КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-16-01100

НазваниеПротеомный скрининг амилоидных белков у посевного гороха (Pisum sativum L.) и клубеньковой бактерии (Rhizobium leguminosarum)

РуководительНижников Антон Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ 2017 - 2019  продлен на 2020 - 2021

КАРТОЧКА ПРОДЛЕНИЯ ПРОЕКТА

КонкурсКонкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словаАмилоид, белковая фибрилла, горох посевной, агробиотехнология, клубеньковая бактерия, бактероид, запасные белки, sym31, Pisum sativum, Rhizobium, протеомика, транскриптомика

Код ГРНТИ68.03.03


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Амилоидами называют белковые фибриллы, обладающие особой общей структурой, основным элементом которой являются формируемые мономерами межмолекулярные бета-слои, расположенные перпендикулярно оси фириллы и стабилизированные многочисленными водородными связями. Такая структура придает амилоидам уникальную стабильность и устойчивость к обработке детергентами, протеиназами и действию высоких температур. На протяжении долгого времени амилоиды воспринимались исключительно как летальные патогены, вызывающие десятки неизлечимых заболеваний у человека и животных. В последние годы стало очевидным, что помимо патологических амилоидов, возникающих вследствие нарушения укладки определенных белков, существует большая группа белков, формирующих амилоиды в норме. Такие амилоиды, получившие название функциональных, вовлечены в выполнение широкого спектра биологических функций у различных организмов, от архей и бактерий, до человека. Примерами функций амилоидов у прокариот является участие в формировании биопленок и запасание токсинов, у грибов – повышение устойчивости к различным химическим соединениям, а у животных – формирование долговременной памяти, регуляция антивирусного ответа, участие в полимеризации меланина, запасании гормонов и биоминерализации зубной эмали. Наиболее крупной и хозяйственно значимой группой организмов, у которых к настоящему времени не идентифицированы белки, формирующие амилоиды в физиологических условиях, являются растения, что обуславливает высокую актуальность исследований по поиску амилоидов у этих организмов. Идентификация новых амилоидов до недавнего времени велась исключительно адресным путем, и не позволяла оценивать амилоидные свойства белков во всем протеоме исследуемых организмов. Настоящий Проект посвящен выявлению амилоидных белков в протеомах посевного гороха Pisum sativum L. и клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum. Проведенный нами на предварительном этапе биоинформатический анализ показал, что запасные белки семян целого ряда видов растений, включая представителей семейства бобовые, к которым относится и горох, характеризуются повышенной долей амилоидогенных участков, что позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что белки семян могут запасться в виде амилоидов. Для проверки этой гипотезы в настоящем Проекте мы используем инновационный метод протеомного скрининга амилоидов PSIA, который впервые позволяет анализировать амилоидогенные свойства белков у различных организмов в масштабах всего протеома. Протеомный скрининг будет проведен в семенах гороха, находящихся на различных стадиях созревания, что позволит не только оценить наличие амилоидных белков, но и отследить динамику формирования амилоидов по мере созревания семян. Прокариоты являются группой организмов, у которой широко распространены функциональные амилоиды, большинство из которых является секретируемыми белками. Клубеньковые бактерии являются важными симбионтами бобовых, необходимыми для биологической фиксации азота, что имеет важное хозяйственное значение. В настоящем Проекте будет проведен протеомный скрининг амилоидных белков у симбионта гороха – бактерии Rhizobium leguminosarum. Эта бактерия может существовать как в свободной форме, так и в виде особых дифференцированных клеток – бактероидов в клубеньках гороха. Кроме того, известен мутант гороха sym31 (Sprint-2Fix-), у которого R. leguminosarum в клубеньках не дифференцируется в бактероиды. Сравнительный протеомный скрининг амилоидных белков у свободноживущей культуры R. leguminosarum, бактероидов, а также клеток, выделенных из клубеньков sym31 (Sprint-2Fix-), позволит выявить амилоидные белки, специфичные для каждой из форм. В случае, если будут идентифицированы амилоидные белки, специфичные для бактероидов, это будет свидетельствовать в пользу возможной функциональной роли таких белков в растительно-микробных взаимодействия, что может быть использовано для получения высокоэффективных штаммов R. leguminosarum и является перспективным для агробиотехнологии. Также в рамках Проекта будет проведен биоинформатический анализ амилоидогенных свойств белков протеомов ряда видов растений, а также клубеньковых бактерий, у которых секвенирован геном. Этот анализ позволит охарактеризовать долю, занимаемую белками с амилоидогенными участками в протеомах исследуемых видов, выявить семейства белков, последовательности которых наиболее обогащены такими участками, проанализировать консервативность амилоидогенных участков и охарактеризовать различия в аминокислотном составе амилоидогенных участков прокариот и эукариот. В целом, в настоящем Проекте впервые будет применен комплексный экспериментально-биоинформатический анализ, направленный на идентификацию амилоидных белков у посевного гороха P. sativum L. и клубеньковой бактерии R. leguminosarum, оценку роли амилоидных белков в растительно-микробных взаимодействиях, а также анализ амилоидогенных свойств протеомов растений и клубеньковых бактерий.

Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты Проекта обладают принципиальной новизной и высокой значимостью на мировом уровне. Впервые будет проведен скрининг амилоидных белков растений на уровне всего протеома. В качестве основного объекта для исследования будет использована важная сельскохозяйственная культура - посевной горох Pisum sativum L. Данные, полученные на предварительном этапе при помощи биоинформатических подходов, показывают, что вероятными кандидатами на роль амилоидных белков растений являются запасные белки семян. Поэтому в рамках настоящего исследования будет проведен протеомный скрининг амилоидных белков в протеоме семян гороха на различных стадиях созревания, который позволит оценить наличие амилоидных белков, а также оценить динамику их формирования. Другим аспектом работы является протеомный скрининг амилоидных белков у симбионта гороха – клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum. Ожидаемые результаты позволят, с одной стороны, проанализировать амилоидные свойства белков во всем протеоме этой бактерии, а с другой – выявить амилоидные белки, специфичные как для свободноживущей культуры R. leguminosarum, так и для клеток бактерии, выделенных из клубеньков гороха. Эти данные могут впервые пролить свет на роль амилоидных белков в растительно-микробных взаимодействиях. Значимость биоинформатического анализа амилоидогенных свойств белков в протеомах растений, включая P. sativum L., и клубеньковых бактерий обусловлена тем, что в его рамках впервые будет проведена комплексная амилоидогенных свойств белков этих организмов, которая позволит выявить наиболее обогащенные амилоидогенными участками белки, связать эту обогащенность с конкретными функциями, выполняемыми белками, проанализировать консервативность состава и расположения амилоидогенных участков и выявить отличия в структуре и аминокислотном составе амилоидогенных участков прокариот и эукариот. В целом, ожидается, что результаты Проекта впервые выведут исследования амилоидов растений и прокариот от уровня отдельных белков к масштабу всего протеома. Это внесет весомый вклад в расширение знания о биологической роли амилоидных белков и концепции функциональных амилоидов, а также совершенствования методологии работы с амилоидными белками. Используемые в работе объекты исследования – посевной горох P. sativum L. и клубеньковая бактерия R. leguminosarum являются важными для сельского хозяйства и агробиотехнологии. Выявление у этих организмов амилоидных белков откроет перспективы для прикладных исследований по улучшению качества запасных белков и создания бактериальных штаммов для повышения эффективности азотфиксации.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках работы по Проекту в 2017 году был проведен системный биоинформатический скрининг амилоидогенных белков у растений с секвенированными и аннотированными геномами, а также бактерий порядка Rhizobiales. Скрининг был проведен с использованием двух различных биоинформатических алгоритмов: Waltz, который осуществляет поиск коротких амилоидогенных участков, обогащенных преимущественно гидрофобными аминокислотами, и SARP, который выявляет потенциально амилоидогенные участки, обогащенные аспарагином (N) и глутамином (Q). Для каждого из проанализированных протеомов растений и бактерий были установлены: доля белков с амилоидогенными участками, предсказанными Waltz и SARP и доля таких амилоидогенных участков в протеоме; при помощи базы Gene Ontology выявлены молекулярные функции и биологические процессы, а также локализация потенциально амилоидогенных белков. Дополнительно, при помощи базы PFAM были идентифицированы белковые домены, обогащенные амилоидогенными участками. В биоинформатический скрининг амилоидогенных белков у растений при помощи алгоритмов Waltz и SARP были включены протеомы 75 видов, а общее число проанализированных последовательностей белков достигло 2,9 миллиона. Полученные данные показали, что содержание амилоидогенных белков существенно варьирует у различных видов растений, в том числе, даже принадлежащих к одному роду. Исследование локализации и функций потенциально амилоидогенных белков, предсказанных Waltz, показало, что многие из них представляют собой трансмембранные белки, выполняющие функции транспортеров, а также имеющие моторную или киназную активность. Напротив, QN-обогащенные белки, предсказанные SARP, вовлечены в регуляцию транскрипции и связывание нуклеиновых кислот. Также QN-обогащенные белки связаны с хранением питательных веществ (к этой группе относятся, преимущественно, запасные белки семян). Белки растений, имеющие амилоидогенные участки, предсказанные Waltz, обладают преимущественно мембранной локализацией, в то время как QN-обогащенные амилоидогенные белки локализованы в ядре и цитоплазме. Важным результатом явилась демонстрация того что у многих видов растений потенциально амилоидогенными свойствами обладает эволюционно