бактерии жить и размножаться в такой искусственной конструкции? И тогда мы обратили свое внимание на те самые патогенные бактерии, с которыми так до сих пор не научились как следует бороться, как раз благодаря наличию у них способности образовывать особую природную конструкцию – т.н. биопленку или биофильм, которая защищает эти бактерии от различных неблагоприятных воздействий, используя окружающие биоматериалы или синтезируя свои собственные полимеры. Примером такой бактерии является Pseudomonas aeruginosa, вызывающая опасное инфекционное поражение эпителия легких, ведущее к фиброзу легких и смерти пациента. Эти бактерии образуют биопленку, используя в качестве связующего вещества синтезируемые ими экзополисахариды альгинаты, образующие гидрогель, которые благодаря своим уникальным свойствам обеспечивают высокую жизнеспособность, а значит и патогенные свойства, а также защищают их от воздействия антибиотиков, чем и вызвана низкая эффективность лечения этого инфекционного заболевания химиотерапией. Почему бы не использовать этот природный инструмент? Но уже для «полезных» пробиотических бактерий. Так нами была изобретена химерная конструкция, которую мы назвали «биоинженерный биофильм», где в качестве клеток используются пробиотические бактерии, а среду для локального поддержания их жизнеспособности и роста обеспечивает полимерная конструкция особого строения, выполняющая роль локального биореактора, а также модельной системы для исследования действия различных веществ на микроорганизмы, например, антибиотиков. В более частном случае под биоинженерным биофильмом мы понимаем также прототип медицинского изделия, в котором действующей лекарственной основой являются пробиотические бактерии, а полимерная конструкция, в которую они заключены, может обеспечивать локальное поддержание их жизнеспособности и роста не только в модельных условиях in vitro, но и in situ при имплантации этого изделия и протезирования стенки кишечника для регенерации ее повреждений. С этой целью на первом этапе Проекта мы взяли безвредные почвенные бактерии рода Azotobacter, единственные в природе помимо Pseudomonas sp. способные к синтезу бактериального альгината, отобрали из них наиболее эффективный штамм-продуцент альгинатов A. agile 12, разработали технологию биосинтеза, выделения и очистки этого экзополисахарида и получили альгинаты с заданными свойствами. Исследовали их физико-химические свойства и показали, что полученные бактериальные альгинаты по своим наиболее важным физико-химическим свойствам, таким как термоустойчивость, водопоглощение, кинематическая вязкость, механические свойства превосходят традиционно используемый водорослевый альгинат, что может придать лучшие защитные свойства биоинженерному биофильму на его основе для инкапсулированных в него пробиотических бактерий. Полученные результаты позволяют в качестве одного из «побочных» результатов Проекта в дальнейшем впервые разработать биосинтетический способ промышленного получения бактериального альгината. Но из одного лишь альгинатного гидрогеля практически невозможно изготовить изделие для протезирования стенки кишечника или закрытия дефектов ткани. Поэтому на этом этапе мы разработали каркасную конструкцию в виде полимерного трубчатого эндопротеза полых органов (в частности, кишки), имеющую слой из пористых полимерных микросфер, которые и были заполнены гидрогелем на основе полученного бактериального альгината. Эта сложная композиционная конструкция и будет служить «домом» для пробиотических бактерий. В качестве материала для каркаса и пористого слоя трубки-эндопротеза был использован поли-3-оксибутират и его сополимер с 3-оксивалератом, это другие биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, получаемые путем биосинтеза бактериями из того же самого рода Azotobacter. Были получены эти полимеры с заданными свойствами, исследованы их физико-химические свойства, исходя из их анализа, были отобраны полимеры для изготовления каркаса конструкции, был разработан дизайн конструкции, разработана многостадийная методика ее изготовления, исследована ее морфология, получены образцы конструкции для создания биоинженерного биофильма. Фактически даже без использования пробиотических бактерий или лекарственных веществ, что планируется на следующем этапе, была разработана конструкция для протезирования кишечника и закрытия дефектов его тканей. Наконец, на этом этапе была отработана микробиологическая методика культивирования пробиотических бактерий из родов Lactobacillus и Bifidobacterium, для которых известно, что они обладают антагонистической активностью, т.е. способны активно замещать в поврежденной области слизистой бактерии других видов, в т.