Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках проекта был разработан и осуществлен синтез магнитных наночастиц оксида железа, покрытых оболочкой из человеческого сывороточного альбумина (МНЧ-ЧСА). В ходе контролируемого термического разложения ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте были получены высококристалличные, водорастворимые наночастицы маггемита, что было подтверждено методами порошковой рентгеновской дифракции и Рамановской спектроскопии. Просвечивающая электронная микроскопия показала образование сферических наночастиц размером 8±2 нм, которые описываются узким нормальным распределением по размеру. На второй стадии синтеза магнитных наночастиц производилась адсорбция молекул ЧСА в водной среде с последующей ковалентной стабилизацией белкового покрытия вокруг наночастиц маггемита. С помощью просвечивающей электронной микроскопии с параллельным элементным анализом были установлены состав и структура «ядро-оболочка» у образующихся наночастиц. Согласно данным термогравиметрического анализа на долю органической оболочки приходится 55 массовых %. Для проведения атомно-силовой микроскопии МНЧ-ЧСА были подобраны оптимальные условия (скол слюды в качестве подложки, полуконтактный метод сканирования, оптимальное разведение образца для идентификация отдельных наночастиц без агрегации), в которых удалось определить размер МНЧ-ЧСА (10±3 нм) и логнормальное распределение наночастиц по размеру. Методом динамического светорассеяния были определены значения гидродинамического диаметра и дзета-потенциала наночастиц маггемита, покрытых белковой оболочкой. Диаметр составил 23±1 нм, индекс полидисперсности не превышал значения 0,2, а распределение носило мономодальный вид. Такие наночастицы слабо инактивируются ретикуло-эндотелиальной системой, способны долгое время циркулировать в кровотоке и накапливаться в рыхлой гиперваскуляризованной опухолевой ткани за счет реализации EPR-эффекта, а мономодальное распределение говорит о гомогенности системы, в связи с чем ее легче стандартизовать и предсказывать ее поведение в организме. Дзета-потенциал МНЧ-ЧСА оказался отрицательным, что объясняется наличием ионизованных карбоксильных групп в составе аминокислот альбумина при физиологических условиях. Численное значение составило -12,6 мВ, хотя в литературе стабильными за счет электростатического отталкивания наночастицами считаются частицы с зарядом по модулю равным или превышающим 30 мВ. В связи с этим нами были проведены дополнительные исследования стабильности МНЧ-ЧСА в двух модельных жидкостях: фосфатно-солевой буфер и культуральная среда DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сывороткой для моделирования процесса сорбции посторонних белков. В первом случае гидродинамический диаметр магнитных наночастиц с белковой оболочкой не изменялся на протяжении 8 суток. Во втором случае размер наночастиц увеличился примерно на 30% за счет сорбции белков из сыворотки, однако, в следующие трое суток изменений зарегистрировано не было. Принимая во внимание, что наночастицы циркулируют в кровотоке максимум несколько часов, проведенное в течение трех суток исследование, позволяет сделать вывод о хорошей стабильности полученной системы. Анализ магнитных свойств показал наличие у МНЧ-ЧСА суперпарамагнитных свойств, что говорит о высоких значениях магнитной восприимчивости материала и высокой намагниченности насыщения. Для сравнения полученных магнитных наночастиц с МРТ-контрастными агентами на основе оксида железа, использовавшихся в клинической практике в недавнее время, определялось значение Т2 релаксивности с помощью магнитно-резонансного томографа. Данный параметр показывает, насколько эффективно наночастицы уменьшают время спин-спиновой релаксации протонов в зависимости от концентрации. Т2 релаксивность для МНЧ-ЧСА составила 160 мМ-1с-1 и превзошла показатели для таких известных контрастных агентов как Feridex, Ferumoxtran-10 и Resovist. В совокупности исследование релаксационных и магнитных характеристик наночастиц маггемита, покрытых ЧСА, показало большую перспективу их применения в качестве контрастных агентов при проведении МРТ-исследований различных патологий. Для того чтобы оценить перспективность применения МНЧ-ЧСА