Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе выполнения работ на первом годовом этапе проекта была разработана методика получения флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (НК), типа ядро/оболочка CuInS2/ZnS. Целью разработки методики являлось получение НК, которые можно было-бы после дальнейшего перевода в водную фазу, стабилизации и функционализации использовать для решения поставленных задач проекта. С помощью разработанной методики синтеза были получены лоты НК CuInS2/ZnS с различным соотношением Cu/In в виде коллоидных растворов в толуоле с соотношением Cu/In – 1/1 и 1/6. Максимумы полос люминесценции находятся на 711 нм и 608 нм, а ширина на полувысоте составляет 133 нм и 103 нм для НК с соотношением Cu/In равным 1/1 и 1/6. Разработанная методика синтеза НК CuInS2/ZnS показла высокую воспроизводимость свойств получаемых НК. Так, синтез НК CuInS2/ZnS с соотношением медь:индий равным 1:1 по данной методике был повторен 3 раза, при этом смещение положения максимума люминсценции конечного продукта не превышало ±10 нм. Для долговременного хранения и последующего использования полученные НК были инкапсулированы в матрицу триоктифосфиноксида. Полученное вещество представляет собой порошок цвета от темно-красного до оранжевого в зависимости от соотношения Cu/In, с содержанием целевого продукта не менее 50%. Было установлено, что НК в такой форме стабильны при хранении на воздухе не менее шести месяцев. В ходе работ по первому этапу проекта были получены препараты водорастворимых НК CuInS2/ZnS, поверхность которых модифицирована производными многофункционального тиол-содержащего низкомолекулярного полимера на основе ПЭГ. С помощью двустадийной реакции обмена лигандов на поверхности гидрофобных синтезированных НК CuInS2/ZnS нами получена серия водорастворимых и биосовместимых препаратов НК с контролируемым зарядом поверхности, который определяется процентным соотношением производных ПЭГ, имеющих функциональные концевые карбоксильные, гидроксильные и аминогруппы. Стабильность полученных лотов водорастворимых биосовместимых НК была проанализирована с помощью оценки и мониторинга коллоидного состояния препаратов НК в реальном времени. Агрегатное состояние НК измерялось в течение 72 часов, при этом на протяжении всего периода измерений гидродинамический диаметр НК был равен 13,19 ±1 нм , что говорит о высокой стабильности полученных НК CuInS2/ZnS в физиологических условиях. Таким образом, впервые полученные водорастворимые биосовместимые, стабильные в водной среде НК химической структуры CuInS2/ZnS, характеризующиеся контролируемым зарядом поверхности и несущие функциональные группы для конъюгации с биомолекулами, которые могут быть использованы для получения широкого спектра диагностических нанозондов. Исследование цитотоксичности НК проводили на примере НК химического состава CuInS2/ZnS, использованных на этом этап проекта для приготовления нанометок на основе конъюгатов НК и ОД-АТ-Cys, при этом в качестве положительного контроля анализировали цитотоксичность НК химического состава CdSe/ZnS с максимумом флуоресценции 590 нм, характеризующимися аналогичным гидродинамическим диаметром и свойствами поверхности вследствии модификации с помощью тиол-содержащего низкомолекулярного производного ПЭГ SH-PEG-OH. По результатам эксперимента были получены кривые зависимости выживаемости клеток от концентрации добавленных к ним НК различного химического состава. Значение ингибирующей концентрации ИК50 при инкубации НК состава CuInS2/ZnS при инкубации с клетками линии SK-BR-3 в течение 24 часов составило 0,04547 мг/мл, в течении 48 часов - 0,02623 мг/мл. Значение ингибирующей концентрации ИК50 при инкубации квантовых точек состава CdSe/ZnS с клетками линии SK-BR-3 в течение 24 часов составило 0,05603 мг/мл, в течении 48 часов - 0,03359 мг/мл. Полученные сопостовимые значения ИК50 для различных типов НК, свидетельствует о том, что их цитотоксические свойства схожи и определяются исключительно размером и свойствами поверхности НК, а не химическим составом ядра НК. Таким образом можно сделать вывод о том, что плотная оболочка и дополнительное полимерное покрытие поверхности НК защищает ядро НК от деструкции в биологической среде. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что при более долгом или хроническом воздействии НК на клетки их токсические эффекты могут усиливаться. На отчетном этапе работы препараты ОД-АТ-Cys, распознающие онкомаркеры CEA и HER2 конъюгировали с полученными биосовместимыми НК CuInS2/ZnS ориентированным образом с использованием промежуточной стадии получения малеимид -активированных НК и дальнейшего химического связывания экспонированной сульфгидрильной группы молекул ОД-АТ-Cys с активированными функциональными группами на поверхности НК и дальнейшей хроматографической очисткой нанометок. Для изучения возможности использования полученных нанометок на основе конъюгатов водорастворимых НК CuInS2/ZnS и ОД-АТ-Cys, распознающих онкомаркеры CEA и HER2 для детекции in vitro нами была проанализирована возможность их прменения в иммунофлуоресценой детекци. Экспериментально была продемонстрирована способность полученных нанометок с высокой специфичностью распознавать соответствующий антиген на поверхности анализируемых клеток, что свидетельствует о наличии интактного активного центра в структуре ОД-АТ-Сys в составе полученных ориентированных конъюгатов НК и ОД-АТ анти-CEA и анти-HER2. В результате экспериментов по альтернативному синтезу графеновых НК были получены водорастворимые графеновые наночастицы. Данные НК обладают достаточно интенсивной фотолюминесценцией в синей области видимого спектра, при этом оптимальная длина волны ее возбуждения находится в интервале 300-330 нм. Синтезированные графеновые НК обладают долговременной коллоидной стабильностью в маточном растворе, при наблюдении за таким раствором в течение как минимум 4 месяцев не наблюдалось их выделения в виде осадка. На следующем этапе проекта согласно плану исследовательских работ проведен поиск методов дополнительной стабилизации графеновых НК в водной фазе с применением полифункциональных производных ПЕГ.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения работ на втором годовом этапе проекта были разработаны способы модификации поверхности графеновых нанокристаллов (гр-НК) гидроксиламином, цистеамином или производного ПЭГ с помощью карбодиимидного кросс-линкера 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида. Разработанные методики позволяют получить стабильные биосовместимые гр-НК, несущие специфические группы для их адресной фукционализации биомолекулами. Полученные препараты функционализированных гр-НК были охарактеризованы с помощью методов оптической спектрометрии и динамического светорассеяния. Концентрации лотов гр-НК оценивали спектроскопически. В совокупности было получено 320 мг стабильных в водной фазе гр-НК, функционализированных для дальнейшей конъюгации с биомолкулами. На отчетном этапе работы препараты ОД-АТ-Cys, распознающие онкомаркеры EGFR и EpCAM, конъюгировали с полученными биосовместимыми НК CuInS2/ZnS ориентированным образом с использованием промежуточной стадии получения малеимид-активированных НК и дальнейшего химического связывания экспонированной сульфгидрильной группы молекул ОД-АТ-Cys с активированными функциональными группами на поверхности НК и дальнейшей хроматографической очисткой нанометок. Для изучения возможности использования полученных нанометок на основе конъюгатов водорастворимых НК CuInS2/ZnS и ОД-АТ-Cys, распознающих онкомаркеры EGFR и EpCAM для детекции in vitro нами была проанализирована возможность их прменения в иммунофлуоресценой детекци. Экспериментально была продемонстрирована способность полученных нанометок с высокой специфичностью распознавать соответствующий антиген на поверхности анализируемых клеток, что свидетельствует о наличии интактного активного центра в структуре ОД-АТ-Сys в составе полученных ориентированных конъюгатов НК и ОД-АТ анти- EGFR и анти- EpCAM. В результате экспериментов по изучению острой токсичности водорастворимых НК CuInS2/ZnS и их конъюгатов были найдены расчетные токсические дозы. Для оценки токсического действия НК CuInS2/ZnS и их конъюгатов определяли летальные или смертельные дозы (ЛД), представляющие собой количество вещества, вызывающее гибель определенного количества животных, выраженного в процентах: ЛД0 (минимальную токсическую дозу), ЛД10, ЛД16, ЛД50 (среднесмертельную дозу), ЛД84 и ЛД100 (абсолютную смертельную дозу). Максимально переносимая доза (МПД) для НК CuInS2/ZnS и их конъюгатов составила 150 мг/кг. Изучение хронической токсичности in vivo показало, что НК CuInS2/ZnS не вызывали гибели мышей и не изменяли их поведенческие реакции. Проведенные исследования иммунотоксического действия НК CuInS2/ZnS в дозах, составляющих 1/10 от ЛД50, на мышах линии СВА×С57 BL/6 показали, что использованные наноматериалы не оказывают существенного влияния на гуморальный и клеточный иммунитет, не изменяют фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, а также не изменяют массу и клеточность центральных и периферических органов иммунной системы. Для изучения изменений в органах и тканях, индуцированных введением НК CuInS2/ZnS, нами была составлена и проанализирована гистологическая библиотека слайдов, соотвествующая протоколам инъекций и забору органов у экспериментальных животных (мыши). Морфологичесикй анализ приготовленных слайдов показал, что после инъекций всех гамм концентраций только для самой высокой концентрации НК (100 мг/кг) имелись незначительные участки некроза и сопутствующие незначительные воспалительные изменения в легких, печени и селезенки экспериментальных животных. В соответствии с планом работ в отчетном периоде была проведена характеризация оптических свойств, размера и заряда, а также оценка и мониторинг коллоидной стабильности водорастворимых гр-НК, предложеных в качестве рабочей альтернативы кремниевым НК, при 25°С и 37°С в течение 7 сут. Анализ коллоидной стабильности полученных гр-НК свидетельствует об отсутствии агрегации гр-НК, функционализированных гидроксиламином, в отличии от других образцов, как при при 25°С, так и при 37°С, что свидетельствует от том, что оптимальным лигандом для функционализации поверхности гр-НК для последующей получения нанометок является гидроксиламин. В связи с этим была разработана оптимальной стратегией для получения конъюгатов гр-НК и ОД-АТ-Cys на основе использования гетерофункционального кросс-линкера N-(p-малеимидофенил) изоцианата (PMPI) и были получены конъюгаты свежеприготовленных и высокоочищенных гр-НК, поверхность которых модифицирована с помощью гидроксиламина, с ОД-АТ, распознающих онкомаркеры CEA, HER2, а также gp120. Для анализа цитотоксичности гр-НК и их конъюгатов клетки линии фибробластов человека Wi38 инкубировали с различными разведениями наноматериалов на протяжении 24 часов или 48 часов. На основе полученных кривых зависимости выживаемости клеток от концентрации добавленных к ним препаратов были получены данные по ингибирующей концентрации IC50 – концентрации, при которой погибает 50% от пула клеток, на который было произведено токсическое воздействие. Полученные сопоставимые значения IC50 свидетельствует о том, что цитотоксические свойства гр-НК и конъюгатов на их основе определяются химическими свойствами поверхности НК, а не химическим составом ядра НК, при этом небольшие различия в цитотоксических свойствах гр-НК и конъюгатах на их основе, вероятно, определяются наличием молекул ОД-АТ в составе конъюгатов. Значение ингибирующей концентрации IC50 при инкубации наноматериалов с клетками в течение 48 часов также сопоставимы между собой, что еще раз свидетельствует о том, что относительные цитотоксические свойства НК различного химического составов остаются неизменными при сходных химических свойствах поверхности. Тем не менее, нельзя не отметить, что с увеличением времени экспозиции клеток в присутствии НК IC50 уменьшается, что может свидетельствовать о том, что при более долгом или хроническом воздействии НК на клетки их токсические эффекты могут усиливаться. В 2018 г. нами были получены результаты функционального тестирования наноматериалов: специфическое связывание конъюгата НК CuInS2/ZnS-HER2-ОД-АТ с рецептором HER2 на поверхности клеток линии SK-BR-3; конъюгата НК CuInS2/ZnS-EGFR-ОД-АТ с рецептором EGFR на поверхности клеток линий MDA-MB-231 и А431; конъюгата НК CuInS2/ZnS-СЕА-ОД-АТ с рецептором CEA на поверхности клеток линий Сасо-2 и НСТ- 116; конъюгата НК CuInS2/ZnS-EpCAM-ОД-АТ с рецептором EpCAM на поверхности клеток линий HepG2 и MCF7. Показано, что % положительных клеток в исследуемых популяциях при иммунодетекции клеток конъюгатами совпал с контрольными значениями, что свидетельствует о высоком потенциале полученных конъюгатов для дифференциальной иммунодетекции. Кроме того, в экспериментах с иммунодетекцией опухолевых клеток в смесях с клетками неопухолевой природы была показана способность приготовленных конъюгатов эффективно детектировать опухолевые клетки-мишени. В соответствии с утвержденным планом работ в 2018 г. было изучено взаимодействие водорастворимых НК CuInS2/ZnS и их конъюгатов с компонентами крови. Взаимодействие водорастворимых НК CuInS2/ZnS с эритроцитами крови в виде эритроцитарной массы разных разведениях изучали с использованием эритроцитарной массы донорской крови. Показано что во всех анализируемых образцах эритроциты сохраняют свою двояковогнутую форму и стандартные размеры (по сравнению с контролем). Кроме того, было также изучено влияние сыворотки и плазмы на оптические свойства и коллоидную стабильность водорастворимых НК CuInS2/ZnS и их конъюгатов. Полученные данные указывают на наличие эффекта тушения НК при инкубациях НК в цельной сыворотке и плазме, что может свидетельствовать о прямом взаимодействии НК с компонентами молекулярными компонентами крови.