ч. патогенные. Эти бактерии предполагается использовать в дальнейшем в качестве активно действующих агентов создаваемого биоинженерного биофильма. Как можно увидеть даже по 1-ому этапу, Проект построен таким образом, чтобы помимо главной цели – создания биоинженерного биофильма, достигались «побочные», но не менее важные задачи на других уровнях: разработка технологии биосинтеза бактериальных альгинатов и изготовление полимерной конструкции для протезирования стенки кишечника и ее регенерации. Таким образом, данный Проект является ярко выраженным междисциплинарным биоинженерным исследованием с активным применением биомиметического подхода, где решаются как фундаментальные, так и прикладные научные проблемы. Информация о Проекте размещена на сайте http://www.biopolymers.pro/content3.php и будет в дальнейшем на этом информационном ресурсе обновляться.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют полимерные эндопротезы для регенерации тканей стенки кишечника. Но до недавнего времени регенеративная медицина желудочно-кишечного тракта (или ЖКТ) развивалась практически без учета воздействия на восстановление тканей того же кишечника бактерий микрофлоры (или правильнее микробиоты), плотно населяющих этот орган. Тогда как бактерии нормальной микробиоты способны подавлять рост бактерий, характерных для труднозаживающих ран и язв, активно замещать в поврежденной области патогенные бактерии, и тем самым ускорять процессы регенерации тканей ЖКТ, прежде всего, кишечника и, более того, напрямую способствовать регенерации тканей. Но, к сожалению, исследований терапевтического воздействия пробиотических бактерий на процессы заживления повреждений стенки кишечника, особенно при его протезировании, мало. Это связано, в частности, с недостаточным развитием экспериментальных инструментов и моделей для исследования этой проблемы. С это целью в данном Проекте мы решили совместить две концепции – разработку экспериментального инструмента для изучения роли пробиотических бактерий для регенерации тканей кишечника и параллельно прототипа медицинского изделия для регенерации тканей кишечника на основе пробиотиков. Т.е. мы создаем химерную (состоящую из живых клеток и биоматериалов) конструкцию для регенерации тканей, где в качестве активного компонента используются не лекарственные вещества и терапевтические белки (хотя их мы тоже используем), как в некоторых медицинских изделиях, и не клетки человека и млекопитающих (и это тоже входит в наши планы), как в тканеинженерных конструкциях, а пробиотические бактерии. Но как заставить эти бактерии жить и размножаться в такой искусственной конструкции? И тогда мы обратили свое внимание на те самые патогенные бактерии, с которыми так до сих пор не научились как следует бороться, как раз благодаря наличию у них способности образовывать особую природную конструкцию – т.н. биопленку или биофильм, которая защищает эти бактерии от различных неблагоприятных воздействий, используя окружающие биоматериалы или синтезируя свои собственные полимеры. Примером такой бактерии является Pseudomonas aeruginosa, вызывающая опасное инфекционное поражение эпителия легких, ведущее к фиброзу легких и смерти пациента. Эти бактерии образуют биопленку, используя в качестве связующего вещества синтезируемые ими экзополисахариды альгинаты, образующие гидрогель, которые благодаря своим уникальным свойствам обеспечивают высокую жизнеспособность, а значит и патогенные свойства, а также защищают их от воздействия антибиотиков, чем и вызвана низкая эффективность лечения этого инфекционного заболевания химиотерапией. Почему бы не использовать этот природный инструмент? Но уже для «полезных» пробиотических бактерий. Так нами была изобретена химерная конструкция, которую мы назвали «биоинженерный биофильм», где в качестве клеток используются пробиотические бактерии, а среду для локального поддержания их жизнеспособности и роста обеспечивает полимерная конструкция особого строения, выполняющая роль локального биореактора, а также модельной системы для исследования действия различных веществ на микроорганизмы, например, антибиотиков. В более частном случае под биоинженерным биофильмом мы понимаем также прототип медицинского изделия, в котором действующей лекарственной основой являются пробиотические бактерии, а полимерная конструкция, в которую они заключены, может обеспечивать локальное поддержание их жизнеспособности и роста не только в модельных условиях in vitro, но и in situ при имплантации этого изделия и протезирования стенки кишечника для регенерации ее повреждений. Для последующего патентования на этом этапе Проекта были созданы результаты интеллектуальной деятельности ««Биоинженерная конструкция на основе бактериального альгината и пробиотических бактерий и способ ее получения». На втором этапе Проекта для разработки биоинженерного биофильмы мы отработали основные технологические приемы этой многоуровневой задачи. Сначала нам нужно было каким-то образом поместить пробиотические бактерии в гидрогель на основе бактериального альгината, полученного