Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Апоптоз играет важную роль в жизни многоклеточных организмов, являясь естественным механизмом запрограммированной гибели клеток. Нарушения нормального течения процесса апоптоза приводят к развитию многих патологий. Так, подавление апоптоза в раковых клетках – одна из причин онкологических заболеваний. Запуск апоптоза на самых ранних стадиях развития процесса обусловлен реакциями пероксидации липидов в мембране митохондрий, которые катализируются белково-липидным комплексом цитохрома с с митохондриальным фосфолипидом кардиолипином. Знание структуры, условий образования и механизма каталитической активности комплекса цитохром с/кардиолипин может дать информацию для управления реакциями пероксидации липидов в мембране митохондрий, что позволит запускать апоптоз в раковых клетках. В данной работе для изучения структуры комплекса мы использовали спектральные методы, а для изучения его каталитической активности —хемилюминесцентные методы и метод математического моделирования. 1. Было проведено исследование структурных изменений в молекуле цитохрома с при образовании комплекса цитохром с/кардиолипин (Цит-КЛ), находящегося в гидрофобной среде, имитирующей липидный слой митохондриальной мембраны. Для этого комплекс Цит-КЛ был приготовлен в водной среде, а затем переведен в хлороформ-метанольную фракцию. В растворе комплекса Цит-КЛ в гексане (полученного после выпаривания растворителя из хлороформной фракции) с помощью метода спектрофотомерии (по поглощению при 699 нм, соответствующему координационной железосерной связи между гемовым железом и серой метионина Met80) установлено, что в растворе комплекса Цит-КЛ в гидрофобной среде указанная железосерная связь разрушена (полоса поглощения в области 699 нм отсутствует). Известно, что в классических пероксидазах (пероксидаза из корней хрена, микропероксидаза) связь гемового железа с метионином Met80 отсутствует, что дает возможность сближения субстратов пероксидазных реакций с активным центром пероксидаз. В свободном цитохроме с все 6 коордиционных связей железа заняты и поэтому белок практически не обладает каталитической активностью пероксидазы. Таким образом, за счет разрушения в цитохроме с связи между железом гема и метионином Met80 комплекс Цит-КЛ может приобретать ферментативную активность. Параллельно проводились спекткрофлуориметрические исследования раствора комплекса Цит-КЛ в гидрофобной среде. Появление в растворе комплекса Цит-КЛ в гексане характерной для остатков тирозина (с максимумом при 305 нм) и триптофана (с максимумом при 330 нм) флуоресценции, не проявляющейся в водном растворе цитохрома с, говорит о том, что расстояние между остатками тирозинов и триптофана внутри глобулы цитохрома с в составе комплекса Цит-КЛ, помещенного в гидрофобную среду, увеличено относительно глобулы цитохрома с в нативном состоянии. Полученные в ходе спектрофотометрического и спектрофлуориметрического анализа результаты позволяют сделать вывод о том, что цитохром с в составе комплекса Цит-КЛ, растворимого в гидрофобном растворителе, находится в частично расплавленном состоянии. 2. Методом динамического светорассеяния были получены данные, которые позволили подтвердить ранее предложенную гипотезу о строении комплекса Цит-КЛ (наносфера, состоящая из цитохрома с, окруженного слоем кардиолипина) и возможности существования такой частицы в толще липидного бислоя митохондриальных мембран. Для этого из цитохрома с (Цит С) и тетраолеилкардиолипина (ТОКЛ), взятых в молярном соотношении 1:30 был получен комплекс Цит-КЛ в водно-метанольной смеси и затем переведен в хлороформ-метанольную фазу, в которой был измерен размер частиц. Анализ распределения частиц по размерам в этой пробе позволил выявить три основных группы частиц: с диаметрами 4,7±0,7 нм, 7,8±1,0 нм и 12,1±1,4 нм. Эти частицы, вероятно, являются 1) отдельными молекулами ЦитС с конформацией частично расплавленной глобулы (4,7±0,7 нм), на поверхности которых экспонированы дополнительные гидрофобные участки, обеспечивающие возможность их растворения в такой гидрофобной среде, как хлороформ, и 2) молекулами ЦитС, покрытыми липидным слоем (12,1±1,4 нм, и 7,8±1,0 нм), т.