консервативный домен Cupin-1, который характерен для запасных белков семян: 7S и 11S глобулинов. Суммарно было выявлено более 300 белков, содержащих QN-обогащенный домен Cupin-1 у 54 из 70 видов растений, у которых этот домен присутствует. Необходимо отметить, что QN-обогащенностью обладает также целый ряд других доменов запасных белков семян растений. Этот результат согласуется с изначально выдвинутой нами гипотезой о возможной роли амилоидогенеза в запасании белков в семенах растений и открывает перспективы для дальнейшей проверки этой гипотезы при помощи протеомных подходов. В ходе биоинформатического скрининга амилоидогенных белков у бактерий порядка Rhizobiales при помощи алгоритмов Waltz и SARP были проанализированы протеомы более 80 видов этих бактерий. Работа была проведена по той же схеме, что и в предыдущем разделе. Полученные данные показали, что общая доля белков, содержащих участки, предсказанные Waltz, в протеомах Rhizobiales варьирует от 11,7 до 22,3%, в то время как аналогичный показатель для QN-богатых белков, предсказанных SARP, варьирует от 0,2 до 1,4%. Большинство потенциально амилоидогенных белков, предсказанных Waltz, находятся в плазматической мембране, а QN-богатые белки, предсказанные SARP, располагаются в наружной мембране или же вовлечены в формирование моторных структур, включая жгутик. Амилоидогенные белки, предсказанные Waltz, в основном, вовлечены в транспорт через плазматическую мембрану, а также участвуют в секреции. Бактериальные белки, предсказанные SARP, более разнообразны по функциям и участвуют в транспорте, процессах биосинтеза, цитокинеза, секреции, а также реакции на стресс. Проведенный анализ белковых доменов, обогащенных амилоидогенными участками, предсказанными Waltz и SARP, показал, что потенциально амилоидогенными являются домены флагеллин (Flg) и гемолизин (HlyD), а также домены, вовлеченные в биосинтез липополисахаридов (LptD) и секрецию. Большинство из этих доменов вовлечены в вирулентность бактерий порядка Rhizobiales, а для некоторых из них показана роль в растительно-микробных взаимодействиях. В целом, полученные данные показывают, что амилоидогенные белки клубеньковых бактерий потенциально могут участвовать в регуляции вирулетности и молекулярных механизмов симбиоза. Биоинформатические данные, полученные в рамках выполнения Проекта показали высокую перспективность дальнейшего экспериментального изучения амилоидных белков растений и клубеньковых бактерий. Для проведения дальнейших исследований метод протеомного скрининга амилоидных белков PSIA был оптимизирован для работы с семенами посевного гороха P. sativum, а также свободноживущей формой и бактероидами клубеньковой бактерии R. leguminosarum. Основную сложность в протеомных исследованиях у P. sativum составляло отсутствие референсных данных, поскольку геном у этого объекта до настоящего времени не секвенирован. В связи с этим, было проведено секвенирование транскриптома семян P. sativum на двух стадиях развития (10 и 20 дней) на платформе Illumina HiSeq4000. Секвенирование для каждой из стадий было осуществлено в четырех повторностях, причем одна из них была сделана с удвоенным покрытием. Всего было собрано около 190000 транскриптов. Белки, соответствующие собранным транскриптам, были предсказаны при помощи TransDecoder с использованием курируемой базы данных белков SwissProt и базы белковых доменов Pfam. Для объединенного транскриптома было предсказано 126579 белков и их фрагментов длиннее 100 аминокислот, более 78% которых являлись полноразмерными и более 85% имели ортологи в геноме растений. В целом, в 2017 году нами был проведен комплексный биоинформатический скрининг амилоидогенных белков у 75 видов растений с секвенированными геномами и более 80 видов бактерий порядка Rhizobiales при помощи алгоритмов Waltz и SARP, а также осуществлена всесторонняя подготовка методической базы для экспериментального протеомного скрининга амилоидов методом PSIA в семенах P. sativum, а также свободноживущей формы и бактероидов R. leguminosarum. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2017 году: 1. Antonets K.S., Nizhnikov A.A. Predicting amyloidogenic proteins in the proteomes of plants // International Journal of Molecular Sciences, 2017, V.18, e2155.. 2. Antonets K.S., Nizhnikov A.A. Amyloids and prions in plants: facts and perspectives // Prion, 2017, V.11, P.300-312. 3. Nizhnikov A.A., Antonets K.S. The study of amyloidogenic properties of plant proteomes // The FEBS Journal (Supplement 1: Abstracts of the 42nd FEBS Congress (Jerusalem, Israel; September 10–14, 2017)), 2017, V.284, S.1, P.211, P.3.1.B001. 4. Antonets K.S., Belousov M.V., Bondarev S.A., Kosolapova A.O., Zhouravleva G.A., Nizhnikov A.A. Identification of novel amyloids in bacterial proteomes // The FEBS Journal (Supplement 1: Abstracts of the 42nd FEBS Congress (Jerusalem, Israel; September 10–14, 2017)), 2017, V.284, S.1, P.211, P.3.1.B002.

