Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках работы по Проекту в 2017 году был проведен системный биоинформатический скрининг амилоидогенных белков у растений с секвенированными и аннотированными геномами, а также бактерий порядка Rhizobiales. Скрининг был проведен с использованием двух различных биоинформатических алгоритмов: Waltz, который осуществляет поиск коротких амилоидогенных участков, обогащенных преимущественно гидрофобными аминокислотами, и SARP, который выявляет потенциально амилоидогенные участки, обогащенные аспарагином (N) и глутамином (Q). Для каждого из проанализированных протеомов растений и бактерий были установлены: доля белков с амилоидогенными участками, предсказанными Waltz и SARP и доля таких амилоидогенных участков в протеоме; при помощи базы Gene Ontology выявлены молекулярные функции и биологические процессы, а также локализация потенциально амилоидогенных белков. Дополнительно, при помощи базы PFAM были идентифицированы белковые домены, обогащенные амилоидогенными участками. В биоинформатический скрининг амилоидогенных белков у растений при помощи алгоритмов Waltz и SARP были включены протеомы 75 видов, а общее число проанализированных последовательностей белков достигло 2,9 миллиона. Полученные данные показали, что содержание амилоидогенных белков существенно варьирует у различных видов растений, в том числе, даже принадлежащих к одному роду. Исследование локализации и функций потенциально амилоидогенных белков, предсказанных Waltz, показало, что многие из них представляют собой трансмембранные белки, выполняющие функции транспортеров, а также имеющие моторную или киназную активность. Напротив, QN-обогащенные белки, предсказанные SARP, вовлечены в регуляцию транскрипции и связывание нуклеиновых кислот. Также QN-обогащенные белки связаны с хранением питательных веществ (к этой группе относятся, преимущественно, запасные белки семян). Белки растений, имеющие амилоидогенные участки, предсказанные Waltz, обладают преимущественно мембранной локализацией, в то время как QN-обогащенные амилоидогенные белки локализованы в ядре и цитоплазме. Важным результатом явилась демонстрация того что у многих видов растений потенциально амилоидогенными свойствами обладает эволюционно консервативный домен Cupin-1, который характерен для запасных белков семян: 7S и 11S глобулинов. Суммарно было выявлено более 300 белков, содержащих QN-обогащенный домен Cupin-1 у 54 из 70 видов растений, у которых этот домен присутствует. Необходимо отметить, что QN-обогащенностью обладает также целый ряд других доменов запасных белков семян растений. Этот результат согласуется с изначально выдвинутой нами гипотезой о возможной роли амилоидогенеза в запасании белков в семенах растений и открывает перспективы для дальнейшей проверки этой гипотезы при помощи протеомных подходов. В ходе биоинформатического скрининга амилоидогенных белков у бактерий порядка Rhizobiales при помощи алгоритмов Waltz и SARP были проанализированы протеомы более 80 видов этих бактерий. Работа была проведена по той же схеме, что и в предыдущем разделе. Полученные данные показали, что общая доля белков, содержащих участки, предсказанные Waltz, в протеомах Rhizobiales варьирует от 11,7 до 22,3%, в то время как аналогичный показатель для QN-богатых белков, предсказанных SARP, варьирует от 0,2 до 1,4%. Большинство потенциально амилоидогенных белков, предсказанных Waltz, находятся в плазматической мембране, а QN-богатые белки, предсказанные SARP, располагаются в наружной мембране или же вовлечены в формирование моторных структур, включая жгутик. Амилоидогенные белки, предсказанные Waltz, в основном, вовлечены в транспорт через плазматическую мембрану, а также участвуют в секреции. Бактериальные белки, предсказанные SARP, более разнообразны по функциям и участвуют в транспорте, процессах биосинтеза, цитокинеза, секреции, а также реакции на стресс. Проведенный анализ белковых доменов, обогащенных амилоидогенными участками, предсказанными Waltz и SARP, показал, что потенциально амилоидогенными являются домены флагеллин (Flg) и гемолизин (HlyD), а также домены, вовлеченные в биосинтез липополисахаридов (LptD) и секрецию. Большинство из этих доменов вовлечены в вирулентность бактерий порядка Rhizobiales, а для некоторых из них показана роль в растительно-микробных взаимодействиях. В целом, полученные данные показывают, что амилоидогенные белки клубеньковых бактерий потенциально могут участвовать в регуляции вирулетности и молекулярных механизмов симбиоза. Биоинформатические данные, полученные в рамках выполнения Проекта показали высокую перспективность дальнейшего экспериментального изучения амилоидных белков растений и клубеньковых бактерий. Для проведения дальнейших исследований метод протеомного скрининга амилоидных