Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В работе было изучено влияние различных тепловых обработок при освещении (200 мкмоль/(м2 с) ФАР) на функционирование альтернативных ферментов дыхания (цианид-резистентной оксидазы (AO) и НАДН-дегидрогеназы) и установлена связь между теплоустойчивостью яровой пшеницы (Triticum aestivum L.), содержанием БТШ, водорастворимых углеводов в листьях и активностью альтернативных ферментов дыхания в митохондриях. Были обнаружены отличия в содержании БТШ после тепловых обработок, что, вероятно, связано с выполнением ими различных функций, которые зависят от интенсивности и продолжительности действия высокой температуры. Тепловое закаливание при 39 °C в течение 24 ч повышало устойчивость растений к тепловому стрессу, содержание водорастворимых углеводов и активность AO в листьях. После действия на закаленные проростки теплового шока (50 °C в течение 3 часов) активность АО была такой же высокой. Показано, что фотосинтез является более чувствительным к действию высоких температур, чем дыхание. Отмечено снижение скорости базального транспорта электронов в ЭТЦ хлоропластов после теплового закаливания и действия на закаленные растения теплового шока (50 °C, 3 ч). В то же время, была отмечена высокая степень сопряжения потока электронов с процессом фотофосфорилирования в этих условиях. Предположено, что ингибирование фотосинтеза является адаптивным механизмом, или связано с его ограничением на фоне повышенного содержания водорастворимых углеводов в листьях при высоких температурах в условиях света. Было обнаружено три изоформы АО, синтез которых зависел от интенсивности и продолжительности действия высокой температуры. Максимальное содержание белка АО было показано после действия на закаленные проростки теплового шока (50 ° C в течение 1 и 3 часов). Таким образом, показано вовлечение альтернативной цианид-резистентной оксидазы в развитие теплоустойчивости яровой пшеницы и отмечена зависимость функционирования АО от пула водорастворимых углеводов. Увеличенный вклад АО в дыхание и высокая активность внешней НАДН-дегидрогеназы необходимы для регуляции отношения ATФ/AДФ, НАД(Ф)Н/НАД(Ф)+ и интермедиатов цикла Кребса, которые вовлечены в различные метаболические пути в условиях повышенных температур. Вероятно, что в условиях действия высоких температур АО активируется для регуляции содержания АФК при фотоингибировании, которые могут образовываться в результате замедленной работы ЭТЦ хлоропластов, что в дальнейшем и предстоит выяснить.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Во второй год реализации проекта была продолжена работа по подбору температуры холодового закаливания, приводящей к повышению морозоустойчивости растений озимой пшеницы. На первом этапе работы было изучено влияние холодового закаливания и последующего холодового стресса на функционирование альтернативных ферментов дыхания (цианид-резистентной оксидазы (AOX) и альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ) и установлена связь между морозоустойчивостью озимой пшеницы (Triticum aestivum L.), содержанием дегидринов, водорастворимых углеводов в листьях, и альтернативных ферментов дыхания в митохондриях. Холодовое закаливание в условиях непрерывного освещения эффективно повышало устойчивость растений озимой пшеницы к низкотемпературному стрессу, сопровождалось накоплением водорастворимых углеводов и синтезом дегидринов в листьях. Вклад в дыхание AOX и активность внешних НАД(Ф)Н-дегидрогеназ увеличивался после холодового закаливания и оставались высокими после действия на закаленные растения холодового стресса. В то же время было отмечено незначительное снижение скорости базального транспорта электронов на фоне повышенного содержания сахаров в листьях при холодовом закаливании. На втором этапе работы было изучено влияние холодового и теплового закаливания, а также температурного стресса на содержание белка альтернативных ферментов дыхания, на образование АФК в листьях, митохондриях и хлоропластах. Был проведен ингибиторный анализ вклада альтернативных ферментов дыхания в образование АФК митохондриями и хлоропластами. При изучении влияния низких и высоких температур на содержание белка AOX и белка альтернативных «внутренних» (NDA) и «внешних» (NDB) НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, были выявлены различия в спектре изоформ мономеров (активные формы) белка AOX у яровой и озимой пшеницы в ответ на температурные обработки. В митохондриях яровой пшеницы при тепловом закаливании наблюдали синтез четырех активных изоформ белка AOX, при этом содержание изоформ зависело от интенсивности и продолжительности тепловых обработок. У озимой пшеницы на холодовую обработку реагировала только одна изоформа белка AOX. Содержание белков альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ также отличалось, при холодовом закаливании озимой пшеницы увеличивалось содержание NDB, в то время как при тепловом закаливании яровой пшеницы увеличивалось содержание и NDA, и NDB (Полякова и др., 2019, в печати). Было проанализировано влияние закаливания и последующего температурного стресса на содержание АФК в митохондриях и вклад альтернативных ферментов дыхания в их генерацию. Холодовое закаливание приводило к увеличению содержания пероксида водорода в митохондриях, в то же время тепловое закаливание, наоборот, снижало уровень пероксида водорода в митохондриях. При действии холодового стресса на закаленные растения озимой пшеницы не было обнаружено статистически значимых отличий в содержании пероксида водорода в митохондриях, в то время как после действия теплового стресса на закаленные растения яровой пшеницы увеличение содержания в митохондриях пероксида водорода происходило. Ингибирование активности АОХ с помощью БГК выявило увеличение образования пероксида водорода в митохондриях в этих условиях. При этом не было выявлено усиления (по сравнению с контролем) ингибиторного действия БГК после закаливания и последующего температурного стресса (как холодового, так и теплового) на растения. Вероятно, антиоксидантная