 

Публикации

1. Антонец К.С., Белоусов М.В., Бондарев С.А., Косолапова А.О., Журавлева Г.А., Нижников А.А. Identification of novel amyloids in bacterial proteomes. The FEBS Journal, V.284, Supplement 1, P.211, P.3.1.B-002 (год публикации - 2017).

2. Антонец К.С., Нижников А.А. Amyloids and prions in plants: Facts and perspectives. Prion, №5, V.11, P.300-312. (год публикации - 2017).

3. Антонец К.С., Нижников А.А. Predicting amyloidogenic proteins in the proteomes of plants. International Journal of Molecular Sciences, №10, V.18, e2155 (год публикации - 2017).

4. Нижников А.А., Антонец К.С. The study of amyloidogenic properties of plant proteomes. The FEBS Journal, V.284, Supplement 1, P. 211, P.3.1.B-001 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках работы по Проекту в 2018 году был проведен протеомный скрининг белков, формирующих агрегаты, устойчивые к обработке ионными детергентами, что является одним из свойств амилоидов, в семенах гороха Pisum sativum L. линии Sprint-2, а также у различных жизненных форм клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viciae штамм RCAM1026. Фракции детергент-устойчивых белков были выделены и очищены при помощи серии ультрацентрифугирований белковых лизатов, обработанных ионными детергентами. Детергент-устойчивые белки были солюбилизированы и обработаны трипсином. Полученные смеси пептидов были разделены при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, после чего белки были идентифицированы посредством масс-спектрометрии. В результате, нами были получены данные о ландшафтах потенциально амилоидогенных детергент-устойчивых белков семян гороха Pisum sativum и различных жизненных форм клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum. Результаты идентификации детергент-устойчивых белков семян подтвердили выдвинутую нами исходную гипотезу данного Проекта о роли амилоидогенеза в запасании белков семян, поскольку показали, что с наибольшим масс-спектрометрическим счетом в детергент-устойчивой фракции семян представлены запасные белки: вицилины, легумины и конвицилины. Было установлено, что динамика накопления детергент-устойчивых агрегатов этих белков меняется по мере созревания: сначала преобладают легумины, затем вицилины. Необходимо отметить, что вицилин гороха содержит два эволюционно консервативных домена CUPIN-1, которые были идентифицированы нами в масштабном биоинформатическом анализе, проведенном в 2017 году, как наиболее амилоидогенные домены в протеомах большинства видов наземных растений. Таким образом, результаты протеомного скрининга амилоидов в семенах гороха соответствуют ранее выполненным биоинформатическим предсказаниям. Более того, проведенный нами анализ амилоидных свойств белка вицилина в бактериальной системе C-DAG показал, что этот белок формирует при секреции на поверхность клеток E. coli фибриллы, демонстрирующие двойное лучепреломление при связывании Конго красного, что является «золотым стандартом» в диагностике амилоидов. Таким образом, в 2018 году нами были получены приоритетные данные, подтверждающие роль амилоидогенеза в запасании белка в семенах растений. В результате протеомного скрининга детергент-устойчивых белков свободноживущей культуры клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum с наиболее высоким масс-спектрометрическим счетом был выявлен порин наружной мембраны RopA, который формирует структуру типа бета-бочки, сходную со структурой амилоидогенных поринов E.coli OmpA и OmpC. Также