белков PSIA был оптимизирован для работы с семенами посевного гороха P. sativum, а также свободноживущей формой и бактероидами клубеньковой бактерии R. leguminosarum. Основную сложность в протеомных исследованиях у P. sativum составляло отсутствие референсных данных, поскольку геном у этого объекта до настоящего времени не секвенирован. В связи с этим, было проведено секвенирование транскриптома семян P. sativum на двух стадиях развития (10 и 20 дней) на платформе Illumina HiSeq4000. Секвенирование для каждой из стадий было осуществлено в четырех повторностях, причем одна из них была сделана с удвоенным покрытием. Всего было собрано около 190000 транскриптов. Белки, соответствующие собранным транскриптам, были предсказаны при помощи TransDecoder с использованием курируемой базы данных белков SwissProt и базы белковых доменов Pfam. Для объединенного транскриптома было предсказано 126579 белков и их фрагментов длиннее 100 аминокислот, более 78% которых являлись полноразмерными и более 85% имели ортологи в геноме растений. В целом, в 2017 году нами был проведен комплексный биоинформатический скрининг амилоидогенных белков у 75 видов растений с секвенированными геномами и более 80 видов бактерий порядка Rhizobiales при помощи алгоритмов Waltz и SARP, а также осуществлена всесторонняя подготовка методической базы для экспериментального протеомного скрининга амилоидов методом PSIA в семенах P. sativum, а также свободноживущей формы и бактероидов R. leguminosarum. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2017 году: 1. Antonets K.S., Nizhnikov A.A. Predicting amyloidogenic proteins in the proteomes of plants // International Journal of Molecular Sciences, 2017, V.18, e2155.. 2. Antonets K.S., Nizhnikov A.A. Amyloids and prions in plants: facts and perspectives // Prion, 2017, V.11, P.300-312. 3. Nizhnikov A.A., Antonets K.S. The study of amyloidogenic properties of plant proteomes // The FEBS Journal (Supplement 1: Abstracts of the 42nd FEBS Congress (Jerusalem, Israel; September 10–14, 2017)), 2017, V.284, S.1, P.211, P.3.1.B001. 4. Antonets K.S., Belousov M.V., Bondarev S.A., Kosolapova A.O., Zhouravleva G.A., Nizhnikov A.A. Identification of novel amyloids in bacterial proteomes // The FEBS Journal (Supplement 1: Abstracts of the 42nd FEBS Congress (Jerusalem, Israel; September 10–14, 2017)), 2017, V.284, S.1, P.211, P.3.1.B002.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках работы по Проекту в 2018 году был проведен протеомный скрининг белков, формирующих агрегаты, устойчивые к обработке ионными детергентами, что является одним из свойств амилоидов, в семенах гороха Pisum sativum L. линии Sprint-2, а также у различных жизненных форм клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viciae штамм RCAM1026. Фракции детергент-устойчивых белков были выделены и очищены при помощи серии ультрацентрифугирований белковых лизатов, обработанных ионными детергентами. Детергент-устойчивые белки были солюбилизированы и обработаны трипсином. Полученные смеси пептидов были разделены при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, после чего белки были идентифицированы посредством масс-спектрометрии. В результате, нами были получены данные о ландшафтах потенциально амилоидогенных детергент-устойчивых белков семян гороха Pisum sativum и различных жизненных форм клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum. Результаты идентификации детергент-устойчивых белков семян подтвердили выдвинутую нами исходную гипотезу данного Проекта о роли амилоидогенеза в запасании белков семян, поскольку показали, что с наибольшим масс-спектрометрическим счетом в детергент-устойчивой фракции семян представлены запасные белки: вицилины, легумины и конвицилины. Было установлено, что динамика накопления детергент-устойчивых агрегатов этих белков меняется по мере созревания: сначала преобладают легумины, затем вицилины. Необходимо отметить, что вицилин гороха содержит два эволюционно консервативных домена CUPIN-1, которые были идентифицированы нами в масштабном биоинформатическом анализе, проведенном в 2017 году, как наиболее амилоидогенные домены в протеомах большинства видов наземных растений. Таким образом, результаты протеомного скрининга амилоидов в семенах гороха соответствуют ранее выполненным биоинформатическим предсказаниям. Более того, проведенный нами анализ амилоидных свойств белка вицилина в бактериальной системе C-DAG показал, что этот белок формирует при секреции на поверхность клеток E. coli фибриллы, демонстрирующие двойное лучепреломление при связывании Конго красного, что является «золотым стандартом» в диагностике амилоидов. Таким образом, в 2018 году нами были получены приоритетные данные, подтверждающие роль амилоидогенеза в запасании белка в семенах растений. В