КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-74-10065

НазваниеВысокотехнологичные лекарственные противоопухолевые препараты антиандрогенового ряда – производные имидазол-4-онов.

РуководительФинько Александр Валериевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2019 

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словаХимиотерапия, рак предстательной железы, андрогеновые рецепторы, персонализированная медицина, противоопухолевая активность, молекулярное моделирование, 2-тиоксо-тетрагидро-4Н-имидазол-4-он, 2-селеноксо-тетрагидро-4Н-имидазол-4-он, медь катализируемые реакции, арилирование, in vitro, in vivo, цитотоксичность, ксенографтная модель.

Код ГРНТИ31.21.00, 31.23.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
На данный момент, среди препаратов, применяющихся для терапии рака предстательной железы особое внимание уделяется ингибиторам андрогеновых рецепторов (AR). Андрогены, такие как тестостерон и особенно дигидротестостерон (ДГТ), играют важную роль в развитии и прогрессировании рака предстательной железы. Они действуют как факторы роста, стимулируя деление клеток и рост тканей. Тестостерон поступает в клетку и с помощью 5-альфа-редуктазы превращается в дигидротестостерон. При связывании стероидов андрогеновый рецептор меняет конформацию и высвобождает белки теплового шока (hsps). AR транслоцируется в ядро, где происходит димеризация, связывание ДНК и коактиваторов. Целевые гены транскрибируются (мРНК) и транслируются в белки. Ранее были найдены эффективные нестероидные антиандрогены, гидантоинового ряда "Нилутамид" (применяется в терапевтической практике с 2006 года), "Проксалутамид" (Suzhou Kintor Pharmaceuticals, в I фазе клинических испытаний), "Апалутамид" (Johnson and Johnson, в III фазе клинических испытаний) и "Энзалутамид" (Astellas), применяется в терапии рака предстательной железы с 2012 года. Препарат энзалутамид имеет значения IC50 на клеточных линиях LnCаP 11,7 mkM (клетки аденокарциномы простаты человека) и PC3 35,2 mkM (клеточные линии рака предстательной железы человека). Последний не обладает собственной гормональной активностью и его аффинность к рецепторам существенно выше чем у других нестероидных аналогов. Энзалутамид блокирует сигнальный путь андрогенового рецептора на нескольких этапах: блокирует сайт связывания андрогенов, не дает андрогеновому рецептору войти в ядро клетки и предотвращает связывание с ДНК. Это ведет к снижению пролиферации, апоптозу опухолевых клеток, и как следствие снижению размера опухоли. К настоящему моменту нами был проведен молекулярный докинг библиотеки низкомолекулярных аналогов энзалутамида и было показано, что производные 2-тиоксо-тетрагидро-4Н-имидазол-4-онов (2-тиогидантоинов) содержащие заместитель при атоме серы, могут являются эффективными антагонистами андрогеновых рецепторов. Целевые 5-арил-3-замещенные-2-тиоксоимидазолин-4-оны были получены при помощи новой реакции S-арилирования 2-тиогидантоинов борными кислотами [Tetrahedron Letters 57 (2016) 5501–5504]. При этом следует отметить, что синтетическая процедура существенно проще, чем для препарата энзалутамид. Для всех полученные соединения была исследована цитотоксичность на клеточных линиях рака предстательной железы LnCаP (AR+, клетки аденокарциномы простаты человека), PC3(AR-, клеточные линии рака предстательной железы человека), а так же на контрольных линиях Hek293 (клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека), VA13 (фибробласты легкого человека), MCF-7 (линия клеток рака молочной железы), A549 (аденокарцинома альвеолярных базальных эпителиальных клеток человека) и ЛЭЧ-4 (клетки легочного эпителия человека). Цитотоксичность найденных соединений - лидеров существенно превосходят аналогичные показатели для препарата энзалутамид (IС50 LnCAP 0.07 mkM (AR+) и не проявили цитотоксичности на клеточных линиях PC3 (не экспрессирует AR). Разница между цитотоксичностью на двух клеточных линиях на три порядка свидетельствует о высоком потенциале разрабатываемых препаратов для терапии рака предстательной железы. Следует отметить, что данный класс соединений не описан ранее в открытой литературе. В последние годы в клинической практике сформировался большой интерес к новым типам Se-содержащих терапевтических агентов. Ранее в нашей лаборатории был синтезирован набор новых селеногидантоинов с помощью удобного и универсального подхода, включающего реакцию изоселеноцианатов с различными аминами [Bioorganic & Medicinal Chemistry 24 (2016) 802–811]. Введение атома селена в молекулу биологически активного соединения приводит к появлению дополнительных антиоксидантных, противоопухолевых и противовоспалительных свойств. Мы предполагаем, что получение селенового аналога препарата энзалутамида позволит повысить его противоопухолевую активность. Для наиболее эффективных соединений будут проведено тестирование на культурах опухолевых клеток человека, культивируемых in vitro и дополнительные эксперименты in vivo на адекватных животных моделях. Особое внимание в проекте будет уделено детальному исследованию механизма действия предлагаемых препаратов. При этом планируется исследовать связывание с AR, исследовать генную экспрессию в условиях обработки культур клеток препаратами. Таким образом, проект посвящен синтезу и изучению биологических свойств новых производных имидазолон-4-онов, исследованию их механизма действия на молекулярном уровне с целью обоснования их применения для терапии онкологических патологий предстательной железы. При успешной реализации проекта, в РФ будет найден новый класс антиандрогенов. В будущем это позволит отказаться от зарубежных лекарственных средств диагностики и лечения патологий предстательной железы.