в качестве наноконтейнера проводилась загрузка противоопухолевого препарата цисплатина на магнитные наночастицы за счет образования координационных, электростатических и других нековалентных связей. Инкубирование МНЧ-ЧСА с цисплатином в фосфатном буфере с последующим удалением избытка лекарства с помощью метода гель-фильтрации приводило к адсорбции цисплатина на поверхности белковой оболочки наночастиц, что было наглядно продемонстрировано просвечивающей электронной микроскопией с параллельным элементным анализом. Взаимное расположение атомов платины и железа подтвердило успешную загрузку противоопухолевого препарата на магнитные наночастицы. Ввиду малых размеров молекул противоопухолевого препарата по сравнению с размером магнитных наночастиц, методы АСМ и ДСР не показали существенного прироста гидродинамического или собственного диаметра МНЧ-ЧСА. Для того чтобы определить емкость и эффективность загрузки, необходимо было количественно проанализировать состав комплекса наночастиц с цисплатином, в связи с чем была разработана методика определения концентрации платины и железа методом атомно-эмиссионной спектроскопии. Было обнаружено, что в зависимости от соотношения количества лекарства и МНЧ-ЧСА значения емкости и эффективности загрузки достаточно сильно отличалось. В связи с этим было подобрано оптимальное соотношение исходных реагентов для достижения максимально возможной емкости загрузки цисплатина при сохранении адекватной эффективности загрузки препарата, и данное соотношение цисплатин:наночастицы оказалось равным 2, а соответствующее ему значение загрузки – 22%, что является хорошей характеристикой для наноконтейнера. В связи с полученными данными был разработан протокол получения магнитных наночастиц, покрытых оболочкой из альбумина и загруженных противоопухолевым препаратом цисплатином.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках второго года выполнения проекта был проведен подробный анализ разработанной наносистемы на основе магнитных наночастиц, покрытых оболочкой из человеческого сывороточного альбумина (МНЧ), и противоопухолевого препарата цисплатина (ЦП). На первом этапе был произведен анализ высвобождения лекарства из комплекса в различных модельных условиях. Так, в равновесных условиях и в отсутствии каких-либо препятствий для прохождения молекул ЦП высвобождение с поверхности МНЧ является практически полным (до 96% загруженного препарата переходит в окружающую среду, моделирующую физиологические условия). При заключении комплекса в замкнутый объем, ограниченный диализной мембраной, интенсивность высвобождения значительно падает, и только 12% от общего количества ЦП в комплексе способно выходить во внешнюю среду. Слабая зависимость данного процесса от значения рН подтверждает теорию о том, что ведущую роль в образовании комплекса МНЧ-ЦП играют не электростатические силы, а координационные, что было подтверждено в ходе серии экспериментов с применением индифферентного электролита и различных веществ, конкурирующих с МНЧ за связывание с ЦП. Так, из-за образования координационных связей с электронодонорными группами химических агентов или простой адсорбции, время распада комплекса МНЧ-ЦП уменьшалось в присутствии таких агентов, как ацетон, глутамин, глюкоза, сыворотка крови козы, хлорид или перхлорат ионы, которые моделировали различное возможное окружение комплекса в организме. Учитывая полученные данные, можно прогнозировать эффективность высвобождения ЦП в зависимости от особенностей метаболизма, имеющих место в случае конкретного онкологического заболевания. После того, как было доказано, что лекарственный препарат способен покидать наноконтейнер, необходимо было удостовериться в том, что комплекс МНЧ-ЦП способен проникать в живые клетки, т.