функция альтернативной оксидазы не является основной функцией АОХ в фотосинтезирующих тканях при тепловом и холодовом воздействиях, в отличие от гетеротрофных тканей (Грабельных и др., 2011). Также обнаружено некоторое увеличение содержания пероксида водорода при ингибировании основного цитохромного пути дыхания ротеноном и KCN при тепловом закаливании и KCN при тепловом стрессе, что может свидетельствовать о возможной антиоксидантной роли ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ. Можно предположить, что в условиях повышенных температур нагрузка на дыхательную цепь очень высокая, поэтому блокирование потока электронов ингибиторами (KCN) приводит к генерации АФК, что необходимо прояснить в дальнейших исследованиях. Было изучено влияние холодового и теплового закаливания и стресса на содержание пероксида водорода в хлоропластах и вероятную вовлеченность AOX в регуляцию этого процесса. Было проанализировано влияние ингибитора цитохром с оксидазы и активатора альтернативной оксидазы антимицина А (АА) in vivo на скорость базального транспорта электронов в хлоропластах, уровень пероксида водорода в листьях и хлоропластах и содержание в листьях белка AOX. Было показано, что обработка AA приводила к увеличению содержания в листьях димера AOX (неактивная форма белка), особенно при тепловом закаливании. Тепловой и холодовой стресс приводили к увеличению содержания пероксида водорода в листьях и значительному подавлению скорости базального транспорта электронов в хлоропластах. В тоже время содержание пероксида водорода в хлоропластах снижалось, что может указывать на образование в этих условиях других форм АФК или ингибирование активности антиоксидантных ферментов и неферментативных механизмов защиты на фоне сниженной функциональной активности хлоропластов. После закаливания статистически значимых отличий в содержании пероксида водорода в хлоропластах не было отмечено. Обработка растений АА позволила выявить различия в ответной реакции клеток пшеницы на тепловое и холодовое закаливание. При тепловом закаливании на растворе с АА происходило увеличение пероксида водорода в хлоропластах, в то время как при холодовом закаливании такого не наблюдали. Известно, что АА влияет не только на процессы дыхания, но и на процессы фотосинтеза. АА может ингибировать ферредоксин-зависимый путь циклического транспорта электронов через фотосистему I хлоропластов (Joët et al., 2001). Транспорт электронов через этот путь часто активируется при высокой интенсивности света и обеспечивает достаточное количество дополнительного АТФ в условиях фотодыхания (Joёt et al. 2001; Munekage and Shikanai 2005). Повышение пероксида водорода в хлоропластах при обработке АА закаленных растений, вероятно, может быть связано с ингибирование циклического транспорта электронов. Таким образом, в данной работе было проведено исследование возможности взаимодействия фотосинтеза и дыхания в условиях низких и высоких температур на уровне функциональной активности хлоропластов и митохондрий, содержания в них пероксида водорода и возможной вовлеченности в этот процесс альтернативных ферментов дыхания. Было заключено, что альтернативные ферменты дыхания играют важную роль в адаптации пшеницы к высоким и низким температурам. Активность альтернативных ферментов дыхания зависит от пула водорастворимых углеводов в листьях. Было отмечено увеличение вклада альтернативной оксидазы и ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ в дыхание и увеличение содержания этих белков при закаливании и последующем температурном стрессе. Выявлена антиоксидантная функция альтернативной оксидазы в митохондриях яровой и озимой пшеницы при закаливании и последующем температурном стрессе. Однако, как оказалось, в фотосинтезирующих растениях эта функция является не основной в условиях низких и высоких температур. Отмечено, что в листьях яровой пшеницы при тепловом воздействии происходила активация всех альтернативных ферментов дыхания, в то время как у озимой пшеницы – активацию AOX и «внешних» альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ. При тепловом закаливании ингибирование альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, AOX и цитохром с оксидазы приводило к увеличению образования пероксида водорода, что свидетельствует о необходимости поддержания баланса между углеводным метаболизмом и скоростью электронного транспорта в условиях высоких температур. В дальнейшем необходимо будет измерить уровень восстановительных эквивалентов. Вероятно, что при тепловом закаливании будет наблюдаться высокий уровень цитоплазматического НАД(Ф)Н и АТФ, в результате чего работа многих НАД(Ф)+- зависимых ферментов может быть ограничена. Активация в этом случае альтернативных ферментов дыхания может заключаться в быстром окислении НАД(Ф)Н в дыхательной цепи и снятии этого ограничения. С использованием антимицина А in vivo нам не удалось выявить вклад AOX в поддержании работы фотосинтетического аппарата, что возможно связано с тем, что антимицин А приводил к увеличению содержания неактивной формы белка AOX, но не ее активных изоформ. В дальнейшем предстоит выявить основную функцию альтернативных ферментов дыхания при действии низких и высоких температур, а также изучить механизм активации изоформ мономеров AOX (на уровне экспрессии генов, активности и содержании белка) в листьях при тепловом закаливании и выяснить какие конкретно изоформы AOX индуцируются низкой и высокой температурой. За второй год реализации проекта было опубликовано три работы, было сделано четыре устных доклада на российских и международных конференциях. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: http://respublika11.ru/2019/03/26/molodyie-biologi-i-ekologi-obmenyalis-nauchnyim-opyitom/ https://isu.ru/ru/news/newsitem.html?action=show&id=7068 http://www.sbras.info/articles/science/sibirskie-uchenye-uznali-kak-pshenitsa-adaptiruetsya-k-teplovomu-stressu https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S017616171830172X?via%3Dihub http://www.sifibr.irk.ru/publication/publ/318-rmecof2018/1025-5.html