Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Среди множества клеток-источников микровезикул (МВ) особый интерес представляют естественные киллеры (NK-клетки) – субпопуляция лимфоцитов, осуществляющая кон-тактный цитолиз вирус-инфицированных и опухолевых клеток. Имеются косвенные данные о способности NK-клеток продуцировать МВ, так как такие МВ с фенотипом CD56, а также МВ лейкоцитарного происхождения с различным фенотипом обнаружены в плазме периферической крови. Целью настоящего исследования явилось изучение фе-нотипа, состава и функциональной активности МВ, образуемых NK-клетками. Сравни-тельный анализ спонтанной экспрессии рецепторов при помощи проточной цитофлуо-риметрии показал, что МВ, как и клетки-источники (клетки линии NK-92), обладают раз-ным профилем экспрессии некоторых молекул. Культивирование NK-клеток в присут-ствии индукторов приводило к изменению фенотипа как самих клеток, так и МВ, образу-емых ими. По данным проведенного WesternBlot анализа в присутствии указанных ин-дукторов также изменялось содержание перфорина и гранзима B в составе МВ. Установ-лено, что МВ содержат большое количество различных белков, влияют на цитотоксич-ность NK-клеток и снижают жизнеспособность клеток-мишеней. С помощью моноклональных антител (МКАТ) к эндоглину человека (CD105) исследова-ли судьбу молекул эндоглина, экспрессированных на цитоплазматической мембране кле-ток эндотелия линии EA.hy926 и мезенхимных стромальных клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека, а также эффект МКАТ к разным эпитопам антигена на функцоинальные свойства клеток. Клетки культивировали от 1 до 96 ч в среде, содержа-щей 5 мкг/мл МКАТ против эндоглина. С помощью МКАТ против эндоглина исследова-ли интенсивность обмена CD105 на клетках и проследили судьбу этих молекул эндогли-на. Клетки эндотелия и МСК инкубировали в течение 1 ч в среде с МКАТ, после чего ан-титела удаляли и продолжали культивирование клеток в обычной ростовой среде. Пока-зано, что молекулы эндоглина находятся на цитоплазматической мембране клеток в тече-ние длительного времени, часть из них подвергается интернализации в эндосомы клеток, а часть – сбрасывается в культуральную среду. Спустя 2 ч после внесения метки в пери-нуклеарном пространстве клеток эндотелия появлялись множественные эндосомы, со-держащие эндоглин в комплексе с МКАТ. Аналогичные эндосомы в МСК появлялись лишь на следующие сутки эксперимента. Через 72 ч после внесения метки на цитоплазма-тической мембране клеток отмечена значительная убыль молекул эндоглина, связанных с МКАТ. К этому сроку метку выявляли на поверхности 50-75% МСК и лишь на 5-7% кле-ток эндотелия. Процесс сброса эндоглина с мембраны в культуральную среду («шеддинг») оценивали с помощью ИФА. Благодаря созданной в лаборатории высоко чувствительной системе ИФА впервые показан «шеддинг» эндоглина культурами МСК. Установлено, что сброс молекул эндоглина протекает значительно менее интенсивно на МСК, по сравнению с клетками эндотелия. Проведенный комплекс экспериментов пока-зал, что обмен молекул эндоглина на клетках эндотелия происходит существенно быст-рее, чем на МСК. Исследованы эффекты длительного культивирования клеток эндотелия в среде, содержащей МКАТ против эндоглина, на функциональную активность клеток. Присутствие МКАТ в культуральной среде снижало миграционную активность клеток, а также приводило к изменениям в организации их актинового цитоскелета, которые вы-ражались в формировании крупных глобулярных структур и снижении плотности фиб-риллярного компонента. Антитела замедляли закрытие «раны» в монослое клеток эндо-телия и отменяли стимулирующий миграцию эффект TNF и TGFВыраженность эф-фектов МКАТ, направленных к различным эпитопам эндоглина, варьировала. МКАТ, распознающие разные эпитопы молекулы эндоглина, оказывали не одинаковое влияние на сбрасывание рецептора и образование sEng. Для выполнения этих экспериментов бы-ли разработаны две оригинальные системы иммуноферментного анализа, позволявшие детектировать sEng в присутствии МКАТ против эндоглина. Одно из МКАТ практически полностью блокировало образование sEng, другие – в меньшей степени ингибировали этот процесс. Факт снижения