в составе детергент-устойчивой фракции свободноживущей культуры, но не бактероидов R. leguminosarum был выявлен белок наружной мембраны RopB, уровень продукции которого, как и RopA, повышен на ранних этапах клубенькообразования, а затем практически полностью репрессируется. Проверка в системе C-DAG показала, что RopA и RopB формируют фибриллы при секреции на поверхность клеток E. coli, и эти фибриллы демонстрируют двойное лучепреломление зеленого цвета при связывании Конго красного, что позволяет предполагать наличие у них амилоидных свойств. Полученные нами данные согласуются с идеей о роли амилоидогенеза в вирулентности симбиотических бактерий, поскольку факторы вирулентности выявляются в биоинформатическом анализе как наиболее амилоидогенные белки в протеомах бактерий порядка Rhizobiales, а в настоящей работе амилоидоподобные свойства показаны для белков RopA и RopB, которые, по-видимому, играют важную роль в вирулентности клубеньковой бактерии R. leguminosarum. Можно предположить, что функциональная роль амилоидогенеза факторов вирулентности состоит в стабилизации структуры этих белков и предохранении их от разрушения во внешней среде. Таким образом, в 2018 году нами был проведен протеомный скрининг амилоидных белков в семенах посевного гороха Pisum sativum и у различных жизненных форм бактерии Rhizobium leguminosarum, который подтвердил сделанные нами биоинформатические предсказания, связав амилоидогенез с запасанием белка в семенах растений и вирулентностью клубеньковых бактерий, а также позволил идентифицировать ряд приоритетных белков-кандидатов для дальнейшего подтверждения их амилоидных свойств in vivo и in vitro. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2018 году: 1. Antonets K.S., Kliver S.F., Nizhnikov A.A. Exploring proteins containing amyloidogenic regions in the proteomes of bacteria of the order Rhizobiales // Evolutionary Bioinformatics, 2018, V.14, P.1-12. 2. Bondarev S.A., Antonets K.S., Kajava A.V., Nizhnikov A.A., Zhouravleva G.A. Protein co-aggregation related to amyloids: methods of investigation, diversity and classification // International Journal of Molecular Sciences, 2018, V.19, e2292. 3. Kosolapova A., Belousov M., Belousova M., Antonets K., Shtark O., Vasilyeva E., Nizhnikov A.A. Identification of amyloid-forming proteins in the proteome of Rhizobium leguminosarum // FEBS Open Bio (Supplement 1: Abstracts of the 43nd FEBS Congress (Prague, Czech Republic; July 7–12, 2018)), 2018, V.8, S.1, P.402. 4. Belousova M., K. Antonets, M. Belousov, O. Shtark, A. Kosolapova, Nizhnikov A.A. Identification of amyloid-forming proteins in higher plants // FEBS Open Bio (Supplement 1: Abstracts of the 43nd FEBS Congress (Prague, Czech Republic; July 7–12, 2018)), 2018, V.8, S.1, P.409.

 

Публикации

1. Антонец К.С., Кливер С.Ф., Нижников А.А. Exploring proteins containing amyloidogenic regions in the proteomes of bacteria of the order Rhizobiales Evolutionary Bioinformatics, Т.14, С.1-12 (год публикации - 2018).

2. Белоусова М.Е., Антонец К.С., Белоусов М.В., Штарк О.Ю., Косолапова А.О., Нижников А.А. Identification of amyloid-forming proteins in higher plants FEBS Open Bio, V.8, S.1, P.402. (год публикации - 2018).

3. Бондарев С.А., Антонец К.С., Кайава А.В., Нижников А.А., Журавлева Г.А. Protein co-aggregation related to amyloids: methods of investigation, diversity and classification International Journal of Molecular Sciences, Т.19, №8, e2292 (год публикации - 2018).