нами по разработанной ранее на первом этапе технологии биосинтеза этого полимера с использованием штамма-продуцента Azotobacter agile 12. В качестве пробиотических бактерий мы выбрали коммерчески доступные культуры лактобактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3 и бифидобактерий Bifidobacterium longum MC-42. Начав с попыток механически инкапсулировать эти бактерии в альгинат, мы в скором времени обнаружили, что бактерии замечательным образом могут расти в 1% альгинате как водорослевом, так и бактериальном, разумеется, если его смешать с культуральной средой, содержащей все необходимые вещества для их роста. Растут они в альгинате как в стандартной полужидкой среде, которая становится таковой благодаря наличию в ней агар-агара. Т.е. замена агар-агара альгинатом позволяет бактериям расти на такой среде с такой же эффективностью. Бактерии росли в бактериальном альгинате равномерно по всему объему, а лактобактерии в водорослевом альгинате образовывали осадок. Отработав эту методику, мы добились высоких значений содержания бактерий в бактериальном альгинате. Рост бактерий в альгинатном гидрогеле мы еще изучали, поместив их в шарики из альгинатного гидрогеля, а шарики, в свою очередь, поместив в стандартную полутвердую среду. Оказалось, что бактерии полностью заселяли эти альгинатные шарики. Мы исследовали также, как влияет рост бактерий в альгинате на его механические и иные физико-химические свойства. Оказалось, что пробиотические бактерии, особенно лактобактерии, в процессе своего роста разрушают водорослевый альгинат, что приводит к снижению молекулярной массы, изменению химического состава, ухудшению механических свойств и термической устойчивости этого полимера. Бактериальный же альгинат, вероятно, благодаря высокому уровню ацетилирования оказался гораздо более устойчив к воздействию как лактобактерий, так и бифидобактерий, что делает его удобной и безопасной средой обитания для пробиотических бактерий. Полученные нами данные раскрывают фундаментальную роль бактериального альгината и устанавливают связь между особенностями химического строения этого биополимера и его функциональностью в природе, в частности, по отношению к бактериям микробиоты человека. Затем мы решили выяснить, а как будут расти бактерии в альгинате, если туда добавить антибиотики левофлоксацин, пеннициллин и стрептомицин и антибактериальный белок лизоцим. Мы заполнили стеклянные трубочки антибиотиками или лизоцимом в высокой концентрации и поместили их в бактериальный альгинат, где росли бактерии. Оказалось, что бактериальный альгинат надежно защищает бактерии от воздействия на них как низкомолекулярных, так и высокомолекулярного антибактериальных веществ, к примеру, бифидобактерии росли даже на концах этих трубочек, заполненных лизоцимом, хотя были чувствительны к нему. Полученные результаты помимо основной цели по созданию биоинженерного биофильма позволяют в дальнейшем разработать новый лекарственный препарат-пробиотик, способ изготовления и характеристики которого были заявлены в полученных РИД. Одновременно с экспериментами по изучению роста пробиотических бактерий в бактериальном альгинате мы продолжали совершенствовать нашу полимерную конструкцию, которая представляет собой полимерный эндопротез в виде трубки или пластины, поверхности которых имеют слой из пористых полимерных микросфер, которые заполняют гидрогелем на основе полученного бактериального альгината. Эта сложная композиционная конструкция и будет служить «домом» для пробиотических бактерий. Здесь мы также использовали антибактериальные вещества левофлоксацин и лизоцим, но уже для получения того типа конструкции, которая будет обладать, напротив, антибактериальной активностью. Используя оригинальные методики инкапсулирования различных веществ в полимерные конструкции мы загрузили левофлоксацин и лизоцим в разработанную нами полимерную конструкцию для биоинженерного биофильма и добились пролонгированного в течение нескольких недель высвобождения этих антибактериальных веществ. Антибактериальное действие такой конструкции, заполненной бактериальным гидрогелем, который содержит пробиотические бактерии, будет направлено вовне, и она сможет подавлять рост патогенных бактерий в области имплантации этого изделия, тогда как сами пробиотические бактерии будут надежно защищены гидрогелем на основе бактериального альгината. Затем нам надо было разработать модель повреждения стенки кишечника, чтобы в дальнейшем с ее помощью исследовать, каким образом пробиотические бактерии воздействуют на процесс регенерации тканей стенки кишечника, действительно ли они способны стимулировать восстановление тканей. Эту сложную хирургическую методику на лабораторных крысах нам пришлось разрабатывать практически с нуля, что потребовало много усилий и времени. Мы использовали профессиональный набор хирургических инструментов, в том числе