интенсивности «шеддинга» эндоглана с помощью МКАТ описан впервые. Было показано, что ни одно из МКАТ не оказывало существенного вли-яния на пролиферацию как интактных клеток эндотелия EA.hy926, так и клеток, стиму-лированных цитокинами. С использованием методов генной инженерии в клетках HEK293 был синтезирован рекомбинантный белок, соответствующий экстраклеточному фрагменту эндоглина (АКО 26-586). Рекомбинантный эндоглин был представлен моно-мерами (75 кДа) и димерами (150кДа). Из плазмы крови доноров методами иммуноаф-финной хроматографии был выделен естественный sEng, который представлял смесь ми-нимум четырех фракций: помимо димеров в образце присутствовали мономеры с различ-ным молекулярным весом (81, 70 и 65 кДа). В результате выполненного исследования было показано, что среди полученных МКАТ против эндоглина, имеются реагенты, спо-собные воздействовать на разные функциональные свойства клеток, экспрессирующих мембранный антиген CD105. Cинтезированы новые пептидные носители, модифицированные лигандами рецептора CD51, а также сигналом ядерной локализации вируса SV40. Определены оптимальные зарядовые соотношения для формирования комплексов с ДНК и интерферирующими РНК и изучены их физико-химические и защитные свойства. Изучено влияние модифи-каций пептидных носителей на токсические свойства их комплексов с нуклеиновыми кислотами и исследованы особенности клеточной интернализации комплексов, модифи-цированных лигандами рецептора CD51, на клетках с разным содержанием данного ре-цептора. Выявлено, что эффективность проникновения ДНК в клетки зависит от количе-ства лиганда в составе комплексов и от уровня поверхностного присутствия рецептора CD51/CD61 на клетках разных культур.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Среди множества клеток-источников микровезикул (МВ) особый интерес представляют моноциты\макрофаги. Эти клетки регулируют иммунный ответ, являются источником цитокинов и активных кислородных радикалов [17], участвуют в репарации и ремодели-ровании тканей, контролируют ангиогенез [21]. Целью настоящего исследования явилось изучение состава, фенотипа и функциональной активности МВ, образуемых моноцито-подобными клетками линии THP-1. Проведён анализ морфологии МВ. Анализ фенотипа МВ клеток линии THP-1, показал, что на них экспрессированы рецепторы, характерные для клетки источника. Активация IL-1β клеток линии THP-1 не вызывала изменения фе-нотипа МВ по сравнению с контролем. При анализе состава МВ методом WesternBlot нам не удалось обнаружить белки, экспрессируемые в клетках, а именно, меиелопероксидазу и каспазу-3. Установлено, что МВ клеток линии THP-1 снижают пролиферацию эндоте-лиальных клеток линии EA.Hy926. Активация IL-1β клеток линии THP-1 отменяла инги-бирующий эффект их МВ в отношении пролиферации эндотелиальных клеток линии EA.Hy926. Установлено, что МВ клеток линии THP-1 увеличивают миграцию эндотели-альных клеток линии EA.Hy926. Активация IL-1β клеток линии THP-1 не отменяла ин-гибирующий эффект их МВ в отношении миграции эндотелиальных клеток линии EA.Hy926. Установлена передача ковалентно меченых белков в составе микровезикулы от клеток линии THP-1 эндотелиальным клеткам линии EA.Hy926. Нами установлено также, что активированный трофобласт регулирует ангиогенез за счет продукции раство-римых факторов, воздействуя на эндотелиальные клетки прямо или опосредованно через активацию проангиогенной активности NK-клеток. Двухлетняя работа в рамках гранта позволила выявить в панели моноклональных антител (МКАТ) к эндоглину (CD105), включавшей 8 реагентов, два антитела (2С8 и 4Е4), которые обладали выраженными анти-ангиогенными свойствами. Добавление этих МКАТ в ростовую среду клеток EA.hy926, обладающих основными характеристиками эндотелия, приводит к ингибированию формирования капилляро-подобных структур в матригеле. Однако полученные данные свидетельствуют о том, что реализация анти-ангиогенных свойств рассматриваемых реагентов происходит за счет различных меха-низмов. Так в присутствии МКАТ 2С8 наблюдалось снижение скорости миграции и про-лиферации клеток EA.hy926, морфологически выраженные изменения в организации ак-тинового цитоскелета клеток