4. Косолапова А.О., Белоусов М.В., Белоусова М.Е., Антонец К.С., Штарк О.Ю., Васильева Е.Н., Нижников А.А. Identification of amyloid-forming proteins in the proteome of Rhizobium leguminosarum FEBS Open Bio, V.8, S.1, P.402. (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках работы по Проекту в 2019 году был проведен комплексный анализ in vitro и in vivo амилоидных свойств запасного белка семян гороха Pisum sativum L. вицилина, а также белков RopA и RopB клубеньковой бактерии Rhizobium leguminosarum. Выполненные нами исследования показали, что запасной белок семян гороха вицилин, а также оба его домена Cupin-1.1 и Cupin-1.2, имеющих структуру «бета-бочка», образуют in vitro фибриллы, визуализируемые при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. Домены Cupin-1.1 и Cupin-1.2 формируют фибриллы в растворителе гексафторизопропанол, однако для эффективного фибриллогенеза полноразмерного вицилина необходимо использование «затравок» из предсуществующих фибрилл того же белка. Фибриллы вицилина, а также доменов Cupin-1.1 и Cupin-1.2 обладают устойчивостью к обработке холодным и горячим ионным детергентом додецил-сульфатом натрия (SDS) и окрашиваются амилоид-специфичным красителем Конго красный, демонстрируя зелено-желтое двойное лучепреломление в поляризованном свете, являющееся «золотым стандартом» в диагностике амилоидов. Изучение свойств вицилина в семенах P. sativum L. показало, что in vivo этот белок образует детергент-устойчивые агрегаты, количество которых возрастает при созревании семян и затем значительно уменьшается при их прорастании, что сопровождается образованием протеолитического фрагмента, наличие которого свидетельствует в пользу участия протеазной системы в деградации агрегатов вицилина. Установлено, что сигналы антител против вицилина колокализуются с амилоид-специфичным красителем Тиофлавин-Т на срезах семян гороха. Выделенные из семян белковые тельца, в которых локализован вицилин, связывают Тиофлавин-Т и демонстрируют двойное лучепреломление в поляризованном свете при окрашивании Конго красным, что доказывает амилоидную природу агрегатов вицилина in vivo. Нами показано, что амилоиды вицилина сохраняются при консервировании семян гороха, выдерживают обработку ферментами пищеварительного тракта в условиях, близких к физиологическим, и обладают токсичностью для клеток млекопитающих и грибов. Исследование амилоидных свойств белков RopA и RopB клубеньковой бактерии R. leguminosarum показало, что in vitro рекомбинантные полноразмерные RopA и RopB образуют фибриллы, которые обладают устойчивостью к обработке SDS и демонстрируют двойное лучепреломление зелено-желтого цвета при окрашивании красителем Конго красный, что подтверждает их амилоидную природу. При этом фибриллы RopB обладают устойчивостью к обработке трипсином и пепсином, в то время RopA частично устойчив только к действию трипсина. Анализ амилоидных свойств RopA и RopB in vivo в клетках R. leguminosarum показал, что эти белки образуют полимеры, устойчивые к обработке холодным и горячим SDS, которые выявляются при помощи вестерн-блот гибридизации с антителами против RopA и RopB как с использованием в качестве метода разделения классического денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, так и полуденатурирующего гель-электрофореза в агарозном геле. Показано, что количество полимеров RopA возрастает при обработке клеток флавоноидом лютеолином, имитирующей начальные этапы образования растительно-микробного симбиоза, что позволяет предположить функциональную роль этих полимеров в растительно-микробных взаимодействиях. С использованием иммуноэлектронной микроскопии с антителами против RopA и RopB, конъюгированными со вторичными антителами, меченными коллоидным золотом, показано, что эти белки локализованы в экстраклеточных фибриллах, образующих особую белково-полисахаридную структуру вокруг клетки R. leguminosarum, называемую капсулой, которая важна на начальных этапах взаимодействия бактерии с растением-хозяином. Окрашивание клеток R. leguminosarum Конго красным показало, что капсула связывает этот краситель и обладает зелено-желтым свечением в поляризованном свете, что подтверждает наличие в ее составе амилоидных фибрилл. Таким образом, важнейшим результатом Проекта в 2019 году стало доказательство амилоидных свойств запасного белка семян гороха P. sativum вицилина и белков RopA и RopB клубеньковой бактерии R. leguminosarum in vitro и in vivo. Эти данные обладают приоритетом на мировом уровне, поскольку впервые показывают существование амилоидов, образующихся в физиологических условиях у растений и клубеньковых бактерий, соответственно. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу вовлеченности амилоидогенеза в запасание белков семян у растений и растительно-микробные взаимодействия, а также показывают, что домены типа «бета-бочка» являются важными амилоидогенными детерминантами у прокариот и эукариот. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2019 году: 1. Kosolapova A.O., Belousov M.V., Sulatskaya A.I., Belousova M.E., Sulatsky M.I., Antonets K.S., Volkov K.V., Lykholay A.N., Shtark O.Y., Vasilieva E.N., Zhukov V.A., Ivanova A.N., Zykin P.A., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Two Novel Amyloid Proteins, RopA and RopB, from the Root Nodule Bacterium Rhizobium leguminosarum // Biomolecules, 2019, V.9, e694. 2. Malovichko Y.V., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Repertoire of the Bacillus thuringiensis virulence factors unrelated to major classes of protein toxins and its role in specificity of host-pathogen interactions // Toxins, 2019, V.11, e347. 3. Antonets K.S., Belousov M.V., Sulatskaya A.I., Belousova M.E., Kosolapova A.O., Sulatsky M.I., Andreeva E.A., Zykin P.A., Malovichko Y.V., Shtark O.Y., Lykholay A.N., Volkov K.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Kochetkova E.Y., Demidov O.N., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation // BioRxiv, 2019, 825091 (preprint published 30.10.2019). 4. Nizhnikov A.A., Belousov M., Belousova M., Kosolapova A., Tikhonovich I., Antonets K. The interdependence between amyloid formation and virulence of Proteobacteria // FEBS Open Bio (Suppl.1: Abstracts of the 44th FEBS Congress (Krakow, Poland; 6-11 July 2019)), 2019, V.9, S.1, P. 274. 5. Antonets K., Belousov M., Belousova M., Shtark O., Andreeva E., Zykin P., Kosolapova A., Lykholay A., Volkov K., Malovichko Y., Tikhonovich I., Nizhnikov A.A. Proteomic screening revealed functional amyloid proteins in the seeds of garden pea Pisum sativum L. // FEBS Open Bio (Suppl.1: Abstracts of the 44th FEBS Congress (Krakow, Poland; 6-11 July 2019)), 2019, V.9, S.1, P. 275.