адаптированных для данных целей (доработанных зажимов Кохера с помощью ватных валиков, использования миниатюрных глазных ножниц для разреза стенки кишечника у крысы), способа механохимического моделирования повреждения слизистой стенки кишечника, наложения модифицированного сквозного перекрестного шва Ламбера – специализированного для хирургических операций на кишечнике и адаптированного для крыс. Это позволило смоделировать дефект стенки кишечника на разных сроках (3, 7, 14 сут.) с обеспечением высокой выживаемости крыс без применения системного введения антибиотиков, что потребовало очень хорошей техники хирургии. Эта методика позволяет имплантировать в область дефекта полимерные конструкции в виде пластины или трубки длиной до 20 мм и диаметром (или шириной) до 5 мм с надежной их фиксацией по месту. Мы также отработали методику отбора образцов тканей (фрагментов стенки толстого кишечника) для гистологического исследования и микробиоты (образцов фекалий и соскобов со слизистой стенки толстого кишечника) для генетического исследования состава микробиоты в месте повреждения стенки кишечника. Такая новая методика помимо основной цели Проекта позволяет тестировать различные медицинские изделия, предназначенные для протезирования тканей толстого кишечника. Наконец, нами были проведены дополнительные исследования (не запланированные первоначально в Заявке) по исследованию биосовместимости полимерной конструкции и цитотоксичности бактериального альгината на культурах фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток in vitro. Результаты этих исследований продемонстрировали высокую биосовместимость разработанной полимерной конструкции для биоинженерного биофильма и возможность использования этого изделия для различных биомедицинских исследований, а разработанная нами ранее методика очистки бактериальных капсулярных альгинатов благодаря удовлетворительному уровню цитотоксичности уже позволяет использовать его в экспериментальной биомедицине. Таким образом, Проект построен таким образом, чтобы помимо главной цели – создания биоинженерного биофильма, достигались «побочные», но не менее важные задачи на других уровнях: разработка препарата-пробиотика на основе бактериального альгината, изготовление полимерной конструкции для протезирования стенки кишечника с пролонгированной лекарственной активностью, разработка хирургической методики для тестирования медицинских изделий, предназначенных для протезирования кишечника. На этом этапе особенно ярко видна междисциплинарность Проекта: исследования ведутся одновременно в следующих научных областях с использованием специфических для этих областей набором методов: микробиологии, полимерной химии, физической химии, фармакологии, клеточной биологии, экспериментальной хирургии, генетики. И такое построение научно-исследовательской работы имеет не только прикладное значение, но и фундаментальную роль, т.к. позволяет создавать на стыке различных дисциплин новые данные, подходы и идеи. Таким образом, данный Проект является ярко выраженным междисциплинарным биоинженерным исследованием с активным применением биомиметического подхода, где решаются как фундаментальные, так и прикладные научные проблемы. Информация о Проекте размещена на сайте http://www.biopolymers.pro/content3.php и будет в дальнейшем на этом информационном ресурсе обновляться.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют полимерные эндопротезы для регенерации тканей стенки кишечника. Но до недавнего времени регенеративная медицина желудочно-кишечного тракта (или ЖКТ) развивалась практически без учета воздействия на восстановление тканей того же кишечника бактерий микрофлоры (или правильнее микробиоты), плотно населяющих этот орган. Тогда как бактерии нормальной микробиоты способны подавлять рост бактерий, характерных для труднозаживающих ран и язв, активно замещать в поврежденной области патогенные бактерии, и тем самым ускорять процессы регенерации тканей ЖКТ, прежде всего, кишечника и, более того, напрямую способствовать регенерации тканей. Но, к сожалению, исследований терапевтического воздействия пробиотических бактерий на процессы заживления повреждений стенки кишечника, особенно при его протезировании, мало. Это связано, в частности, с недостаточным развитием экспериментальных инструментов и моделей для исследования этой проблемы. С это целью в данном Проекте мы решили совместить две концепции – разработку экспериментального инструмента для изучения роли пробиотических бактерий для регенерации тканей кишечника и параллельно прототипа медицинского изделия для регенерации тканей кишечника на основе пробиотиков. Т.