КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-74-10140

НазваниеВалидация длинной некодирующей РНК LL35 в качестве регулятора экспрессии генов и потенциальной мишени для терапии

РуководительСергеева Ольга Владимировна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2019 

Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слованекодирующие РНК, регуляция, энтодерма, транскрипционный фактор, гепатоциты, стеатоз, фиброз, гепатоклеточная карцинома

Код ГРНТИ34.15.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В последние годы показано значительное участие некодирующих РНК в регулировании многих биологических процессов, включая транскрипцию, трансляцию и дифференцировку клеток. В литературе известны примеры влияния днРНК на развитие ряда заболеваний, включая раковые (Smekalova et al., 2016), что позволяет рассматривать днРНК как потенциальные мишени для терапии и диагностики. Известно, что днРНК DEANR1 участвует в регулировании дифференцировки эндотермы в эмбриональных стволовых клетках человека путем цис-регулирования фактора транскрипции Foxa2 (W. Jiang et al., 2015). Уровень экспрессии транскрипционного фактора Foxa2 в печени выше, чем в других органах. Показано, что Foxa2 играет важную роль в гомеостазе глюкозы в печени, в стрессовых условиях голодания влияет на катаболизм жирных кислот, регулирует биогенез липипротеинов высокой плотности (M. Kanaki et al, 2016). Фактор Foxa2 также является транскрипционным активатором печень-специфических генов альбумина и трансферрина. Кроме того, показано, что DEANR1 оказывает влияние на эпителиально-мезенхимальный переход клеток, который происходит не только при эмбриональном развитии, но и при фиброзе и прогрессии раковых опухолей (Y. Fan et al, 2016). Таким образом, изучение регулятора транскрипционного фактора Foxa2 является актуальной задачей. В результате биоинформатического анализа нами был найден гомолог днРНК DEANR1 в мыши - днРНК LL35 и установлена ее экспрессия в печени мыши. ДнРНК LL35, мышиный гомолог DEANR1, распологается в геноме в непосредственной близости от транскрипционного фактора Foxa2. Следует отметить, что расположение таких днРНК, ассоциированных с факторами транскрипции, достаточно консервативно в млекопитающих. На основании опубликованных данных можно предположить, что днРНК LL35 участвует в регуляции транскрипции фактора Foxa2 в печени, и как следствие, может оказать влияние на метаболические процессы и различные заболевания печени. Использование метода РНК-интерференции позволяет добиться снижения уровня экспрессии целевой РНК на 80-95% in vitro и in vivo. На первом этапе реализации проекта планируется впервые провести нокдаун днРНК LL35 в линии клеток гепатомы мыши Hepa1-6. Для этого будет проведен дизайн, синтез набора синтетических модифицированных миРНК и их проверка in vitro, отбор миРНК с максимальной эффективностью ингибирования дцРНК LL35 и определение их ингибирующей концентрации (IC50). Количество дцРНК LL35 будет определяться методом количественного ПЦР, а фенотипы клеток - микроскопическими методами исследования и методом анализа протеома. На следующем этапе нами впервые будет использован метод РНК-интерференции для снижения количества днРНК LL35 в печени in vivo, на мышах линии C57BL/6. Адресная доставка миРНК, подобранной на первом этапе работы, в гепатоциты печени мыши будет осуществляться с помощью липидных наночастиц (Zatsepin et al, 2016). Эффективность ингибирования днРНК LL35 будет определяться методом количественного ПЦР, а для определения изменений в метаболических процессах печени будут проведены биохимический анализ крови и гистологические исследования. Таким образом, в рамках проекта планируется впервые провести изучение днРНК LL35 in vitro и in vivo, что позволит оценить потенциальную терапевтическую и диагностическую значимость днРНК LL35 и ее гомолога в человеке DEANR1 in vivo.