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Согласно утвержденному плану выполнения работ на третьем этапе (2019 г.) получены высокоочищенные с помощью металлоаффинной хроматографии препараты рекомбинантных однодоменных антител (ОД-АТ-Cys), содержащих дополнительный аминокислотный остаток цистеин на С-конце молекулы для ориентированного расположения молекул ОД-АТ после их химического конъюгирования, а также гистидиновый остаток для обеспечения высокоэффективной одностадийной очистки, распознающих онкомаркеры CEA, HER2, EGFR, EpCAM и контрольный белок gp120, в количестве не менее 10 мг каждого лота для дальнейшего конъюгирования с функционализированными графеновыми нанокристаллами (гр-НК) и создания нанозондов на их основе. На следующем этапе работы полученные образцы рекомбинантных ОД-АТ-Cys конъюгировали ориентированным образом для сохранения интактности активного центра ОД-АТ с гр-НК, которые предварительно синтезировали, функционализировали гидроксиламином с помощью карбодиимидного кросс-линкера и очищали от побочных продуктов реакции. Реакцию конъюгации проводили по разработанному на предыдущем этапе протоколу: сначала получали малеимид-активированные гр-НК, затем химически связывали активированные группы с экспонированной сульфгидрильной группой молекул ОД-АТ-Cys и проводили хроматографическую очистку наносенсоров. В соответствии с планом работ разброс концентраций полученных лотов конъюгатов составил 2,2 мг- 2,35 мг/лот. В 2019 г нами получены и проанализированы данные о цитотоксичности водорастворимых гр-НК и нанозондов на их основе в экспериментах с использованием модельных клеточных линий человека. Для анализа цитотоксичности водорастворимых гр-НК в сравнении с полученными конъюгатами гр-НК и ОД-АТ-Cys, использовали МТТ-тест, ввиду его доступности и доказанной на предыдущем этапе высокой корреляции с результатами тестирования по методу ToxiLight (Lonza). В качестве положительного контроля использовали высокотоксичные кадмий-содержащие ПЭГилированные НК CdSe/ZnS. Продемонстрировано, что гр-НК и их конюгаты с ОД-АТ (анти-EGFR) и с ОД-АТ (анти-EpCAM) практически не проявляют токсических свойств в выбранных для исследования концентрациях (0,8 мкг/мл – 800 мкг/мл) в отношении клеточных линий А431, положительной по экспрессии EGFR, и HepG2, положительной по экспрессии EpCAM. Кроме того, при максимально возможном увеличении концентраций гр-НК и их конъюгатов до 6 мг/мл также не удалось достигнуть ИК50. Таким образом, можно сделать заключение о низкой токсичности гр-НК и их конъюгатов in vitro по сравнению с кадмий-содержащими НК в использованных клеточных моделях в выбранном диапазоне концентраций. В отчетном периоде получены результаты тестирования нанозондов на основе конъюгатов водорастворимых графеновых НК и ОД-АТ-Cys, распознающих онкомаркеры CEA, HER2, EGFR и EpCAM ex vivo. Для анализа использовали ксенографты опухолей человека, полученные на иммунодефицитных мышах Balb/c nu/nu. В проведенных экспериментальных исследованиях показано: специфическое связывание конъюгата гр-НК-СЕА-ОД-АТ с рецептором CEA на поверхности клеток линий Сасо-2 и НСТ- 116; гр-НК-HER2-ОД-АТ с рецептором HER2 на поверхности клеток линии SK-BR-3; конъюгата гр-НК-EGFR-ОД-АТ с рецептором EGFR на поверхности клеток линий MDA-MB-231 и А431; гр-НК-EpCAM-ОД-АТ с рецептором EpCAM на поверхности клеток линий HepG2 и MCF7. Отсутствие неспецифического связывания нанозондов на основе конъюгатов водорастворимых гр-НК и ОД-АТ было показано в результате инкубации с клетками, не экспрессирующими рецепторы-мишени и последующего анализа с помощью метода проточной цитометрии. Кроме того, в экспериментах с иммунодетекцией опухолевых клеток в смесях с клетками неопухолевой природы была показана способность приготовленных конъюгатов дифференцировано детектировать клетки-мишени. В 2019 г также были продолжены исследования коллоидной стабильности функционализированных гр-НК и их конъюгатов и проанализировано изменение агрегатного состояния нанообъектов при длительных инкубациях при 37Сº в культуральной среде RPMI без сыворотки и с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, а