е. наносферами Цит-КЛ. В пользу строения комплекса Цит-КЛ, подразумевающего наличие глобулы ЦитС, окруженной слоем кардиолипина, говорит факт соответствия наблюдаемых в растворе размеров частиц и расчетных размеров такой гипотетической частицы. 3. С помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния было проведено исследование размеров частиц в микрокристаллическом осадке комплекса Цит-КЛ. Измерения проводили в осадке, который получали при смешивании раствора цитохрома с (10-30 мг/мл) в фосфатном буферном растворе и тетраолеилкардиолипина в растворе метанола, взятых в молярном соотношении 1:30. Размер частиц, оцененный методом малоуглового рентгеновского рассеяния (8,07±0,07 и 11,13±0,04 нм) для микрокристаллического осадка Цит-КЛ, соответствует диаметрам двух основных групп частиц, обнаруженных в растворе Цит-КЛ в неполярной среде (7,8±1,0 нм и 12,1±1,4) с помощью метода динамического светорассеяния (пункт 2). Было проведено исследование влияния режима кристаллизации на размер частиц комплекса в микрокристалле. По-видимому, при образовании частиц разного размера значительную роль играет рН среды: частицы меньшего размера образовывались преимущественно при низких значениях рН (меньше 5), а большего – при более высоких (больше 7). Таким образом, меняя режим кристаллизации, можно получить частицы комплекса с различным диаметром, и, в соответствии с проведенным расчетами и ранее полученными данными, различным количеством молекул липида, приходящихся на одну молекулу ЦитС. Эти результаты представляют большую важность при составлении протокола получения препарата Цит-КЛ с определенными характеристиками, обладающего наилучшими проапоптогенными и антиканцерогенными свойствами, поскольку частицы разного диаметра могут иметь различную эффективность. 4. Измерения кинетики хемилюминесценции с применением математического моделирования позволили верифицировать схему реакций пероксидазного цикла, катализируемых комплексом Цит-КЛ в водной среде, а также определить константы скоростей основных реакций цикла в этих двух случаях. Хемилюминесценцию регистрировали в водном растворе Цит-КЛ, к которому добавляли раствор люминола качестве активатора хемилюминесценции и пероксид водорода. В результате экспериментов и математического моделирования была предложена следующая схема реакций и подобраны соответствующие константы скоростей для водных растворов: H2O2 + CytCL → С1 k1 = 3,0×10^3 M^(-1)×сек^(-1) (1) С1 + Lm → Lm• + C2 k2 = 1,0×10^5 M^(-1)×сек^(-1) (2) С2 + Lm → Lm• + CytCL k3 = 1,0×10^5 M^(-1)×сек^(-1) (3) Lm• + H2O2 → P k4 = 3,0×10^5 M^(-1)×сек^(-1) (4), где СytCL – Цит-КЛ; С1, С2 – продукты одноэлектронного и двухэлектронного восстановления ЦитС в составе Цит-КЛ, соответственно; Lm и Lm• - люминол и радикал люминола, соответственно; P – продукт в электронно-возбужденном состоянии, образование которого приводит к появлению хемилюминесценции. Была измерена кинетика активированной люминолом хемилюминесценции в присутствии хлороформного раствора Цит-КЛ, субстрата окисления (природного кардиолипина) и пероксида водорода. Наблюдаемое свечение является результатом суперпозиции двух эффектов люминола: 1) его окисления в качестве субстрата пероксидазной реакции и 2) его действия в качестве физического сенсибилизатора хемилюминесценции, связанной с липидной пероксидацией. Математическое моделирование в такой системе оказалось невозможным из-за отсутствия информации о квантовых выходах хемилюминесценции при этих двух реакциях. 