КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 17-73-10417
НазваниеНанокристаллический диоксид церия, допированный гадолинием: синтез, коллоидная стабильность в биологических средах и перспективы биомедицинского применения.
РуководительПопов Антон Леонидович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, Московская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2017 - 06.2019 |
Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-405 - Наноструктуры и кластеры. Супрамолекулярная химия. Коллоидные системы.
Ключевые словананокристаллический диоксид церия, гадолиний, коллоидные золи, кислородная нестехиометрия, нанобиоматериалы, антиоксидантная актвивность
Код ГРНТИ34.17.00
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Одним из наиболее перспективных подходов в разработке новых эффективных агентов для тераностики социально-значимых заболеваний является использование наночастиц оксидов металлов, в частности диоксида церия. Ранее показано, что наночастицы диоксида церия (СеО2) способны выступать и как радиопротектор, и как радиосенсибилизатор, при этом основными параметрами, определяющими вектор их действия, является рН клеточного окружения и мощность использованного ионизирующего излучения (Briggs et al, 2013). Более того, наночастицы СеО2 способны проявлять самостоятельную избирательную токсичность в зоне опухоли, что обусловливает их высокий потенциал в терапии онкологических заболеваний. Вместе с тем сложность визуализации ультрамалых наночастиц СеО2 ограничивает возможность контроля их локализации в организме, в связи с чем возникает необходимость их дополнительной функционализации.
В рамках заявленного проекта будет проведен синтез коллоидных растворов наночастиц СеО2, допированных ионами гадолиния, что обеспечит повышение уровня их кислородной нестехиометрии (и, соответственно, редокс-активности) и возможность их визуализации с помощью МРТ. Будет проанализирована возможность использования различных стабилизаторов (цитрат натрия, полиакриловая кислота, декстран) для оценки влияния коллоидного окружения наночастиц на их агрегативную устойчивость в биологических средах, внутриклеточную локализацию и направленность действия в различных условиях микроокружения. Стабилизаторы, имеющие повышенную тропность к зоне ангиогенеза (например, декстран), позволят специфически усиливать сигнал МРТ злокачественных новообразований, а маркеры – визуализировать доставку наночастиц к эндотелиальным опухолевым клеткам.
Впервые будет проведен комплексный анализ физико-химических характеристик и биологической активности наночастиц диоксида церия, допированного гадолинием, на различных моделях in vitro. Будет проведено исследование влияние типа оболочки, заряда поверхности, размера наночастиц на метаболическую активность нормальных и трансформированных клеток человека, их внутриклеточную локализацию и время выведения.
Комплексное исследование физико-химических характеристик синтезированных золей позволит отобрать наиболее перспективные варианты синтеза нового типа тераностических препаратов, а результаты цитологических тестов in vitro определят вектор дальнейших исследований и максимально приблизят к первой стадии доклинических исследований.
Ожидаемые результаты
В настоящее время, идет тенденция к увеличению больных онкологическими заболеваниями. За последние 10 лет прирост по онкологическим заболеваниям, по разным данным, составил около 15%, по данным Всемирной организации здравоохранения. Говоря о статистике в онкологии, нельзя обойти показатель смертности — онкологические заболевания уносят каждый год не менее 300 тыс. жизней только в России (и с каждым годом эта цифра только растет), и в течение следующих 5–7 лет, по прогнозам ВОЗ, смертность из–за онкологических заболеваний выйдет на первое место в мире по причине смертей (в настоящее время на первом месте стоят сердечно–сосудистые заболевания). Если взять данные международного агентства по изучению рака и сравнить данные о заболевших в 2000 году и в 2015 году, мы увидим огромную разницу в результатах. Злокачественными опухолями в 2000 году в мире заболели 10 млн. человек, а умерло около 8 млн. человек. В 2015 году число заболевших стало 20 млн. человек, умерших около 13 млн. (Источник: http://worldofoncology.com)
Такая статистика говорит не только об увеличивающемся количестве случаев онкологических заболеваний среди населения, но и об отсутствии на сегодняшний день эффективных способов диагностики и терапии злокачественных новоообразований, в связи с чем заявленный проект по разработке подходов к созданию нового уникального тераностического препарата является весьма актуальным.
В рамках проекта будет проведен синтез и анализ физико-химических характеристик биологически-совместимых золей наночастиц СеО2, допированного гадолинием.
Анализ физико-химических характеристик синтезированных золей будет включать:
1. Просвечивающая электронная микроскопия, рентгеноструктурный и элементный анализ.