к. цитостатическое действие ЦП возможно только лишь при непосредственном контакте с ДНК. Методом конфокальной микроскопии на живых опухолевых (4Т1 и С6) и здоровых клетках (человеческие эмбриональные фибробласты-ФЭЧ) было показано, что МНЧ проникают в клетки, однако, характер накопления препарата различается. Так, интернализация в клетки глиомы С6 происходила более интенсивно и спустя 25 минут инкубации МНЧ показали активную цитоплазматическую локализацию, в то время как в случае ФЭЧ они визуализировались исключительно вблизи мембраны. Спустя 50 минут инкубации накопление препарата выходит на плато, причем ФЭЧ показали практически полное отсутствие колокализации МНЧ с лизосомами, что является свидетельством клатрин-независимого механизма эндоцитоза. Совершенно противоположная ситуация наблюдалась в случае клеток С6, где наличие колокализации было подтверждено значением коэффициента Пирсона, равного 0,41. Для того, чтобы оценить вклад активного вида транспорта МНЧ через клеточную мембрану были проведены эксперименты при пониженной температуре (+4°С). Анализ данных показал, что вклад пассивного переноса МНЧ в клетки С6 составил 20-30%, а в случае ФЭЧ – 60%. С помощью интравитальной микроскопии на животных с привитой опухолью (аденокарцинома 4Т1) был доказан факт циркулирования препарата в опухолевых сосудах уже спустя 5 мин после его внутривенной инъекции. Был также установлен факт последующего транспорта МНЧ в клетки стромы опухоли, где препарат можно было обнаружить даже спустя 6 ч после введения, что говорит о достаточно медленном его элиминировании из опухолевого микроокружения. Кроме того удалось зафиксировать вовлеченность клеток иммунной системы (моноцитов) в процесс переноса препарата в клетки стромы опухоли. На следующем этапе необходимо было проанализировать цитотоксические свойства ЦП, загруженного на МНЧ. Для этой цели была проведена серия MTТ-тестов на следующих культурах клеток: аденокарциномы молочной железы 4Т1 мыши, глиомы С6 крысы, человеческих эмбриональных фибробластах (ФЭЧ) и крысиных астроцитах. Полученные данные подтверждают сохранение цитотоксических свойств ЦП после образования комплекса. Так, полумаксимальная эффективная концентрация IС50 для ЦП составила: 5±1, 52±2 и 5±1 мкг/мл для клеток 4Т1, ФЭЧ и С6 соответственно; для МНЧ-ЦП - 20±3, 122±4, 44±6 мкг/мл для клеток 4Т1, ФЭЧ и С6 соответственно. Увеличение IС50 для разработанного комплекса МНЧ-ЦП скорее всего связано с конечной скоростью выхода ЦП с поверхности МНЧ, которую мы наблюдали в ходе анализа процесса высвобождения лекарства. В связи с этим в определенный момент времени эффективная доза ЦП, воздействующая на живые клетки, оказывается меньше, чем в случае инкубации со свободным лекарственным препаратом. МНЧ в отсутствии ЦП не показали токсичности на опухолевых клетках 4Т1 и здоровых астроцитах крысы, а значит, после высвобождения лекарственного препарата МНЧ будут безопасны для живых клеток. Следующим этапом характеристики лекарственно-диагностического препарата было исследование фармакокинетики и биораспределения МНЦ-ЦП и сравнение результатов со свободным ЦП. Для обоих препаратов была установлена двухфазная фармакокинетическая кривая со следующими параметрами: T1(ЦП) = 23 мин, T2(ЦП) = 13,3 ч, T1(МНЧ-ЦП) = 69 мин, T2(МНЧ-ЦП) = 6.4 ч. AUC0→t и Cl составили: 186 мкг•ч/мл и 11 мл/ч для МНЧ-ЦП против 40 мкг•ч/мл и 48 мл/ч для свободного ЦП. Иными словами, загрузка ЦП на МНЧ привела к увеличению времени циркуляции лекарства в кровотоке. Так, на протяжении первой фазы МНЧ-ЦП элиминировались из кровотока в 3 раза дольше, чем свободный ЦП. Значительные изменения были продемонстрированы и в случае биораспределения ЦП. Накопление свободного ЦП наблюдалось в почках и печени, в то время как МНЧ-ЦП также накопились и в селезенке, и в печени. Причем, если уровень накопления в почках практически не изменился по сравнению со свободным ЦП, то концентрация препарата в селезенке и печени увеличилась многократно, что говорит об изменении механизма выведения лекарства из организма: комплекс МНЧ-ЦП накапливается в органах ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). Финальным этапом работы была характеристика диагностических и терапевтических свойств разработанных МНЧ-ЦП в условиях in vivo c использованием двух моделей опухоли: аденокарциномы молочной железы 4Т1 мыши и глиомы С6 крысы. Было показано, что МНЧ эффективно визуализируют тело опухолей при проведении МРТ-исследования с использованием режима SWI спустя 2 – 24 ч после внутривенного введения контрастного агента. В качестве оптимальной для проведения диагностики была выбрана доза в 8 мг(Fe)/кг, а в качестве временного интервала – 2 ч после введения контраста. Терапия