результате протеомного скрининга детергент-устойчивых белков свободноживущей культуры клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum с наиболее высоким масс-спектрометрическим счетом был выявлен порин наружной мембраны RopA, который формирует структуру типа бета-бочки, сходную со структурой амилоидогенных поринов E.coli OmpA и OmpC. Также в составе детергент-устойчивой фракции свободноживущей культуры, но не бактероидов R. leguminosarum был выявлен белок наружной мембраны RopB, уровень продукции которого, как и RopA, повышен на ранних этапах клубенькообразования, а затем практически полностью репрессируется. Проверка в системе C-DAG показала, что RopA и RopB формируют фибриллы при секреции на поверхность клеток E. coli, и эти фибриллы демонстрируют двойное лучепреломление зеленого цвета при связывании Конго красного, что позволяет предполагать наличие у них амилоидных свойств. Полученные нами данные согласуются с идеей о роли амилоидогенеза в вирулентности симбиотических бактерий, поскольку факторы вирулентности выявляются в биоинформатическом анализе как наиболее амилоидогенные белки в протеомах бактерий порядка Rhizobiales, а в настоящей работе амилоидоподобные свойства показаны для белков RopA и RopB, которые, по-видимому, играют важную роль в вирулентности клубеньковой бактерии R. leguminosarum. Можно предположить, что функциональная роль амилоидогенеза факторов вирулентности состоит в стабилизации структуры этих белков и предохранении их от разрушения во внешней среде. Таким образом, в 2018 году нами был проведен протеомный скрининг амилоидных белков в семенах посевного гороха Pisum sativum и у различных жизненных форм бактерии Rhizobium leguminosarum, который подтвердил сделанные нами биоинформатические предсказания, связав амилоидогенез с запасанием белка в семенах растений и вирулентностью клубеньковых бактерий, а также позволил идентифицировать ряд приоритетных белков-кандидатов для дальнейшего подтверждения их амилоидных свойств in vivo и in vitro. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2018 году: 1. Antonets K.S., Kliver S.F., Nizhnikov A.A. Exploring proteins containing amyloidogenic regions in the proteomes of bacteria of the order Rhizobiales // Evolutionary Bioinformatics, 2018, V.14, P.1-12. 2. Bondarev S.A., Antonets K.S., Kajava A.V., Nizhnikov A.A., Zhouravleva G.A. Protein co-aggregation related to amyloids: methods of investigation, diversity and classification // International Journal of Molecular Sciences, 2018, V.19, e2292. 3. Kosolapova A., Belousov M., Belousova M., Antonets K., Shtark O., Vasilyeva E., Nizhnikov A.A. Identification of amyloid-forming proteins in the proteome of Rhizobium leguminosarum // FEBS Open Bio (Supplement 1: Abstracts of the 43nd FEBS Congress (Prague, Czech Republic; July 7–12, 2018)), 2018, V.8, S.1, P.402. 4. Belousova M., K. Antonets, M. Belousov, O. Shtark, A. Kosolapova, Nizhnikov A.A. Identification of amyloid-forming proteins in higher plants // FEBS Open Bio (Supplement 1: Abstracts of the 43nd FEBS Congress (Prague, Czech Republic; July 7–12, 2018)), 2018, V.8, S.1, P.409.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках работы по Проекту в 2019 году был проведен комплексный анализ in vitro и in vivo амилоидных свойств запасного белка семян гороха Pisum sativum L. вицилина, а также белков RopA и RopB клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum. Выполненные нами исследования показали, что запасной белок семян гороха вицилин, а также оба его домена Cupin-1.1 и Cupin-1.2, имеющих структуру «бета-бочка», образуют in vitro фибриллы, визуализируемые при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. Домены Cupin-1.1 и Cupin-1.2 формируют фибриллы в растворителе гексафторизопропанол, однако для эффективного фибриллогенеза полноразмерного вицилина необходимо использование «затравок» из предсуществующих фибрилл того же белка. Фибриллы вицилина, а также доменов Cupin-1.1 и Cupin-1.2 обладают устойчивостью к обработке холодным и горячим ионным детергентом додецил-сульфатом натрия (SDS) и окрашиваются амилоид-специфичным красителем Конго красный, демонстрируя зелено-желтое двойное лучепреломление в поляризованном свете, являющееся «золотым стандартом» в диагностике амилоидов. Изучение свойств вицилина в семенах P. sativum L. показало, что in vivo этот белок образует детергент-устойчивые агрегаты, количество которых возрастает при созревании семян и затем значительно уменьшается при их прорастании, что сопровождается образованием протеолитического фрагмента, наличие которого свидетельствует в пользу участия протеазной системы в деградации агрегатов вицилина. Установлено, что сигналы антител против вицилина колокализуются с амилоид-специфичным красителем Тиофлавин-Т на срезах семян