Ожидаемые результаты
- Впервые будет выполнено молекулярное моделирование и синтезирован новый класс производных 2-селено- и 2-тиогидантоинов, обладающих меньшей общей токсичностью, эффективной цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам андрогензависимого рака предстательной железы. Эти исследования позволят предсказать наиболее энергетически выгодную геометрию для образования устойчивого комплекса ингибитора андрогенового рецептора. - Будет синтезирован ряд производных имидазол-4-онов с использованием солей меди (II) в реакции С-S и С-Se арилирования с различными арил- и гетарилборными кислотами, арил- и гетарилгалогенидами, замещенных и не замещенных по третьему положению 2-тио и 2-сенгидантоинов. Проведена оптимизация и рационализация условий реакции. Все полученные соединения будут охарактеризованы комплексом физико-химических методов: ЯМР, ИК-спектроскопию, масс-спектрометрию, элементный анализ и выборочно РСА. - Выполнено in vitro тестирование коньюгатов на различных клеточных линиях. С использованием стандартного метода МТS планируется оценить цитотоксичность полученных органических лигандов и коньюгатов на примере клеточных линий LNCap и 22Rv1 (рак предстательной железы, андроген зависимый), PC3 (рак предстательной железы, не содержащие андрогеновые рецепторы), HepRG (гепатоцеллюлярная карцинома печени), HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома печени, в качестве контрольной клеточной линии, не содержавших андрогеновых рецепторов). В качестве препарата сравнения будет использовано лекарственное средство «Кстанди». Для наиболее активных соединений будет определена цитотоксичность на клеточной линии условно-нормальных фибробластов. Клеточная токсичность будет определятся с помощью МТS (3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил тетразолиумбромид) основываясь на работе [Cory A.H, Owen T.C, Barltrop J.A, Cory J.G (1991). «Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture». Cancer communications 3 (7): 207–212. ISSN 0955-3541]. - Для ряда наиболее активных соединений будет исследована их антагонистическая активность. [European Journal of Medicinal Chemistry 99 (2015) 51-66]. Это позволит определить зависимость структура – активность и выделить соединения – лидеры, которые будут рекомендованы для тестирования in vivo. - На заключительном этапе проекта для отобранных соединений - лидеров будет проведено тестирование коньюгатов in vivo, и определены потенциальный противоопухолевый эффект и острая токсичность. Будет проведено определение максимальной переносимой дозы (МПД) наилучшего по in vitro тестам соединения на мышах линий C57Bl/6, с целью изучения противоопухолевой активности соединения на перевиваемых опухолях у иммунодефицитных мышей. В зависимости от результатов экспериментов in vitro будет выбрана адекватная модель перевиваемой опухоли рака предстательной железы. - По результатам работы будет опубликовано не менее трех публикаций в высокорейтинговых журналах и отечественных изданиях. - Полученные результаты будут представлены на Российских или международных конференциях.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Целью данного этапа проекта «Высокотехнологичные лекарственные противоопухолевые препараты антиандрогенового ряда – производные имидазол-4-онов» было получение С-S и С-Se арилированных производных имидазол-4-онов с использованием арилборных кислот или арилгалогенидов в присутствии солей меди. Поставленные задачи полностью выполнены. В отчетном периоде выполнено 2D молекулярное моделирование человеческого андрогенового рецептора и близкого структурного аналога энзалутамида. В результате было определено, что все ключевые супрамолекулярные взаимодействия между молекулой и сайтом связывания сохраняются и соответствуют темплейтному интерфейсу. Значение энергетического скоринга составило в этом случае -24.4 Ккал/моль, что несколько меньше по сравнению