 

Публикации

1. Антонец К., Белоусов М., Белоусова М., Штарк О., Андреева Е., Зыкин П., Косолапова А., Лихолай А., Волков К., Маловичко Ю., Тихонович И., Нижников А.А. Proteomic screening revealed functional amyloid proteins in the seeds of garden pea Pisum sativum L. FEBS Open Bio, V.9, S.1, P. 275 (год публикации - 2019).

2. Антонец К.С., Белоусов М.В., Сулацкая А.И., Белоусова М.Е., Косолапова А.О., Сулацкий М.И., Андреева Е.А., Зыкин П.А., Маловичко Ю.В., Штарк О.Ю., и соавторы. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation bioRxiv, Препринт статьи, bioRxiv, 825091, опубликован 30.10.2019 (год публикации - 2019).

3. Косолапова А.О., Белоусов М.В., Сулацкая А.И., Белоусова М.Е., Сулацкий М.И., Антонец К.С., Волков К.В., Лихолай А.Н., Штарк О.Ю., Васильева Е.Н., Жуков В.А., Иванова А.Н., Зыкин П.А., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Тихонович И.А., Нижников А.А. Two Novel Amyloid Proteins, RopA and RopB, from the Root Nodule Bacterium Rhizobium leguminosarum Biomolecules, Т.9, №11, e694 (год публикации - 2019).

4. Маловичко Ю.В., Нижников А.А., Антонец К.С. Repertoire of the Bacillus thuringiensis virulence factors unrelated to major classes of protein toxins and its role in specificity of host-pathogen interactions Toxins, T.11, №6, e347 (год публикации - 2019).

5. Маловичко Ю.В., Штарк О.Ю., Васильева Е.Н., Нижников А.А., Антонец К.С. Transcriptomic insights into mechanisms of early seed maturation in garden pea (Pisum sativum L.) Cells, Т.9, №3, e779 (год публикации - 2020).

6. Нижников А.А., Белоусов М., Белоусова М., Косолапова А., Тихонович И., Антонец К. The interdependence between amyloid formation and virulence of Proteobacteria FEBS Open Bio, V.9, S.1, P. 274 (год публикации - 2019).