гороха. Выделенные из семян белковые тельца, в которых локализован вицилин, связывают Тиофлавин-Т и демонстрируют двойное лучепреломление в поляризованном свете при окрашивании Конго красным, что доказывает амилоидную природу агрегатов вицилина in vivo. Нами показано, что амилоиды вицилина сохраняются при консервировании семян гороха, выдерживают обработку ферментами пищеварительного тракта в условиях, близких к физиологическим, и обладают токсичностью для клеток млекопитающих и грибов. Исследование амилоидных свойств белков RopA и RopB клубеньковой бактерии R. leguminosarum показало, что in vitro рекомбинантные полноразмерные RopA и RopB образуют фибриллы, которые обладают устойчивостью к обработке SDS и демонстрируют двойное лучепреломление зелено-желтого цвета при окрашивании красителем Конго красный, что подтверждает их амилоидную природу. При этом фибриллы RopB обладают устойчивостью к обработке трипсином и пепсином, в то время RopA частично устойчив только к действию трипсина. Анализ амилоидных свойств RopA и RopB in vivo в клетках R. leguminosarum показал, что эти белки образуют полимеры, устойчивые к обработке холодным и горячим SDS, которые выявляются при помощи вестерн-блот гибридизации с антителами против RopA и RopB как с использованием в качестве метода разделения классического денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, так и полуденатурирующего гель-электрофореза в агарозном геле. Показано, что количество полимеров RopA возрастает при обработке клеток флавоноидом лютеолином, имитирующей начальные этапы образования растительно-микробного симбиоза, что позволяет предположить функциональную роль этих полимеров в растительно-микробных взаимодействиях. С использованием иммуноэлектронной микроскопии с антителами против RopA и RopB, конъюгированными со вторичными антителами, меченными коллоидным золотом, показано, что эти белки локализованы в экстраклеточных фибриллах, образующих особую белково-полисахаридную структуру вокруг клетки R. leguminosarum, называемую капсулой, которая важна на начальных этапах взаимодействия бактерии с растением-хозяином. Окрашивание клеток R. leguminosarum Конго красным показало, что капсула связывает этот краситель и обладает зелено-желтым свечением в поляризованном свете, что подтверждает наличие в ее составе амилоидных фибрилл. Таким образом, важнейшим результатом Проекта в 2019 году стало доказательство амилоидных свойств запасного белка семян гороха P. sativum вицилина и белков RopA и RopB клубеньковой бактерии R. leguminosarum in vitro и in vivo. Эти данные обладают приоритетом на мировом уровне, поскольку впервые показывают существование амилоидов, образующихся в физиологических условиях у растений и клубеньковых бактерий, соответственно. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу вовлеченности амилоидогенеза в запасание белков семян у растений и растительно-микробные взаимодействия, а также показывают, что домены типа «бета-бочка» являются важными амилоидогенными детерминантами у прокариот и эукариот. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2019 году: 1. Kosolapova A.O., Belousov M.V., Sulatskaya A.I., Belousova M.E., Sulatsky M.I., Antonets K.S., Volkov K.V., Lykholay A.N., Shtark O.Y., Vasilieva E.N., Zhukov V.A., Ivanova A.N., Zykin P.A., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Two Novel Amyloid Proteins, RopA and RopB, from the Root Nodule Bacterium Rhizobium leguminosarum // Biomolecules, 2019, V.9, e694. 2. Malovichko Y.V., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Repertoire of the Bacillus thuringiensis virulence factors unrelated to major classes of protein toxins and its role in specificity of host-pathogen interactions // Toxins, 2019, V.11, e347. 3. Antonets K.S., Belousov M.V., Sulatskaya A.I., Belousova M.E., Kosolapova A.O., Sulatsky M.I., Andreeva E.A., Zykin P.A., Malovichko Y.V., Shtark O.Y., Lykholay A.N., Volkov K.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Kochetkova E.Y., Demidov O.N., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation // BioRxiv, 2019, 825091 (preprint published 30.10.2019). 4. Nizhnikov A.A., Belousov M., Belousova M., Kosolapova A., Tikhonovich I., Antonets K. The interdependence between amyloid formation and virulence of Proteobacteria // FEBS Open Bio (Suppl.1: Abstracts of the 44th FEBS Congress (Krakow, Poland; 6-11 July 2019)), 2019, V.9, S.1, P. 274. 5. Antonets K., Belousov M., Belousova M., Shtark O., Andreeva E., Zykin P., Kosolapova A., Lykholay A., Volkov K., Malovichko Y., Tikhonovich I., Nizhnikov A.A. Proteomic screening revealed functional amyloid proteins in the seeds of garden pea Pisum sativum L. // FEBS Open Bio (Suppl.1: Abstracts of the 44th FEBS Congress (Krakow, Poland; 6-11 July 2019)), 2019, V.9, S.1, P. 275.