5. Исследования кинетики липопероксидазных реакций в присутствии активатора хемилюминесценции кумарина, катализируемых комплексом Цит-КЛ в водной среде и в гидрофобном растворе, позволили уточнить схему липопероксидазных реакций, катализируемых комплексом Цит-КЛ в водной среде и в гидрофобной среде, а также определить константы скоростей основных реакций в этих двух случаях. Хемилюминесценцию регистрировали в водном растворе Цит-КЛ, к которому добавляли раствор природного кардиолипина в качестве субстрата пероксидазной реакции, кумарин с-525 в качестве физического активатора хемилюминесценции и пероксид водорода. В результате экспериментов и математического моделирования была предложена следующая схема реакций: H2O2 + CytCL → С2 (5) С2 + L → CytCL + L• (6) L• + L• → P (7) где СytCL – Цит-КЛ, С2 – продукт двухэлектронного восстановления ЦитС в составе Цит-КЛ, L и L• - липид и радикал липида, соответственно, P – продукт в электронно-возбужденном состоянии, образование которого приводит к появлению хемилюминесценции Для водных растворов были подобраны следующие константы скоростей: K5 = 2,7×10^4 M^(-1)×сек^(-1) K6 = 1,4×10^7 M^(-1)×сек^(-1) K7 = 9,9×10^4 M^(-1)×сек^(-1) Для гидрофобной среды были подобраны следующие константы скоростей: K5 = 6,0×10^4 M^(-1)×сек^(-1) K6 = 3,4×10^7 M^(-1)×сек^(-1) K7 = 2,0×10^3 M^(-1)×сек^(-1) 6. Были освоены методы работы с изолированными митохондриями, культурами клеток и кусочками ткани, позволяющие оценить результаты воздействия комплекса Цит-КЛ на эти объекты. Были определены основополагающие принципы дальнейшей работы с вышеуказанными биологическими образцами: 1) Митохондрии выделяются из печени самцов крыс Wistar (весом 200-300 г). 2) Для исследования радикал-продуцирующей способности указанных биологических объектов к образцам добавляется активатор хемилюминесценции, пероксид водорода в качестве субстрата пероксидазных реакций, а также азид натрия для подавления действия каталаз. 3) Для исследования тканей небходима дополнительная аэрация для поддержания жизнеспособности образца и рН среды: в условиях термостатирования (37 °С) в систему, содержащую исследуемые образцы ткани, через капилляр с помощью перистальтического насоса подаваётся слабый поток газовой смеси, содержащей воздух и 5% углекислого газа. Проведен предварительный эксперимент по измерению радикал-продуцирующей способности шокированных митохондрий в присутствии Цит-КЛ. 7. Полученные данные подготовлены к публикации в виде 2 статей, индексируемых в Web of Science и Scopus. О полученных результатах доложено на двух международных конференциях в виде 3- устных докладов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Второй год был посвящен подтверждению гипотезы о запуске комплексом цитохрома с с кардиолипином апоптоза по митохондриальному пути в раковых клетках. Были освоены способы выделения, получения и методы работы со свежевыделенными митохондриями, митохондриями с нарушенной целостностью мембран, культурами клеток, позволяющие оценить результаты воздействия комплекса Цит-КЛ на эти объекты. Проведены следующие исследования: 1. Методом кинетической хемилюминесценции было проведено сравнительное исследование кинетики пероксидазных реакций в присутствии люминола, катализируемых комплексом цитохром с/кардиолипин в суспензии свежевыделенных митохондрий и митохондрий с нарушенной целостностью мембран. Было показано, что образование свободных радикалов может протекать в системе, содержащей митохондрии с нарушенной целостностью, в то время как для свежевыделенных митохондрий сигнал оставался на уровне контроля. Полученные данные можно объяснить тем, что в митохондриях происходит разрушение добавляемой Н2О2 (которая запускает пероксидазную реакцию) каталазой митохондрий, что и обеспечивает биологическую защиту находящихся в клетках митохондрий от окислительного стресса, связанного с присутствием пероксида водорода. 