е. мы создаем химерную (состоящую из живых клеток и биоматериалов) конструкцию для регенерации тканей, где в качестве активного компонента используются не лекарственные вещества и терапевтические белки (хотя их мы тоже используем), как в некоторых медицинских изделиях, и не клетки человека и млекопитающих (и это тоже входит в наши планы), как в тканеинженерных конструкциях, а пробиотические бактерии. Но как заставить эти бактерии жить и размножаться в такой искусственной конструкции? И тогда мы обратили свое внимание на те самые патогенные бактерии, с которыми так до сих пор не научились как следует бороться, как раз благодаря наличию у них способности образовывать особую природную конструкцию – т.н. биопленку или биофильм, которая защищает эти бактерии от различных неблагоприятных воздействий, используя окружающие биоматериалы или синтезируя свои собственные полимеры. Примером такой бактерии является Pseudomonas aeruginosa, вызывающая опасное инфекционное поражение эпителия легких, ведущее к фиброзу легких и смерти пациента. Эти бактерии образуют биопленку, используя в качестве связующего вещества синтезируемые ими экзополисахариды альгинаты, образующие гидрогель, которые благодаря своим уникальным свойствам обеспечивают высокую жизнеспособность, а значит и патогенные свойства, а также защищают их от воздействия антибиотиков, чем и вызвана низкая эффективность лечения этого инфекционного заболевания химиотерапией. Почему бы не использовать этот природный инструмент? Но уже для «полезных» пробиотических бактерий. Так нами была изобретена химерная конструкция, которую мы назвали «биоинженерный биофильм», где в качестве клеток используются пробиотические бактерии, а среду для локального поддержания их жизнеспособности и роста обеспечивает полимерная конструкция особого строения, выполняющая роль локального биореактора, а также модельной системы для исследования действия различных веществ на микроорганизмы, например, антибиотиков. В более частном случае под биоинженерным биофильмом мы понимаем также прототип медицинского изделия, в котором действующей лекарственной основой являются пробиотические бактерии, а полимерная конструкция, в которую они заключены, может обеспечивать локальное поддержание их жизнеспособности и роста не только в модельных условиях in vitro, но и in situ при имплантации этого изделия и протезирования стенки кишечника для регенерации ее повреждений. Для патентования этого изобретения были поданы 2 заявки на российские патенты «Полимерный материал (гидрогель) на основе бактериального альгината для размещения пробиотических бактерий и способ его получения» и «Биоинженерная конструкция на основе бактериального альгината и пробиотических бактерий и способ ее получения». Проект построен таким образом, чтобы помимо главной цели – создания биоинженерного биофильма, достигались «побочные», но не менее важные задачи на других уровнях: разработка препарата-пробиотика на основе бактериального альгината, изготовление полимерной конструкции для протезирования стенки кишечника с пролонгированной лекарственной активностью, разработка хирургической методики для тестирования медицинских изделий, предназначенных для протезирования кишечника. На заключительном этапе особенно ярко видна междисциплинарность Проекта: исследования ведутся одновременно в следующих научных областях с использованием специфических для этих областей набором методов: микробиологии, полимерной химии, физической химии, фармакологии, клеточной биологии, экспериментальной хирургии, генетики. Таким образом, данный Проект является ярко выраженным междисциплинарным биоинженерным исследованием с активным применением биомиметического подхода, где решаются как фундаментальные, так и прикладные научные проблемы. На третьем заключительном этапе Проекта нами был разработан биоинженерный биофильм и исследована его эффективность для регенерации тканей стенки кишечника. На основании результатов, полученных в ходе выполнения всего проекта, нами было разработано биомиметическое химерное устройство - биоинженерный биофильм. Комплексная методика его получения включает следующие основные стадии: получение методом контролируемого микробиологического биосинтеза бактериального альгината, служащего субстратом для обеспечения жизнеспособности пробиотических бактерий; получение конструкции из бактериальных поли-3-оксибутирата и его сополимера с 3-оксивалератом, состоящей из пористой подложке с слоем прикрепленных к ней пористых микросфер размером 5 на 15 мм; выращивание пробиотических бактерий Lactobacillus plantarum в полученном 1% бактериальном альгинате, смешанным с культуральной питательной средой, как на полужидкой среде; заполнение пористой конструкции раствором бактериального альгината натрия, содержащего пробиотические бактерии и его желирование. Разработанное устройство позволяло как в симуляционной среде толстого кишечника in vitro, так и при его имплантации в условиях внутренней среды толстого кишечника in vivo обеспечивать выживаемость изначально выращенных в нем лактобактерий. Более того, разработанная композитная полимерная конструкция