Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исследования в рамках данного междисциплинарного проекта по комплексному изучению разнообразных галактофуранозилсодержащих олигосахаридов включали в себя следующие основные направления: - ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ГЛИКОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Химические исследования были направлены на получении новых данных о механизме открытой нами в ходе реализации данного проекта уникальной реакции в химии углеводов – пиранозид-фуранозидной перегруппировки (ПФП), а также на расширение области ее практического применения для синтеза разнообразных биологически востребованных олигосахаридов. В частности, в 2017 году было впервые систематически изучено протекание ПФП на незащищенных олигосахаридных субстратах включая ди- и трисахариды, различающихся типом гликозидных связей [(1→3) или (1→6)] и конфигурацией аномерных центров (alpha, beta). В результате данного исследования была продемонстрирована возможность эффективной трансформации пиранозного остатка, находящегося не только на «восстанавливающем» конце олигосахаридной цепи, но и на «невосстанавливающем». Специально для осуществления пиранозид-фуранозидной перегруппировки на малоактивных субстратах (например, на олигосахаридах, в которых требуется перегруппировать центральный невосстанавливающий остаток) были отработаны оптимизированные условия, заключающиеся в использование систем растворителей и эффективных промоторов, позволяющие значительно ускорить ПФП и избежать образования нежелательных продуктов расщепления гликозидных связей. В 2017 году был впервые осуществлен синтез целого ряда новых фуранозидсодержащих олигосахаридных структур, заявленных в плане работ по проекту, и востребованных для физико-химических и гликобиологических исследований. Все синтетические схемы были основаны на ПФП, а также на других оригинальных синтетических разработках, предложенных в ходе выполнения данного проекта. С частности, был проведён препаративный синтез незащищенных спейсерированных производных, отвечающих повторяющемуся звену галактана III бактерии Klebsiella pneumoniae, трисахаридному разветвленному фрагменту капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 33F, фрагментам полисахаридов из клеточной стенки гриба Aspergillus fumigatus. Синтезы новых олигосахаридов осуществлялись с использованием универсальных синтетических блоков, полученных авторами данного проекта ранее. Исходя из синтезированных олигосахаридов были получены конъюгаты с биотином и вакцинным белком-носителем CRM-197. Данные препараты были использованы в физико-химических, структурных и гликобиологических исследованиях. Так, конъюгаты с белками носителями использованы в качестве иммуногенов для генерации поликлональных и моноклональных антител, а биотинилированные производные использованы для создания тематических гликорядов (от английского «GlycoArray») для анализа эпитопной специфичности антител методами иммуноферментного анализа. Кроме того, синтезированная обширная библиотека олигосахаридных лигандов, родственных галактоманнану из A. fumigatus, позволила впервые обобщить их спектральные ЯМР данные и вычислить эффекты гликозилирования, необходимые для расчета спектральных характеристик. Это позволило сформулировать основные подходы к анализу ЯМР спектров природных полисахаридов, основанные на характеристичных сигналах – структурных репортерах (от английского “Structure reporting signal”). Эффективность данного подхода была продемонстрирована на примере анализа образца галактоманнана из A. fumigatus. Методами теоретического компьютерного моделирования и с помощью экспериментальных ЯМР методик были выявлены конформационные параметры гликозидных связей, входящих в состав разветвленных фрагментов, присутствующих в полисахаридах бактерий S. pneumoniae и K. pneumoniae. Были выявлены основные конформации исследуемых полисахаридных цепей, определяющие их пространственное строение и подвижность. Данные результаты необходимы для моделирования структуры комплексов изучаемых углеводных структур с их биологическими рецепторами и антителами при интерпретации результатов гликобиологической части данного проекта. В рамках гликобиологической части данного проекта в 2017 году были исследованы на молекулярном уровне процессы углевод-белкового взаимодействия с участием фуранозидсодержащих полисахаридов. Так, методами молекулярного докинга было изучено связывание с лизоцимом человека синтетических олигосахаридных производных, отвечающих фрагментам полисахаридов бактериальных и грибковых патогенов – галактанов I и III K. pneumoniae, капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 33F, дигеторогликана E. faecalis, галактоманнана Aspergillus. В результате проделанных работ было установлено, что галактофуранозидные остатки критически важны для удерживания лиганда в полости связывания белка. Получение синтетических фрагментов галактоманнана, являющихся ключевыми иммунодетерминантам природного полисахарида, позволило исследовать на молекулярном уровне механизм активации клеточного иммунитета. Был определен профиль цитокинового ответа макрофагов, при стимуляции фрагментами галактоманнана, являвшийся преимущественно провоспалительного типа Th1 со значительным увеличением высвобождения TNFα, IL-6 и IL-12. Полученные в рамках данного проекта синтетические иммуногены были переданы в Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, где под руководством д.