и снижение адгезии к клеткам моноцитарных линий THP-1 и U937. Добавление в ростовую среду МКАТ 4Е4 приводило к снижению скорости ми-грации клеток эндотелия EA.hy926, снижению адгезии к твердому субстрату, но увели-чению адгезии к клеткам моноцитарных линий THP-1 и U937. С помощью метода про-точной цитофлуориметрии получены данные, свидетельствующие о том, что изменения в адгезионных свойствах клеток эндотелия EA.hy926, наблюдаемые при добавлении МКАТ, не связаны с изменениями в уровнях экспрессии основных адгезионных молекул клеток эндотелия. В рамках темы гранта был впервые изучен феномен молекулярной ге-терогенности растворимого эндоглина. Показано, что молекулы антигена, обнаруживае-мые в плазме крови, моче и ростовых средах клеток эндотелия EA.hy926 и клеток тро-фобласта JEG-3 представляют собой смесь олигомеров, димеров и мономеров; мономеры, в свою очередь, при электрофорезе в денатурирующих условиях образуют три фракции с различным молекулярным весом (80, 65 и 55 кДа). На базе МКАТ к эндоглину 4Е4 и 4С9 была создана и охарактеризована высокочувствительная иммуноферментная система, ко-торая позволяет проводить количественное определение гетерогенных молекул раство-римого эндоглина в различных биологических жидкостях (плазме крови, моче, ликворе и ростовых средах клеточных культур). С ее помощью было показано увеличение концен-трации антигена в плазме крови и моче беременных женщин с тяжелой преэклампсией по сравнению с пациентками с умеренной преэклампсией и неосложненной беременностью. В экспериментах in vitro показано, что рекомбинантные молекулы растворимого эндо-глина в нормальной концентрации способны вызывать увеличение скорости миграции клеток EA.hy926. Однако дальнейшее увеличение содержание антигена до уровней, наблюдаемых у пациенток с преэклампсией, не вызывало значимых изменений в мигра-ционной активности клеток. Были изучены трансфекционные свойства и определена специфичность доставки генети-ческих конструкций в составе комплексов ДНК с пептидными носителями, модифициро-ванными лигандами iRGD, на клетках вторичных культур с разным уровнем экспрессии CD51. Также были изучены трансфекционные свойства комплексов малых интерфериру-ющих РНК против гена GFP и гена анти-ангиогенного фактора VEGF с пептидными но-сителями, модифицированными лигандами рецептора CD184 и CD51. Была оценена про-лиферация и миграция эндотелиальных клеток, трансфецированных анти-VEGFA миРНК. Было завершено исследование группы пептидных носителей, модифицирован-ных сигналом ядерной локализации вируса SV40. Эффективность доставки плазмидной ДНК в ядро была определена количественно биохимическим и цитологическим метода-ми.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За третий год изучения функциональных свойств и состава микровезикул (МВ) при помощи атомно-силовой микроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии нам удалось установить данные о размерах и морфологии МВ, продуцируемых эндотелиальными клетками (ЭК) линии EA.hy926 и клетками трофобласта линии Jeg-3. Оценка белковых профилей показала, что в клетках линии NK-92 и их МВ при спонтанном культивировании выделяются 12 и 5 мажорных групп белков, соответственно. MALDI-масс-спектрометрический анализ показал, что клетки линии NK-92 и их МВ предположительно содержат в своем составе белки из группы MAP-киназ. В клетках был обнаружена MEKKK 1 (MAPK/ERK kinase kinase kinase 1, кодируемая геном MAP4K1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1 isoform 1) (SwissProt entry Q92918, MW 91.2 kDa, pI 8,65, 8 триптических пептидов, перекрывающих 2% аминокислотной последовательности белка), в микровезикулах - Mnk1 (кодируемая геном MKNK1 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 isoform 1) (SwissProt entry Q9BUB5, MW 51.3 kDa, pI 6.26, 6 триптических пептидов, перекрывающих 4% аминокислотной последовательности). Нами установлено, что миграционная активность ЭК линии EAHy926 в присутствии МВ клеток линии NK-92 снижается за счет уменьшения количества мигрировавших ЭК по сравнению с культивированием ЭК без МВ. Анализ содержания гранзима B при помощи WesternBlot показал, что после инкубации ЭК линии EA.Hy926 в