Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе реализации проекта в 2017 – 2018 гг. проведены исследования по разработке протоколов синтеза гибридных капсул для эффективного инкапсулирования биологически активных соединений (мРНК зеленого флуоресцентного белка (GFP), инструментов геномного редактирования, микро-РНК против вируса гриппа) с последующей оценкой биологической активности инкапсулированных веществ на клеточных моделях in vitro. Проведен комплексный анализ структуры и морфологии полученных гибридных капсул с использованием электронной микроскопии, конфокальной лазерной микроскопии и т.д. Были подобраны оптимальные условия синтеза гибридных капсул с использованием золь-гель технологии. Использование золь-гель технологии в синтезе гибридных капсул позволяет значительно повысить концентрацию инкапсулированного лекарственного препарата. Установлено, что максимальный процент (~ 96 %) клеток (HEK293T), захвативших капсулы, наблюдается при соотношении капсул к клетке, равном 10 к 1. При этом капсулы локализуются в цитоплазме абсолютного большинства (до 92%) клеток в исследованный интервал времени (4-24ч). Также следует отметить, что капсулы не обнаруживают цитотоксического действия при концентрации до 10 капсул на клетку. Эффективность внутриклеточной доставки в клетки А549 с помощью капсул значительно превосходит эффективность доставки полиэтиленимином (на 70%), Lipofectamine 2000 (на 45%), Lipofectamine RNAiMAX (на 30%). Получены данные по внутриклеточной динамике и трансфекционной способности гибридных капсул, относящуюся к теме нашего проекта. Результаты были опубликованы в высокорейтинговом журнале «ACS Biomaterials Science and Engineering» (Muslimov et al., 2017). Получены данные по трансфекции в HEK293T клетках с использованием капсул, содержащих мРНК и плазмиду репортерного гена eGFP. Гибридные капсулы более эффективны в доставке генетического материала, чем в случае использования Metafectene Pro (для мРНК – 49 % клеток экспресируют eGFP; для плазмиды – 25 % клеток экспресируют eGFP). Была проведена инкапсуляция in situ одновременно нескольких миРНК (PA-1630, NP- 717 и NS-777). Было проведено сравнение ингибирования репликации вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) в клетках A549 при инкубации клеток в течение 24ч с капсулами, содержащими коктейль из трёх перечисленных антивирусных миРНК. Установлено, что через 72 ч после заражения клеток, уровень вирусного белка NP достоверно снижался по сравнению с контролем в случае воздействия каждой из использованных антивирусных миРНК, однако комбинированный сайленсинг трёх вирусных генов обладал существнно большей эффективностью. Были проведены исследования по оценке эффективности редактирования с использованием капсул, содержащих плазмиду CRISPR-Cas9 против гена dTomato. Результаты данной работы по внутриклеточной доставке генетического материала были опубликованы в высокорейтинговом журнале «Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine» (Timin et al., 2018), а также иммеются ряд информационных публикаций в сети Интернет (http://tass.ru/nauka/4919541 ; https://www.vesti.ru/doc.html?id=2939332). Были синтезированы магнитоуправляемые гибридные капсулы, содержащие мРНК репортерного гена eGFP. Показано, что использование магнитных капсул после их интернализации мезенхимальными стволовыми клетками позволяет разделить трансфицированные клетки от не трансфицированных под действием магнитного поля с помощью коммерчески доступной системы miniMACS для магнитной сепарации клеток. Результаты были опубликованы в высокорейтинговом журнале «ACS Biomaterials Science and Engineering» (Muslimov et al., 2017). Была опублизована статья по использованию гибридных капсул для модификации различных релевантных клеточных культур (Timin et al., 2018).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 – 2019 гг. были проведены исследования, направленные разработку мультифункциональных платформ с включенными гибридными капсулами, обладающих различными вариантами высвобождения биологически активных веществ. Была исследована биосовместимость таких платформ. Кроме того, получены данные о распределении капсул после их ингаляции in vivo на животной модели мыши и их эффективности против вируса гриппа H1N1 в случае, когда капсулы содержали противовирусные микро-РНК. Были разработаны методики модификации МСК гибридными капсулами, содержащие противоопухолевый препарат (винкристин), а также исследовано распределение и движения МСК с включенными капсулами in vitro и in vivo. В результате реализации проекта отработаны способы синтеза новых полимерных подложек на основе поли-3-гидрокибутирата (ПГБ), а также способы их функционализации с использованием микрокапсул. Было исследовано влияние различных физических (ультразвук, свет) и химических (ферменты) стимулов на кинетику высвобождения инкапсулированых биологических соединений (на примере флуоресцентного красителя - флуоресцеина) с поверхности полимерных подложек, модифицированных капсулами. Также исследована биосовместимость и биодеградация полимерных подложек, модифицированных капсулами, в физиологических условиях in vitro. Результаты были опубликованы в высокорейтинговом журнале «ACS Applied Materials and Interfaces» (Timin et al., 2018). Совместно с научной группой НИИ гриппа проведены исследования по распределению капсул после их интраназальной ингаляции на модели мыши. В ходе выполнения проекта разработаны протоколы модификации стволовых клеток (МСК) капсулами как перспективных клеточных носителей лекарственных препаратов, а также оценена токсичность капсул для МСК. Было произведено сравнение токсичности пустых капсул и капсул, загруженных противоопухолевым препаратом – винкристином. Установлено, что капсулы, содержащие винкристин, оказывают лишь незначительное влияние на жизнеспособность МСК, что дает возможность рекомендовать данные капсулы для дальнейших исследований. Изучено влияние капсул на спонтанную миграцию МСК с использованием экспериментальной аналитической системы Cell-IQ на основе оптической микроскопии. Результаты, полученные из экспериментов по спонтанной миграции, в достаточной мере доказывают, что способность к миграции клеток зависит от размеров самих капсул, а также от соотношения количества капсул к клетке. В случае экспериментов по направленной миграции установлено, что как пустые капсулы, так и капсулы, содержащие винкристин не оказывают какого-либо значительного влияния на способность МСК к инвазии и направленной миграции по градиенту концентрации хемоаттрактанта SDF-1. Далее была продемонстрирована направленная миграция МСК с интернализированными капсулами in vivo на модели глиобластомы, а также проведена оценка эффективности и токсичности новой лекарственной формы на основе МСК клеток, обладающих тропизмом к опухолям, с включенными гибридными капсулами. Из полученных экспериментальных данных установлено, что МСК с ассоциированными капсулами способны доставлять винкристин внутрь опухолевого тумороида, вызывая гибель опухолевых клеток в тумороиде. Стоит отметить, что жизнеспособность опухолевых клеток в тумороиде значительно ниже в случае МСК с ассоциированными капсулами, чем для индивидуального препарата – винкристина. Результаты данного исследования были опубликованы в высокорейтинговом журнале «ACS Applied Materials and Interfaces» (Timin et al., 2019).