также в сыворотке крови. Было показано, что гр-НК имеют тенденцию к агрегации , причем в присутствии сыворотки ) данная тенденция выражена сильнее. Это может быть связано как со слипанием гр-НК вследствие их двухмерной геометрии, так и с взаимодействием с компонентами сыворотки. Химическое связывание гр-НК с белками в составе конъюгатов увеличивает коллоидную стабильность гр-НК, что может быть связано с наличием экранирующего слоя ОД-АТ на поверхности НК. В соответствии с планом работ отчетного периода была изучена острая токсичность полученных гр-НК in vivo в диапазоне доз от 120 до 300 мг/кг веса животного при однократном и 5-кратном в течение суток введении исследуемых гр-НК. Дозы вводились мышам гибридам (CBA х C57Bl/6J) F1 самцам и самкам внутривенно. Ввиду хорошей переносимости животными, летальная доза не была определена, клинические проявления токсичности и изменения в поведенческих реакциях отсутствовали. После увеличения суммарной дозы до 900 мг/кг влияния на животных в отношении их поведения, изменения массы тела и других проявлений токсичности не было обнаружено за 60 дней наблюдения. Гематологическое исследование не показало каких-либо изменений по сравнению с контролями. Патоморфологическое исследование внутренних органов по окончании эксперимента показало отсутствие каких-либо изменений по сравнению с контрольными животными. В рамках изучения биосовместимости водорастворимых гр-НК и их конъюгатов с компонентами крови и тканевой жидкости, а также путей и механизмов их распределения в организме in vivo была проведена комплексная оценка их биораспределения в течении двух часов после ретроорбитальной инъекции гр-НК, меченых технецием-99, здоровым самцам мышей Balb/c. Установлено, что гр-НК, аккумулировали в печени (23,14%) и селезенке (0,61%). Количества, поглощаемые тонкой кишкой (29,35%) и толстой кишкой (5,85%), по-видимому, подтверждают энтерогепатическую экскрецию гр-НК, поглощаемых печенью. Аккумуляция НК в обоих почках составила суммарно 24,97%. Наличие клиренса НК подтверждается обнаружением наночастиц в мочевом пузыре (4,27%). Установлено, что гр-НК плохо проникают через гематоэнцефалический барьер и, как следствие, практически не обнаруживаются в мозге (0,07%). Кроме того, в 2019 г были проведены дополнительные исследования, связанные с изучением молекулярной токсичности НК, гидродинамический диаметр которых составлял 12.0 ± 1.5 нм и стабильных при инкубации при 37 Сº в интервале значений pH 6,0-8,0 на примере их взаимодействия с модельным белком, не обладающим амилоидогенным поведением в физиологических условиях, – инсулином человека. Проведенные нами эксперименты показали, что гидроксилированные НК, в отличии от положительно или отрицательно заряженных НК, индуцируют образование амилоидных фибрилл и метастабильных агрегатов рекомбинантного инсулина человека в физиологических условиях. При помощи высокоскоростной атомно-силовой микроскопии показано, что через час после начала инкубации мономеров инсулина с КТ отмечается начало процесса формирования протофибрилл инсулина длиной 22,4±4,5 нм, а ещё через час отмечается существенное увеличение протофибрилл инсулина в размерах до 51,7±9,0 нм. В течение последующих двух часов процесс амилоидизации продолжался, и размер фибрилл увеличился до 133,6±17,6 нм, что свидетельствует о высокой скорости процесса их образования. На основании данных можно сделать предположение о том, что взаимодействие молекул инсулина с поверхностью НК индуцирует конформационную нестабильность молекулы белка и образование комплексов с измененной конформацией, которые могут служить центрами образования фибрилл. Полученные данные необходимо учитывать при разработке нетоксичных наноматериалов. Полученные данные несомненно имеют важное фундаментальное значение для дизайна нанозондов на основе НК. Таким образом, при конструировании диагностических нанозондов на основе биомолекул, распознающих специфические мишени, и наноматериалов, необходимо не только учитывать химический состав нанокристаллов, но также размеры нанозондов, их поверхностные свойства, в частности, заряд, наличие дополнительных лигандов, геометрические свойства поверхности и т.д. Дальнейшие исследования в области квенчирования неактивной с точки зрения распознавания билогических мишеней поверхности, а также подбора дополнительных агентов для увеличения общей инертности позволят добиться еще большей оптимизации разработанных нами активных нанозондов на основе нетоксичных коллоидных нанокристаллов.