позволяет выращивать в ней не только пробиотические бактерии, но и мезенхимальные стволовые клетки, которые широко используются в тканевой инженерии. Мы показали, что композитная конструкция поддерживает рост стволовых клеток при сохранении их фенотипа в течение двух недель, что позволяет создавать химерные конструкции другого типа, где в качестве активного компонента для регенерации различных тканей используют эти стволовые клетки, а также создает предпосылки для создания комбинированных химерных систем для сокультивирования пробиотических бактерий и клеток млекопитающих, прежде всего, стволовых. Для исследования способности разработанного устройства влиять на поврежденные ткани мы использовали сочетание гистологических методов и 16S метагеномного анализа локального состава микробиоты в области повреждения тканей на разработанной экспериментальной модели дефекта стенки толстого кишечника с разрезом, химически-механическим повреждением слизистой и наложением швов. Моделирование дефекта стенки толстого кишечника приводило к развитию сильно выраженного воспалительного процесса, который сопровождался атрофией и изъязвлением слизистой, а также драматическому нарушению нормальной структуры микробиоты в этой области кишечника с резким повышением численности потенциально патогенных бактерий, таких как из родов Enterococcus, Klebsiella, Streptococcus, семейства Clostridiaceae и Erysipelotrichaceae. Использование композитной конструкции в качестве кишечной заплаты композитной полимерной конструкции без бактерий хотя и не привело к восстановлению дефекта стенки кишечника, но позволило снизить выраженность воспалительного процесса и атрофию слизистой в месте нанесения повреждения тканей. При этом происходило, с одной стороны, частичное восстановление состава нормальной микробиоты, а, с другой стороны, значительное возрастание или падение численности некоторых бактериальных родов и семейств, таких как Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae, Christensenellaceae, Lachnoclostridium, Faecalibaculum, Klebsiella, Turicibacter, Lactobacillus. Использование композитной полимерной конструкции, загруженной антибактериальными веществами, левофлоксацином и лизоцимом, не привело к восстановлению дефекта стенки кишечника, снижению воспалительной реакции в области повреждения тканей и к улучшению восстановления нормального состава микробиоты в области дефекта тканей. Заселение композитной полимерной конструкции пробиотическими бактериями Lactobacillus plantarum также оказывало большое воздействие как на ткани стенки кишечника, так и на локальный состав микробиоты в области смоделированного дефекта. Происходило снижение воспалительного процесса и атрофии слизистой в месте нанесения повреждения тканей, процесс регенерации проходил значительно лучше, чем в случае имплантации безбактериальной композитной полимерной конструкции. При этом происходил плотный контакт устройства со слизистой и частичное врастание в нее, а все его микросферы были плотно заселены бактериями. Влияние биоинженерного биофильма на локальную микробиоту в области повреждения стенки кишечника выражалось в повышении относительной численности бактерий рода Ileibacterium и в полном или частичном восстановлении относительной численности бактерий различных групп, наблюдаемой у здоровых животных: Lachnospiraceae, Erysipelotrichaceae, Christensenellaceae, Clostridiales, Bacteroides, Lachnoclostridium, Turicibacter, Faecalibaculum, Klebsiella, которое не достигалось при имплантации композитной конструкции, не засеянных пробиотическими бактериями. Это в совокупности с данными как о способности бактериального альгината поддерживать жизнеспособность лактобактерий в модельных условиях in vitro, так и о повышенном содержании лактобактерий в устройстве, помещенном во внутреннюю среду толстого кишечника in vivo, свидетельствует о том, что для лактобактерий разработанное нами устройство является достаточно хорошей средой обитания в условиях внутренней среды толстого кишечника, и они продолжают успешно в ней расти, оказывая значительное влияние на окружающее пространство, предположительно, благодаря своей антагонистической активности. Таким образом, нами впервые создан биоинженерный биофильм – мини-биореактор, в котором бактериальные полимеры долговременно поддерживают жизнеспособность введенных извне пробиотических бактерий в жестких условиях внутренней среды толстого кишечника, что позволяет оказывать выраженное воздействие на локальную микробиоту кишечника. Научно-технологический задел этого проекта открывает целое направление по созданию интеллектуальных высокотехнологичных биоустройств, предназначенных для функционирования в кишечнике, для регенерации тканей, иммуномодуляции, регуляции состава микробиоты, биосинтеза биоактивных веществ, пролонгированной доставки лекарств, диагностики и моделирования различных заболеваний.