2. УФ-видимая спектроскопия
3. Анализ гидродинамического радиуса и дзета-потенциала наночастиц в различных биологических средах (фосфатно-солевой буфер, культуральная среда, культуральная среда с сывороткой)
Антиоксидантные и биокаталитические свойства наночастиц СеО2 можно рассматривать как основу для создания новых терапевтических и профилактических средств защиты клетки. Вместе с тем существует ряд работ, демонстрирующих токсические эффекты наночастиц СеО2 в моделях in vitro и in vivo (Frieke К. et al, 2015, Pulido-Reyes G. et al 2015), которые связывают с их способностью генерировать АФК за счет их редокс-активной поверхности (Park et al. 2008, Kumari et al. 2014). В связи с этим, основным в определении перспектив применения наночастиц СеО2 в биомедицинских технологиях является вопрос биобезопасности, в том числе вопрос вопроса клиренса (Yang S. et al, 2013, Li R. et al,2015, Rui Q. et al, 2013). Форма, размер, кристалличность, заряд поверхности являются ключевыми физико-химическими характеристиками наночастиц, обуславливающими их биологическую активность (Shin S. et al, 2015, Ould-Moussa et al. 2014, Kim Y. et al,2014). Данные параметры зависят от схемы и условий синтеза, природы использованных прекурсоров и сурфактантов (Asati A. 2010, Dahle J., 2015). В связи с этим каждая новая схема синтеза наночастиц СеО2 требует проведения комплексной оценки их агрегативной стабильности в различных средах, цитотоксичности и биологической активности в системах in vitro.
Комплексное скрининговое исследование метаболической активности, редокс-статуса и жизнеспособности культур клеток будет проведено на нормальных и трансформированных культурах клеток (первичные фибробласты мыши, МСК человека, линии клеток MNNG-Hos, Hep-2 и MCF-7) следующими методами:
1. МТТ тест
2. ЛДГ тест
3. Live/dead тест
4. Комета-тест
5. Анализ генотоксичности с использованием красителя Hoechst 333342
6. Анализ митохондриального потенциала с использованием красителя JC-1
7. Анализ состояния цитоскелета и миграционной активности после интеграции наночастиц в цитоплазму.
8. Анализ профиля экспрессии генов методом ПЦР-РВ,ответственных за окислительный стресс, пролиферацию и дифференцировку.
9. Исследование механизмов эндоцитоза и экзоцитоза наночастиц с использованием селективных ингибиторов.
Будет проведено исследование оболочки наночастиц диоксида церия, допированного ионами гадолиния, и их концентрации на параметры спин решеточной релаксации при анализе сигналов МРТ.
Приведенный выше перечень основных результатов НИР соответствует мировому уровню. Впервые будут получены биосовместимые агрегативно-устойчивые золи нанодисперсного диоксида церия, допированного гадолинием, обладающие высокой антиоксидантной активностью и контрастирующими свойствами в МРТ. Информации о подобных биосовместимых тераностических агентах на основе нанокристаллического диоксида церия в отрытых источниках не встречается. Аналогичный комплекс исследований ранее не проводился ни в России, ни за рубежом.
Результаты, полученные в рамках выполнения проекта, могут лечь в основу создания нового класса высокоэффективных селективных радиопротекторов/радиосенсибилизаторов (тераностических препаратов) для клинического использования в терапии онкологических заболеваний.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках выполнения 1 этапа проекта с использованием полиольного и гидротермально-микроволнового методов синтеза получено 5 типов нанодисперсных золей диоксида церия, допированных гадолинием. В качестве стабилизаторов использовано несколько типов ПАВ: цитрат, поливинпирролидон, декстран. Проведен комплексный анализ физико-химических характеристик полученных образцов методами энергодисперсионной спектроскопии, спектроскопии характеристических потерь энергии электронов, просвечивающей электронной микроскопии, динамического светорассеяния, определены значения дзета-потенциала, а также проведен анализ функциональных характеристик синтезированных образцов наночастиц путем оценки их антиоксидантной активности и времен спин-решеточной релаксации.
Результаты анализа среднего размера наночастиц при разведении в различных растворителях подтвердили высокую агрегативную устойчивость синтезированных образцов при их разведении в деионизованной воде и фосфатно-солевом буфере. При этом разведение в культуральной среде также лишь незначительно увеличивало средний размер наночастиц. При добавлении образцов в среду DMEM/F12, содержащую сыворотку, наблюдается стабилизация размеров наночастиц. Поскольку цитрат-ионы, на поверхности наночастиц обеспечивают отрицательный дзета-потенциал частиц можно предположить, что фактором, стабилизирующим размер наночастиц, являются белки сыворотки, адсорбируемые на их поверхности.