с референсным лигандом. Видно, что сохраняется водородная связь с His874. По результатам выполненного молекулярного докинга, можно предположить, что предложенный аналог будет обладать сравнимой с темплейтной молекулой аффинностью по отношению к андрогеновому рецептору in vitro. Выполнены две магистральные задачи этого проекта. Одна из которых, это получение исходных 3-незамещенных-2-тио- и 3-замещенных-2-селеногидантоинов. Все полученные соединения имеют кристаллический вид, часть из полученных соединений ранее не была описана. Все соединения были подтверждены комплексом физико-химических методов анализа, для некоторых были сняты 77Se ЯМР спектры. Для реализации второй задачи нам необходимо было провести несколько предварительных синтезов. За основу мы взяли реакцию Чана–Лама–Эванса (Методом А)[ Tetrahedron Letters 39 (1998) 2941-2944, Tetrahedron Letters 39 (1998) 2937-2940, Tetrahedron Letters 39 (1998) 2933-2936]. После осуществления процедуры подбора растворителя и лиганда, мы проверили нескольколько реакция подтверждающие необходимость кислород воздуха в реакции, и определили границы применимости микроволнового излучения. Выход полученных соединений составил 17-85% Но, при использовании арилборных кислот с акцепторными заместителями возникли трудности. Выход полученных соединений составлял 9-15%. Для решения этой задачи мы использовали реакцию Ульмана (Метод Б) [Chemische Berichte. 1901, 34 (2): 2174–2185.]. Одна из ее модификаций представляет собой гетеросочетание арилгалогенидов в присутствии соли меди (l) [J. Org. Chem. 2004, 69, 3230–3232.]. Для использования этой методики нам необходимо было оптимизировать условия, подобрать основание и растворитель. Выход полученных соединений составил 25-80%. Таким образом, нам удалось разработать два независимых друг от друга метода получения 3-незамещенных-2-(арилтио)-имидазол-4-онов и 3-замещенных-2-(арилселанил)-имидазол-4-онов. Арилирование борными кислотами (Методом А) с донорными заместителями позволяет нам получать целевые соединения с достаточным выходом, в то время, как борные кислоты с акцпторными заместителями практически не работают. Применение арилгалогенидов (Метод Б) с донорными группами не приводит к желаемому результату - имидазол-4-онам (низкие выходы, трудоемкий процесс выделения и очистки). Наличие акцепторных групп улучшают реакционную способность арилгалогенидов, процесс контроля и обработки реакционной массы стал мене трудоемкий, что привело к хорошим выходам интересующих нас соединений. Методом А и Метод Б удачно дополняют друг друга. Нами был получен широкий ряд модифицированных 2-тио и 2-сеногидантоинов. Все полученные соединения охарактеризованы спектральными методами (ЯМР, ИК спектроскопии, масс‐спектрометрии высокого разрешения). Определены цвет кристаллов и температура плавления конечных соединений, для некоторых выполнен РСА. На этапе предварительного тестирования in vitro для всех целевых веществ было определено значение ic50. Для МТТ тестирования использовались клеточные линии рака простаты PC3 (аденокарцинома IV степени) и LnCap (полученные из метастатической простаты), рака молочной железы человека MCF7 и клеточная линия A549 аденокарциномы легких человека, а так же клеточная линия фибробластов человека VA13 и клетки HEK293T эмбриональной почкой человека. В качестве контроля использовали клетки легочного эпителия человека (ЛЭЧ-4). Результаты представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Новые отечественные противоопухолевые препараты и медицинские технологии: проблемы, достижения, перспективы» [http://www.remedium.ru/news/relis/detail.php?ID=73291]. На основании результатов предварительного тестирования, часть соединений можно отнести к категории – лидеры, т.к. они имеют схожую, а в некоторых случаях и лучше цитотоксичность чем у эталонного соединения - Энзалутамид. Работа над исследованием биологической активности продолжаются.