Ожидаемые результаты
Длинные некодирующие РНК являются важными регуляторами многих клеточных процессов, поэтому сегодня активно изучаются как потенциальные мишени для терапии и диагностики. Несмотря на то, что низкая гомология днРНК в разных организмах значительно затрудняет развитие этого направления, оно привлекает все больше внимания исследователей, и ряд препаратов уже находятся на доклинической стадии испытаний (M.A. Parasramka et al, 2016). В результате реализации данного проекта будет охарактеризован нокдаун гена нкРНК LL35 in vitro и in vivo, и получен ответ на вопрос о возможной регуляции транскрипционного фактора Foxa2. Протеомное исследование клеточной линии с нокдауном гена нкРНК LL35 позволит определить белки, вовлеченные во взаимодействие с днРНК и описать клеточные процессы, в которые может быть вовлечена эта днРНК. На основании результатов работы in vivo будет предварительно оценено участие днРНК LL35 в метаболических процессах печени. В дальнейшем, при успешной реализации этого проекта, предполагается провести полное исследование роли днРНК LL35 в развитии и регуляции неалкогольного стеатоза, фиброза и гепатоклеточной карциномы печени мыши на in vivo моделях, что требуется для оценки терапевтической и диагностической значимости данной днРНК. Эти данные необходимы для последующей валидации днРНК DEANR1 человека в качестве мишени для терапии или диагностики. По результатам работы планируется публикация 3 статей в высокорейтинговых научных изданиях.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В результате комплексного исследования с использованием методов биоинформатики и молекулярной биологии показана транскрипция нкРНК LL35 в клеточных линиях AML12, Hepa1-6, а также в органах мыши (в основном в легких и печени). Впервые показана преимущественная локализация нкРНК LL35 в ядре клетки. Для изучения функции нкРНК был использован метод РНК-интерференции, однако с его помощью удалось получить снижение уровня экспрессии LL35 только на 60% in vitro. Мы предположили, что такая низкая эффективность объясняется ядерной локализацией нкРНК. С использованием подхода к снижению экспрессии нкРНК LL35 антисмысловыми олигонуклеотидами удалось добиться ингибирования 85% транскрипции РНК. Таким образом, впервые в мире была получена клеточная линия с нокдауном нкРНК LL35, фенотип которой будет охарактеризован в следующем году.

 

Публикации

1. Сергеева О.В., Курочкин И.И., Малявко А.Н., Зацепин Т.С. Длинная некодирующая РНК LL35 является новым регулятором экспрессии генов в печени мыши Гены и клетки, 12(3):224 (год публикации - 2017)

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Ингибирование некодирующей РНК (нкРНК) LL35 приводит к снижению метаболической активности клеток и изменению морфологии цитоскелета. Функциональный аналог нкРНК LL35 в человеке – DEANR1 участвует в регуляции экспресии транскрипционного фактора Foxa2. Исследование возможной взаимосвязи нкРНК LL35 с транскрипционным фактором Foxa2 выявило снижение мРНК на 20%, а белка – на 30% при ингибировании LL35 на 90%. Таким образом, регуляция транскрипционного фактора Foxa2 не является основной функцией нкРНК LL35 в гепатоцитах печени. Изучение количественного протеома клеток с ингибированием LL35 выявило изменение 24 белков, участвующих в метаболизме липидов и биогенеза митохондрий. Уменьшение уровня РНК LL35 приводит к увеличению экспрессии мРНК коактиваторов рецепторов, активируемых пролифераторами пероксисом, PGC-1α и PGC-1β, а также к активации транскрипции рецептора, активируемого пероксисомными пролифераторами PPARg и снижению транскрипции рецептора, активируемого пероксисомными пролифераторами PPARa. PGC-1α и PGC-1β, PPARa и PPARg являются основными регуляторами транскрипции генов биогенеза митохондрий, таким образом нкРНК LL35 участвует в регуляции функций митохондрий в клетке. Для оценки потенциальной диагностической значимости нкРНК LL35, а в дальнейшем и человеческой нкРНК DEANR1, мы проанализировали количество РНК LL35 в печени мыши после проведения частичной гепатэктомии и при развитии фиброза, индуцированного воздействием тетрахлорида углерода. Оказалось, что уровень нкРНК LL35 понижен в обоих случаях, что свидетельствуют о потенциальной значимости нкРНК LL35 для развития патологических состояний печени in vivo.

 

Публикации

1. О. Сергеева, С. Коринфская,И. Курочкин, Т. Зацепин Длинная некодирующая РНК LL35/Falcor –регулятор экспрессии транскрипционного фактора Foxa2 в нормальной печени мыши и при фиброзе Acta Naturae, - (год публикации - 2019)

2. О. Сергеева, Е. Свиридов, Т. Зацепин Non-coding RNA in liver regeneration – from molecular mechanisms to clinical implications Seminars in Liver Disease, - (год публикации - 2019)

3. О. Сергеева, С. Коринфская, И. Курочкин, Т. Зацепин Murine lncRNA LL35 as a probable homolog of human lncRNA DEANR1 FEBS open bio, v8, suppl1, p.116 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

Возможность практического использования результатов
нкРНК LL35 преимущественно экспрессируется в норме гепатоцитов печени, причем уровень экспресии на порядок выше, чем в раковых клетках. Эта особенность характеризует нкРНК как потенциальный биомаркер онкологических заболеваний. Полученные данные о снижении количества РНК при частичной гепатэктомии печени и фиброзе, индуцированном воздействием тетрахлорида углерода, свидетельствуют о возможности использования нкРНК LL35 еще и в качестве биомаркера при различных болезнях и патологиях печени. Изучение функций мышиного функционального аналога (LL35) нкРНК человека DEANR1 позволит расширить сферу потенциального терапевтического и диагностического использования днРНК DEANR1 в качестве биомаркера in vivo.