Анализ седиментационной устойчивости водных золей диоксида церия, допированного гадолинием, показал, что большинство синтезированных образцов (5 из 6) сохраняют высокую стабильность, однако через 90 и 170 суток происходит агрегация частиц до 50-80 нм.
Проведен анализ антиоксидантной активности синтезированных образцов путем оценки уровня АФК в суспензиях наночастиц после их генерации под воздействием рентгеновского излучения. Показано, что большинство синтезированных образцов обладает ярко выраженной антиоксидантной активностью, снижая уровень пероксида водорода с начальных значений (400 нМ) до 100-150 нМ. Анализ образования гидроксильного радикала после воздействия рентгеновского излучения на суспензии наночастиц показал также, что все синтезированные образцы проявили выраженную способность снижать уровень гидроксильного радикала.
Проведен анализ Т1-релаксационной активности синтезированных образцов наночастиц в условиях МРТ, которая для наиболее перспективных образцов составил 3,68 и 7,004 (мМ-1с-1). Получены данные о зависимости скорости релаксации от концентрации наночастиц для всех типов синтезированных образцов.
Публикации
1. А.Л. Попов, И.В. Савинцева, Е.А. Мысина, А.Б. Щербаков, Н.Р. Попова, О.С.Иванова, В.К. Иванов Cytotoxicity analysis of gadolinium doped cerium oxide nanoparticles on human mesenchymal stem cells NANOSYSTEMS: PHYSICS, CHEMISTRY, MATHEMATICS,, - (год публикации - 2018)
2. Попов А.Л., Попова Н.Р., Гоулд Д., Щербаков А. Б., Сухоруков Г.Б., Иванов В.К. Ceria nanoparticles-decorated microcapsules as a smart drug delivery/protective system: Protection of encapsulated P. pyralis luciferase ACS Appl. Mater. Interfaces, 10, 17, 14367-14377 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1021/acsami.7b19658
3. А.Л. Попов, А.Б. Щербаков, Н.М. Жолобак, А.Е.Баранчиков, В.К. Иванов Cerium Dioxide Nanoparticles as Third-Generation Enzymes (Nanozymes) Nanosystems: physics, chemistry, mathematics, 8 (6), P. 760–781 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.17586/2220-8054-2017-8-6-760-781
4. Попов А.Л., Савинцева И.В., Попова Н.Р., Иванов В.К. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОБЕЗОПАСНОСТИ ЦИТРАТ-СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ, ДОПИРОВАННЫХ ГАДОЛИНИЕМ, IN VITRO. Сборник материалов Третьего междисциплинарного молодежного научного форума с международным участием «Новые материалы», стр. 798-799 (год публикации - 2017)
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках данного этапа выявлена корреляционная зависимость между физико-химическими свойствами синтезированных образцов наночастиц и их токсичностью в отношении нормальных и трансформированных клеточных культур. Особое внимание на данном этапе выполнения проекта уделялось изучению механизмов цитотоксического действия наночастиц Ce0,8Gd0,2O2-х, учитывая выявление новых данных о побочных эффектах для клинически одобренных МРТ-контрастов, в частности, депонировании гадолиния в мозге и возможном развитии системного нефрогенного фиброза. Было выявлено, что некоторые из синтезированных образцов крайне не устойчивы в биологическом окружении и высвобождают в культуральную среду свободные ионы гадолиния, которые становятся причиной развития токсического действия образца, через индукцию окислительного стресса. В частности, полиольный синтез наночастиц в кипящем триэтиленгликоле, оказался наиболее неудачным, ввиду высокой степени токсичности получаемых образцов в отношении не только трансформированных клеточных культур, но и нормальных клеток (МСК человека). Уже через 24 часа инкубации с наночастицами наблюдалось ингибирование пролиферативной и миграционной активности МСК человека, а также повышение уровня внутриклеточных АФК, снижение митохондриального потенциала, снижение уровня дегидрогеназной активности и появление значительного количества апоптотических клеток. Также стоит отметить, что наночастицы, полученные по данной методике, обладали гемолитической активностью.