 

Публикации

1. Аверочкин Глеб Михайлович, Длин Егор Алексеевич, Финько Александр Валериевич, Мажуга Александр Георгиевич, Иваненков Ян Андреевич НОВЫЕ АРИЛ-ТИОГИДАНТОИНЫ, ИНГИБИТОРЫ АНДРОГЕНОВОГО РЕЦЕПТОРА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ -, - (год публикации - ).

2. Длин Е.А., Степанова С.П., Финько А.В., Скворцов Д.А., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Мажуга А.Г. (Z)-4-АРИЛИДЕН-1-АРИЛ-2-(АРИЛСЕЛАНИЛ)-1H-ИМИДАЗОЛ-5(4H)-ОНЫ – ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ИНГИБИТОРЫ АНДРОГЕНОВОГО РЕЦЕПТОРА Российский биотерапевтический журнал, 2018. Т 17. С. 26–27. (год публикации - 2018).

3. Степанова С.П., Длин Е.А., Финько А.В., Кукушкин М.Е., Салтыкова И.В., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Мажуга А.Г. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭТИЛ-2-(3-АРИЛСЕЛЕНОМОЧЕВИНЫ)АЦЕТАТОВ И (Z)-5-АРИЛИДЕН-3-АРИЛ-2-СЕЛЕНОКСОИМИДАЗОЛИН-4-ОНОВ Российский биотерапевтический журнал, 2018. Т. 17. С. 69–69. (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Были разработаны три метода S- и Se-арилирования производных 2-тио и 2-селеногидантоинов: кросс сочетание с арилбороными кислотами, катализируемое Cu(OAc)2 / 1,10-фенантролин в мягких условиях –реакция Чана–Эванса-Лама; кросс сочетание с арилиодидами, катализируемое CuI / 1,10-фенантролин в присутствии основания – реакция Ульмана; реакция ароматического нуклеофильного замещения с активированными арилгалогенидами. Исследована связь донорно-акцепторных свойств функциональных групп в присоединенных ароматических фрагментах и выходов реакции в каждом из трех методов. Было установлено, что три разработанных метода дополняют друг друга, открывая доступ к получению S- и Se-арил-2-тиогидантоинов с широким спектром заместителей. Оценку цитотоксичности проводили определяя концентрации вещества, которые вызывали гибель 50% клеток (CC50) для большинства соединений, составляли от 5 до 50 мкМ. Не было значимой специфичности токсичности в отношении отдельных раковых линий. Производные 2-тиогидантоина имеют высокую цитотоксичность с CC50 около 1 мкМ. Оценка цитотоксичности в течение короткого времени инкубации (20 ч) была использована для выбора концентраций для скрининга и нормализации активности в репортерных тестах против р53. Большинство испытанных соединений после 20 ч. обработки клеток A549 не приводит к CC50 до 25 мкМ и имеет низкую или нулевую токсичность при 6,25 мкМ. Вычислительные усилия (In silico MDM2) привели к тому, что все соединения были признаны виртуальными хитами с индексами сходства формы в диапазоне от 0,56 до 0,91. Следующий анализ выровненных конформаций показал, что исследуемые соединения сохраняют ключевые точки связывания, необходимые для индукции димеризации MDM2. Действительно, 2-арилтиогруппа может занимать гидрофобный карман, образованный остатками Leu54, Leu57, Gly58 Phe91, Val93, Ile99, также вероятно взаимодействие π-стэкинг между другими фенильными кольцами соединений и Tyr67, а также Н-связь между карбонилом гидантоиновое кольцо и Arg65. Было показано (In silico AR), что производные 2-тиогидантоина S-арила достаточно занимают сайт BF3, обеспечивая H-связь между ядром гидантоина и Glu837, Gln670. Интересно, что большинство синтезированных соединений также заполняли карман AF2, давая показатели энергии (приблизительно -5 ккал / моль), которые сравнивались с теми, которые наблюдались для связывания с BF3. Таким образом, мы предположили, что эти молекулы модулируют активность АР. Наконец, следуя результатам in silico, мы решили исследовать биологические эффекты полученных соединений в моделях на основе клеток, ассоциированных с AR и p53. В ходе выполнения исследования была установлена зависимость от концентрации, влияние синтезированных соединений и контрольного ингибитора на активность АР. Некоторые соединения лидеры оказались не активаторами, а коактиваторами AR. Но некоторые соединения лидеры оказались активаторами p53, при этом обладали низкой активностью у AR. В качестве контроля ингибирования AR использовали энзалутамид. Контролем активации p53 являлся Nutlin3a. Некоторые соединения приводили к активации р53 в присутствии Nutlin-3a. Установлена зависимость цитотоксичности и концентрации активации р53 для соединения-лидера и контрольного Nutlin3a. В результате, синтезированные библиотеки соединений были исследованы на взаимодействие с двумя молекулярными мишенями: AR и p53. Активация AR была вызвана некоторыми соединениями из-за аллостерической регуляции. Инкубация клеток в присутствии другой части целевых соединений приводит к значительной активации р53. Возникло предположение, что целью этих соединение является взаимодействие с MDM2. Таким образом, S-арилированые производные 2-тиогидантоина предлагают новую основу для синтеза библиотек биологически активных соединений. Биологическую активность библиотеки Se-арилированых производных оценивали так же in vitro. Было выявлено, что цитотоксичность некоторых соединений была неспецифична к цитотоксичности энзалутамида. Другие соединения оказывали более сильное цитотоксическое действие при низких микромолярных концентрациях. Не была заметной избирательность цитотоксичности после обработки клеточных линий раковой этиологии и нераковой этиологии в соответствии с тестированием MTT / MTS. Это отсутствие селективности аналогично используемым химиотерапевтическим агентам, таким как доксорубицин и цисплатин. Но определенный успех присутствует, т.к. продукты Se-арилироания получены впервые. Этот факт открывает дополнительные возможности для исследования данного класса соединений на других мишенях. Таким образом, продвижение новых синтетических подходов получения 5-арилиден-3-замещенных-2-(арилселанил)-имидазолин-4-онов в качестве новых цитотоксических агентов является важной задачей современной медицинской и органической химии.