2. Методом кинетической хемилюминесценции было проведено сравнительное исследование кинетики липопероксидазных реакций в присутствии активатора хемилюминесценции кумарина (специфичного на липидные радикалы), катализируемых комплексом цитохром с/кардиолипин в суспензии изолированных митохондрий и митохондрий с нарушенной целостностью мембран. Было показано, что (как и в случае с пероксидазной реакцией в системе с люминолом) образование липидных радикалов наблюдалось только для митохондрий с нарушенной целостностью мембраны, но не для интактных. Что можно объяснить разрушением добавляемой Н2О2 (которая запускает пероксидазную реакцию) каталазой митохондрий. Полученные данные (а именно соответствие полученной в модели и наблюдаемой в эксперименте с митохондриями с нарушенной целостностью мембран кинетики) свидетельствуют о том, что Цит-КЛ способен инициировать реакции окисления липидов по механизму классических пероксидаз в митохондриях с нарушенной целостностью мембраны. 3. Данные, полученные за второй год выполнения проекта, показали, что митохондрии, судя по всему, не вовлечены в механизм цитотоксического действия комплекса Цит-КЛ – при добавлении комплекса к интактным митохондриям в присутствии большой концентрации Н2О2 не наблюдалось ХЛ ответа ни в присутствии люминола, ни в присутствии кумарина. А если митохондрии не вовлечены в этот процесс, то цитотоксичность, наблюдаемая нами в опубликованной ранее в статье с нашим участием (Vladimirov, Y. A. et al. The cytotoxic action of cytochrome C/cardiolipin nanocomplex (Cyt-CL) on cancer cells in culture. Pharmaceutical research, 34(6), 1264-1275.), согласно схеме в этой же статье, может и должна быть обусловлена взаимодействием комплекса с цитоплазматической мембраной, то есть эффект комплекса Цит-КЛ будет развиваться по одному механизму как в раковых клетках, так и в клетках крови (независимо от содержания или отсутствия митохондрий в клетках). Таким образом, данные по цитотоксичности и апоптогенному действию комплекса Цит-КЛ, опубликованные ранее в указанной выше статье, оказались достаточными для того, чтобы выбрать условия для последующего исследования противоракового действия препарата цитохром с/кардиолипин на тканях и органах – в дальнейших экспериментах на тканях мы подбирали концентрации комплекса Цит-КЛ исходя из методик, описанных в указанной статье. 4. Было изучено действие комплекса цитохрома c с кардиолипином на культуру раковых клеток (А172 (Homo sapiens brain glioblastoma)), используя метод микроскопии. Было показано, что при действие высокой концентраций комплекса Цит-КЛ (5 мкМ) вызывает гибель клеток мгновенно. Добавление к изучаемой системе антиоксиданта тролокса значительно замедляет гибель клеток. Это в свою очередь говорит о том, что цитотоксический эффект комплекса Цит-КЛ на раковые клетки был обусловлен окислительными процессами. Было установлено, что эффект комплекса цитохрома с с кардиолипином не является суммой эффектов отдельно взятых цитохрома с или кардиолипина. 5. Полученные данные за первый и второй год выполнения проекта были оформлены в виде 3-х статей, одна из которых уже опубликована, 2 приняты к печати и будут опубликованы в ближайших выпусках в журналах с высоким рейтингом. Результаты работы были доложены в виде 4-х устных доклада на международных конференциях. 6. На основе полученных данных была скорректирована ранее предложенная гипотеза об апоптогенном действии комплекса цитохрома с с кардиолипином на раковые клетки. Цитотоксическое действие комплекса цитохрома с с кардиолипином как противоракового агента, попадающего в клетку из внешней среды, скорее всего, не связано с запуском апоптоза по митохондриальному пути (ка было предложено ранее), а обусловлено окислением липидов цитоплазматической мембраны. Этот вывод является очень важным для понимания дальнейших перспектив разработки лекарственного средства на основе такого комплекса.