Между тем стоит отметить, что наиболее оптимальным (биосовместимым) оказался золь, полученный гидротермально-волновым способом, где в качестве стабилизатора был использован цитрат аммония. Данный тип наночастиц не проявлял цитотоксического действия в отношении нормальных клеток даже в высоких концентрациях (5 мг/мл), в то время как незначительно снижал жизнеспособность трансформированных клеток линии MCF-7.
Стоит отметить, что трансформированные клеточные кульутры ( U-251, MNNG/Hos, MCF-7) были более чувствительны к высоким концентрациям наночастиц (выше 2.5 мг/мл) по сравнению с нормальными клетками, значительно снижая уровень их жизнеспособности через 72 часа сокультивирования.
Анализ механизмов эндоцитоза с использованием селективных фармакологических ингибиторов позволил выявить механизмы и тип эндоцитоза всех синтезированных образцов, а также определить их внутриклеточную локализацию с использованием селективных флуоресцентных трекеров.
Проведенный анализ уровня экспрессии 96 отобранных генов, ответственных за развитие, модуляцию и подавление состояния окислительного стресса, показал, что образцы наночастиц, синтезированные методами «мягкой химии», оказывают незначительное влияние на уровни мРНК проанализированных генов, в то время как наночастицы, полученные по полиольной схеме, в низких концентрациях (0.1мг/мл) активировали кластеры генов, кодирующих антиоксидантные ферменты, а высоких концентрациях (5 мг/мл) и вовсе тотально подавляли экспрессию практически всей панели анализируемых генов, что на клеточном уровне выражалось в развитии апоптотических процессов и приводило гибели клеток.
Проведенный анализ редокс-активности наночастиц Ce0,8Gd0,2O2-х подтвердил их зависимость от рН микроокружения. В частности, в буферных растворах с рН-6.0 проявлялись ярко выраженные прооксидантные свойства, что выражалось в увеличении генерации пероксида водорода до 620 нМ после облучения рентгеновским излучением суспензий наночастиц по сравнению с необлученными контрольными (~400нМ), в то время как в суспензиях с нейтральными или слабощелочным уровнем рН (7.2 и 8.0) проявлялись антиоксидантные свойства, что выражалось в снижении концентрации пероксида водорода в облученных суспензиях наночастиц до 200нМ и ниже.
Таким образом, полученные на втором этапе выполнения проекта результаты позволили отобрать наиболее оптимальные схемы синтеза наночастиц и выявить молекулярные механизмы цитотоксичсекого действия синтезированных наночастиц и их внутриклеточной активности в условиях воздействия рентгеновского излучения. Были выявлены механизмы индукции окислительного стресса под действием наночастиц, определена их внутриклеточная локализация, проведена количественная оценка уровня митохондриального потенциала, внутриклеточных АФК и уровня транскриптов мРНК после инкубации с наночастицами.
Публикации
1. А.Л. Попов РАЗРАБОТКА НОВОГО ТЕРАНОСТИЧЕСКОГО АГЕНТА НА ОСНОВЕ НАНОКРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ДИОКСИДА ЦЕРИЯ, ДОПИРОВАННОГО ГАДОЛИНИЕМ. Сборник материалов XXVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2019», - (год публикации - 2019)
2. А.Л. Попов, Иванова О.С., Ермаков А.М., Савинцева И.В., Колманович Д.Д., Аккизов А.Ю., Попова Н.Р., Баранчиков А.Е., Шекунова Т.О., В.К. Иванов НОВЫЙ ТЕРАНОСТИЧЕСКИЙ АГЕНТ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ, ДОПИРОВАННЫХ ГАДОЛИНИЕМ СБОРНИК ТЕЗИСОВ 23-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», стр.105 (год публикации - 2019)
3. Попов А.Л., Щербаков А.Б., Попова Н.Р., Иванов В.К. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НОВОГО ТЕРАНОСТИЧЕСКОГО АГЕНТА НА ОСНОВЕ НАНОКРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ДИОКСИДА ЦЕРИЯ Сборник материалов XIV Международного междисциплинарного Конгресса «НЕЙРОНАУКА ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И ПСИХОЛОГИИ» (4-10 июня 2018 г.), стр 377 (год публикации - 2018)
4. - Наночастицы диоксида церия защищают микрокапсулы с лекарствами от агрессивных веществ. Пресс-служба РАН, - (год публикации - )
5. - Наночастицы защитят лекарства от агрессивного окисления Индикатор — информационно-сервисный портал, посвященный науке, - (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
не указано