 

Публикации

1. Аверочкин Г.М., Длин Е.А., Финько А.В., Скворцов Д.А., Калинина М.А., Аладинский В.А., Воробьева Н.С., Миронов А.В., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Иваненков Я.А., Мажуга А.Г. 2-Thiohydantoins S-aryl derivatives as p53 and androgen receptor effectors: three methods of synthesis ChemPlusChem is a ChemPubSoc Europe journal published by Wiley-VCH, - (год публикации - 2019).

2. Выговский А.А., Длин Е.А., Финько А.В., Степанова С.П., Иваненков Я.А., Скворцов Д.А., Миронов А.В., Зык Н.В., Мажуга А.Г., Белоглазкина Е.К. Copper-promoted C-Se Cross-Coupling of 2-selenohydantoins with Arylboronic Acids in an Open Flask ACS Comb. Sci., - (год публикации - 2019).

3. Выговский А.А., Лайков Д.Н., Финько А.В., Скворцов Д.А., Жиркина И.В., Тафеенко В.А., Зык Н.В., Мажуга А.Г., Белоглазкина Е.К., Ullmann-type C−Se Cross-Coupling in the Hydantoin Family:Synthesis, Mechanistic Studies, and Tests of Biological Activity Journal of Organic Chemistry, - (год публикации - 2020).

4. Выговский А.А., Финько А.В., Иваненков Я.А., Скворцов Д.А., Миронов А.В., Тафеенко В.А., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Мажуга А.Г. SYNTHESIS AND BIOLOGICAL EVALUATION STUDIES OF NOVEL 2-SELENHIDANTOIN DERIVATIVES CONTAINING SE-ARYL MOIETY AS AR INHIBITORS WITH ANTICANCER ACTIVITY Chemistry of Heterocyclic Compounds, - (год публикации - 2019).

5. Длин Е.А., Выговский А.А., Финько А.В., Белоглазкина Е.К., Мажуга А.Г. СИНТЕЗ И БИОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 2-СЕЛЕНОКСО-ТЕТРАГИДРО-4Н-ИМИДАЗОЛ-4-ОНОВ – ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВОПУХОЛЕВЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ -, - (год публикации - ).

6. Финько А.В., Скворцов Д.А., Лайков Д.Н., Аверочкин Г.М., Длин Е.А., Калинина М.А., Аладинский В.А., Воробьева Н.С., Миронов А.В., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В, Иваненков Я.А., Мажуга А.Г. Synthesis and biological activity of 5-aryliden-2-thiohydantoin S-aryl derivatives Bioorganic Chemistry, - (год публикации - 2020).


Возможность практического использования результатов
Результаты проекта возможно использовать в качестве технологии разработки новых адресных препаратов для диагностики и лечения рака предстательной железы. Разработанная синтетическая схема позволяет вводить в исследуемые структуры различные заместители, позволяющие улучшить растворимость в биологической среде, что способствует созданию различных фармацевтических композиций. .