среде, содержащей МВ клеток линии NK-92, происходит перенос гранзима B из МВ в ЭК. Нами установлено, что в клетках линии EA.Hy926 после их культивирования с МВ происходит активация каспазы-8 только до уровня фрагмента p43/41. Параллельно в тех же ЭК, полученных после их культивирования с МВ, активация каспазы-3 и каспазы-9 была выше по сравнению с интактными клетками линии EA.Hy926. Установлено, что МВ клеток линии NK-92 и клеток линии THP-1 дозозависимо увеличивали длину и количество сосудов, образованных ЭК. Анализ экспрессии молекул на ЭК после их культивировании c МВ клеток линии ТНР-1 показал, что в результате такого культивирования не происходит изменения фенотипа ЭК. Изучение влияния депривации VEGF при помощи моноклональных антител против VEGF на образование сосудов эндотелием в присутствии макрофагов показало, что при удалении VEGF-A из среды ЭК проявляют пластичность и и формируют болеее длинные сосуды, изменяют экспрессию рецепторов к VEGF. Макрофаги играют роль регулятора активности ЭК за счет секреции цитокинов, в том числе VEGF, а также благодаря контактным взаимодействиям с ЭК. Клетки линии THP-1 повышают чувствительность ЭК к VEGF за счет стимуляции экспрессии VEGFR1 и VEGFR3, данный эффект является VEGF-A-независимым. Цитокины IL-1β, IL-6, TNFα самостоятельно стимулируют неразветвляющий ангиогенез, увеличивая длину сосудов. Параллельно IL-1β увеличивает экспрессию VEGFR1 на поверхности ЭК, а IL-6 и TNFα, наоборот, снижают ее, тем самым регулируя чувствительность ЭК к VEGF. При этом эффекты данных цитокинов не зависят от VEGF-A. IL-1β, IL-6, TNFα способствуют приобретению клетками линии THP-1 антиангиогенных свойств, что не зависит от VEGF-A, а также от экспрессии его рецепторов эндотелиальными клетками. Таким образом, VEGF является важным, но не единственным фактором, контролирующим ангиогенез. В условиях недостатка VEGF либо сами ЭК, либо клетки микроокружения способны компенсировать его функциональную нагрузку за счет продукции других ростовых факторов (более подробно данные представлены в статье, приложенной к отчету). В третий год выполнения проекта проведено исследование действия двух МКАТ к эндоглину человека, направленных к неперекрывающимся эпитопам антигена, на первичные культуры клеток эндотелия HUVEC. Оба исследованных антитела демонстрировали анти-ангиогенное действие в экспериментах in vitro. Внесение этих реагентов приводило к двукратному снижению числа капилляро-подобных структур, формируемых клетками в матригеле. Сравнительное изучение действия двух МКАТ на клетки эндотелия в функциональных тестах показало наличие общих черт в механизмах реализации их анти-ангиогенного действия. Полученные данные свидетельствуют о том, что в присутствии МКАТ происходит снижение способности клеток к адгезии к внеклеточному матриксу и миграции. Ингибирующий эффект МКАТ проявляется при сочетанном внесении МКАТ и TGF-β1, но не BMP-9. Это свидетельствует о возможном усилении активности сигнального пути TGF-β в присутствии рассматриваемых МКАТ. Аналогичное ингибирование адгезии к твердому субстрату и миграции выявлено при культивировании клеток в условиях гипоксии. По всей видимости, наблюдаемые эффекты связаны с эндогенным синтезом TGF-β клетками эндотелия, находящимися в гипоксических условиях. Во всех экспериментах, в которых было выявлено наличие модулирующего эффекта МКАТ на клетки эндотелия HUVEC, действие антитела 2С8 было более выраженным по сравнению с МКАТ 4Е4. Таким образом, в результате проведенных исследований выявлено одно МКАТ с выраженным анти-ангиогенным свойством и раскрыт механизм его реализации. В результате выполнения проекта осуществлено направленное подавление ангиогенеза с помощью нуклеопептидных комплексов. миРНК против генов VEGFA, VEGFR1 и эндоглина были доставлены в клетки эндотелия с помощью невирусных носителей, модифицированных лигандом к рецептору CXCR4. Были использованы также комбинации вышеописанных миРНК. Была проведена сравнительная оценка уровня пролиферации и миграции протрансфецированных клеток и сделан вывод об эффективности подавления ангиогенеза при использовании различных миРНК и их сочетаний в составе нуклеопептидных комплексов.