аденокарциномы 4Т1 у мышей с помощью МНЧ-ЦП, трижды вводимого на 7ой, 9ый и 11ый день после имплантации опухоли, не привела к эффективному лечению опухолеобразования: средняя продолжительность жизни и медиана выживаемости для МНЧ-ЦП и контрольной группы составили 24±3, 25 и 24±4, 26 суток соответственно. При этом химиотерапия с помощью МНЧ-ЦП оказывала меньший токсический эффект, о чем свидетельствовали данные массы тела экспериментальных животных. На основании полученных данных был сделан вывод о недостаточной выбранной терапевтической дозе в 4 мг (ЦП)/кг. Кроме того, данная модель обладает высоким метастатическим потенциалом и гибель животных вызвана не столько ростом первичного очага, сколько образование метастазов, отслеживать которые затруднительно. Для решения данной проблемы нами было предложено использовать модель аденокарциномы, несущую репортерный ген люциферазы, а визуализации проводить с помощью оптической томографии. Поскольку метастазы уступают первичному очагу в размерах, а также расположены не подкожно, а распределены по внутренним органам для повышения чувствительности было решено использовать более яркий циклический аналог классического D-люциферина (Cycluc). Однако предварительные эксперименты показали, что он не только не превосходит D-люциферин, но и по ряду параметров уступает ему (Рисунок 24). Исследование данного явления показало, что обладая очень высокой афинностью к люциферазе Cycluc имеет при этом крайне низкую максимальную скорость, действуя скорее, как ингибитор, а не субстрат. В связи со сложностью интерпретации причин гибели лабораторных животных было предложено дальнейшие исследования проводить на другой опухолевой модели. В рамках следующего эксперимента доза препарата была увеличена до 5 мг (ЦП)/кг, а в качестве модели была выбрана глиома С6 крысы. Однако однократное введение МНЧ-ЦП привело к серьезным токсическим последствиям для животных, и эксперимент был прекращен досрочно. Анализ темпа ростов опухоли мозга показал, что опухольсупрессирующее воздействие МНЧ-ЦП оказалось сравнимым с эффективностью свободного ЦП: опухолевый очаг увеличился в 2,1±1,0 и 2,2±1,7 раз соответственно против 8,9±4,0 раз для группы физраствора. Динамика изменений массы тела животных не показала достоверных различий между группами, получавшими в качестве лекарства МНЧ-ЦП или ЦП, но обе эти группы достоверно отличались от контрольных групп, что служило свидетельством наличия токсического влияния данных препаратов. Для выяснения причин смертности экспериментальных животных от введения препарата МНЧ-ЦП был проведен ряд экспериментов: методом АЭС была определена концентрация платина в органах, а образцы крови были исследованы по ряду биохимических показателей: AST, ALT, BUN, CRE, UA. Наличие платины было установлено в легких, селезенке, почках и печени. Для препарата МНЧ-ЦП было установлено достоверное увеличение концентрации платины в почках, печени и селезенке по сравнению со свободным ЦП. Данные о биохимических показателях подтвердили факт того, что препарат МНЧ-ЦП преимущественно накапливался в органах РЭС, в основном в печени, о чем свидетельствует повышенный уровень показателей ALT, AST и UA: в 5,8, 3,6 и 2 раза соответственно по сравнению с показателями крови контрольной группы животных. Полученные данные свидетельствуют об изменении распределения ЦП после загрузки на МНЧ: комплекс МНЧ-ЦП преимущественно накапливается в печени, вызывая угнетающее действие на ее функции и приводя к гибели гепатоцитов с сопутствующими серьезными побочными эффектами, которые, судя по всему, и приводят к гибели животного. На основании проведенных исследований в качестве оптимальной концентрации МНЧ-ЦП для химиотерапии опухолей была предложена доза в 4,5 мг(ЦП)/кг для достижения оптимальной терапевтической эффективности при умеренном уровне системной токсичности. Безусловно, для уверенного выбора дозы необходимо провести ряд дополнительных экспериментов. Также в рамках работы была подготовлена и подана в журнал «Advanced Functional Materials» статья «Human serum albumin coated magnetic iron oxide nanoparticles for stimulusresponsive cisplatin delivery». Статья не была принята в печать, планируется переподача в журнал «Angewandte chemie».