х.н. Н.В. Тикуновой была получена серия высокоспецифичных моноклональных антител, которые способны специфически распознавать галактоманнан, продуцируемый A. fumigatus. Изучение свойств данных антител и в частности выяснение из эпитопной специфичности было осуществлено в ИОХ РАН в рамках данного проекта. Полученные результаты позволяют рассматривать их как перспективную основу для разработки диагностических наборов, превосходящих по своей специфичности существующие аналоги. Их высокая антигенная специфичность продемонстрирована при использовании гликоряда на основе синтезированных олигосахаридных лигандов. При использовании полученного моноклонального антитела 7В8 создан прототипный диагностикум сэндвичего типа для определения галактоманнана в сыворотке и лаваже для выявления на ранних стадиях смертельного заболевания - инвазивного аспергилеза. Сравнение прототипного диагностикума и зарубежного коммерческого продукта Platelia Aspergillus Ag (производитель - BioRad) показало, что отечественных диагностический набор имеет большую чувствительность, чем импортный коммерческий продукт. Созданный диагностический набор передан на испытания в центрах глубоких микозов. Их результаты будут рассмотрены в отчете по проекту за 2018 год.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследования в рамках данного междисциплинарного проекта по комплексному изучению разнообразных галактофуранозилсодержащих олигосахаридов включали в себя следующие основные направления: - ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ГЛИКОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ включали в себя всесторонние исследования открытого нами уникального процесса в органической химии, не имеющего аналогии – пиранозид-фуранозидной перегруппировки (ПФП). С привлечением ab initio расчетов было проведено изучение механизма и установление движущей силы данного процесса. Была продемонстрирована решающая роль электростатического отталкивания в снижении полной энергии сульфатированных фуранозидов по сравнению с соответствующими пиранозидами. Данный эффект был отмечен на глюко-, галакто-, ксило-, арабинопроизводных, но отсутствовал для маннозидов, что полностью объясняет экспериментально наблюдаемую реакционную способность. Кроме того, важной методологической находкой является обнаруженная в 2018 году перегруппировка альфа-фуранозидов в их бета-изомеры в ходе промотируемого кислотой сульфатирования. Аномеризация данного типа наблюдается в качестве побочной реакции при проведении пиранозид-фуранозидной перегруппировки в жестких условиях, однако может быть осуществлена направлено для целого ряда альфа-фуранозидных субстратов. Впервые препаративно осуществлена уникальная реакция пиранозид-фуранозидной перегруппировки «невостанавливающего» моносахаридного звена, расположенного внутри избирательно защищенной углеводной последовательности. Данное превращение, затрагивающее центральный остаток в трисахариде, практически не имеет аналогов в современной химии углеводов, и представляет огромный теоретический и практический интерес. В 2018 году были проведены масштабные синтетические работы по получению фуранозидсодержащих олигосахаридов, родственных полисахаридным антигенам опасных патогенов: бактерий Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis и Streptococcus pneumoniae, а также грибков Aspergillus fumigatus и Candida albicans. В частности были синтезированы структуры, родственные O-антигенам патогенной бактерии Klebsiella pneumoniae - галактаны I, II и III. Целевые соединения были получены по блочной схеме и содержали от одного до трех повторяющихся звеньев. Исходя из них, была получена библиотека биотинилированных лигандов, которые в дальнейшем были использованы для построения тематического GlycoArray – инструмента иммунологического типирования штаммов возбудителя, который позволит выявлять особо опасные антибиотикорезистентные типы патогена у пациентов. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ включали в себя теоретическое исследование механизма и движущей силы пиранозид-фуранозидной перегруппировки, конформационный анализ углеводных эпитопов, относящихся к фуранозидсодержащим полисахаридам опасных патогенов, а также исследование углевод-белкового взаимодействия методами молекулярного докинга. В 2018 году были получены и обобщены данные о пространственном строение сульфатированных углеводов и, в частности, сульфатированных фуранозидов. Методами молекулярной динамики осуществлено моделирование пространственного строения крупных фрагментов полисахарида галактоманнана грибкового патогена Aspergillus fumigatus. Теоретически рассчитанные параметры ЯМР (относительные ядерные эффекты Оверхаузера и константы спин-спинового взаимодействия) для всех смоделированных соединений хорошо совпадали с экспериментально измеренными величинами. Собранные за все время выполнения проекта данные о пространственном строении и конформационной подвижности олигосахаридов, структурно родственных фуранозидсодержащим полисахаридам опасных патогенов, были использованы для исследования связывающей активности лизоцима методами молекулярного докинга. Данные теоретические результаты были подтверждены методами поляризации флюоресценции и ELISA на тематическом GlycoArray, построенном из соответствующих олигосахаридных лигандов. Способность лизоцима человека проявлять лектиновые свойства была также использована для инкапсуляции инсулина с целью разработки новых лекарственных форм, обеспечивающих высокую биодоступность лекарственного препарата. ГЛИКОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в 2018 году включали масштабные работы по скринингу моноклональных и поликлональных антител, а также антител, содержащихся в клинических сыворотках пациентов с бактериальными и грибковыми заболеваниями. Так, с использованием тематического GlycoArray, построенного из олигосахаридных лигандов, родственных галактоманнану Aspergillus fumigatus, была определена эпитопная специфичность антител, используемых в коммерческом наборе Platelia Aspergilus Ag (BioRad). В результате проведенных исследований было выяснено, что минимальный фрагмент антигена, распознающийся данным антителом, представляет собой только дисахарид бета-D-Galf(1→5)-бета-D-Gal, а не тетрасахарид, как это считалось ранее. Наличие аналогичной углеводной последовательности в составе полисахаридных антигенов других микроорганизмов, в том числе в составе бактерий нормальной микрофлоры человека, приводит к снижению специфичности теста и появлению ложноположительных результатов. Таким образом, использование моноклональных антител, распознающих более крупный углеводный эпитоп позволит существенно повысить эффективность данного теста. Был проведен скрининг клинических сывороток пациентов с различными видами аспергилеза, было показано, что у больных с аллергическим бронхолегочным аспергиллезом (n = 68) и хроническим легочным аспергиллезом (n = 32) существенно повышен титр антител к определенным синтетическим олигосахаридам, родственным галактоманнану, по сравнению с контрольной группой пациентов (n = 22). Таким образом, данные синтетические антигены являются перспективной основой для разработки востребованных серологических средств диагностики инвазивного аспергилеза. Синтезированные в ходе данного проекта олигосахариды, родственные бактериальным и грибковым патогенам (Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Candida albicans) были также использованы для создания тематических гликорядов. На примере тематического GlycoArray, построенного из олигосахаридных лигандов, родственных O-антигенам K. pneumoniae, было продемонстрирована эффективность данного инструмента для типирования возбудителя. Серологические диагностикумы данного типа крайне востребованы для выявления мультирезистентных штаммов патогенных микроорганизмов. Кроме этого, показано, что полученные олигосахаридные лиганды позволяют создать на своей основе первые в своих классах конъюгированные вакцины. Созданный в результате исследований по проекту прототип диагностического набора для выявления опасного заболевания аспергилеза был изучен с использованием клинических сывороток пациентов в специализированных медицинских центрах по изучению глубоких микозов. В результате была продемонстрирована отличная (коэффициент корреляции = 0.95) корреляция между результатами, полученными с помощью разработанного прототипа, и наиболее широко сегодня используемым набором для диагностики инвазивного аспергилеза - Platelia Aspergilus Ag. Дополнительно к вышеупомянутому тесту на галактоманнан, в ходе реализации проекта был создан прототип диагностического набора, направленного на обнаружение бета-глюкана, общего грибкового антигена. Данный набор крайне востребован для решения задач российского и мирового здравоохранения. Помимо классического «сэндвичевого» ИФА на пластиковых планшетах, нами были разработаны разнообразные аналитические протоколы, основанные на использовании магнитных частиц. Данные методы в отличие от ИФА «на пластике» позволяют использовать роботизированные платформы для автоматизации диагностических методик. Кроме того, протоколы, основанные на магнитных частицах, оказались в 5 раз более чувствительными, что позволило снизить порог обнаружения антигена до пикограммовых значений. Таким образом, все запланированные в рамках данного проекта исследовательские работы выполнены полностью, а по некоторым направлениям исследования проведены даже в более широком объёме. Кроме того, в ходе реализации данного научно-исследовательского проекта, были созданы прототипы практически востребованных продуктов для медицинской диагностики, и заложены основы для создания значительно более широкой панели диагностических и терапевтических средств.