КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-15-01175

НазваниеИсследование ключевых параметров клеток мозга на ранних стадиях развития ишемического инсульта.

РуководительБилан Дмитрий Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2017 - 2019  , продлен на 2020 - 2021. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словаинсульт головного мозга, ишемия-реперфузия, нейроны, астроциты, генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы, флуоресцентная микроскопия

Код ГРНТИ34.15.43


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Инсульт головного мозга является важнейшей проблемой современного человечества. По данным Всемирной Организации Здравоохранения инсульт уверенно занимает вторую позицию в списке причин преждевременной смертности населения по всему миру после ишемической болезни сердца. Кроме того, это заболевание является одной из самых распространенных причин инвалидности. По данным статистики не более 10 – 13% людей, перенесших инсульт, полностью выздоравливают, остальные умирают или становятся инвалидами. При этом эффективная терапия лечения или мероприятия по профилактике инсульта до сих пор отсутствуют. Исследование патологических процессов тканей мозга, сопровождающих развитие инсульта, является важнейшей задачей современной фундаментальной науки. На сегодняшний день нам мало что известно о клеточных процессах, протекающих в мозге при развитии этой патологии. Основные результаты в этой области были получены, как правило, в системах in vitro на экстрактах тканей. Однако инсульт имеет очень сложную патофизиологию, затрагивающую различные системы организма. Поэтому крайне важны исследования инсульта на моделях in vivo. Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы являются современным и высоковостребованным подходом в исследованиях многих биологических процессов. Они позволяют регистрировать внутриклеточные параметры в режиме реального времени в живых системах любого уровня сложности от отдельных компартментов клетки до тканей целостных организмов. Подобные индикаторы имеют белковую природу, их молекулы, как правило, состоят из сенсорной части, которая специфично взаимодействует с исследуемым клеточным параметром, и флуоресцентной части, которая визуализирует эти взаимодействия. За последние годы генетически кодируемые индикаторы приобрели широкую популярность во всем мире в качестве надежного, во многих случаях безальтернативного метода исследования. В рамках настоящего Проекта с помощью генетически кодируемых индикаторов мы впервые исследуем in vivo динамику некоторых важнейших показателей клеток мозга при ишемическом инсульте на ранних стадиях развития. Для этого в кору головного мозга крыс мы инъецируем аденоассоциированные вирусы, кодирующие индикаторы для регистрации пероксида водорода (Н2О2), рН, соотношений НАД+/НАДН и GSSG/2GSH. При развитии инсульта у этих животных, вызванного окклюзией средней мозговой артерии, с помощью флуоресцентной микроскопии мы сможем наблюдать через краниальное окно динамику интересующих внутриклеточных процессов в коре головного мозга в режиме реального времени. Более того, экспрессируя индикаторы в нейронах и астроцитах, мы сможем сравнить динамику важных биологических параметров в разных клетках мозга при одних и тех же патологических условиях. Это исследование будет проведено впервые в мире. Однако далеко не все внутриклеточные процессы можно исследовать с помощью генетически кодируемых индикаторов, поскольку на сегодняшний день многие еще не созданы. Поэтому в наших исследованиях внутриклеточных процессов мозга при ишемии мы также будем применять классические подходы биохимического анализа тканей. В частности, мы определим соотношения НАДФ+/НАДФН и GSSG/2GSH, выясним, как изменяется биосинтез жирных кислот и холестерола, определим окислительные повреждения белкового и липидного составов мозговой ткани. Мы также выясним, как изменится динамика и объем поражения ишемического инсульта при ингибировании некоторых ключевых белков антиоксидантной системы защиты клеток. Вероятность возникновения инсульта и степень тяжести его последствий у людей коррелируют с возрастом. Пожилые люди находятся в группе риска. При этом исследования патологии инсульта на моделях животных разных возрастных групп проводятся крайне редко. Не исключено, что патогенез может иметь отличия в тканях мозга молодых и старых животных. Мы проведем наши in vivo исследования на животных разных возрастных групп.

Ожидаемые результаты
В рамках настоящего Проекта мы проведем масштабные исследования ключевых внутриклеточных параметров мозга при развитии ишемического инсульта на ранних стадиях. Используя генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы, мы впервые визуализируем динамику таких важных показателей, как концентрация Н2О2, рН, соотношения НАД+/НАДН и GSSG/2GSH, в нейронах и астроцитах коры головного мозга млекопитающих (на модели крысы) при развитии инсульта в режиме реального времени. Кроме того, мы проведем сравнительный анализ динамики этих параметров при инсульте в клетках мозга у животных разных возрастов. Ранее такие исследования не проводились, при этом у людей вероятность инсульта и тяжесть повреждения зависят от возраста. В дополнение ко всему, мы проведем биохимический анализ ишемизированной ткани мозга, что позволит нам получить больше информации о патофизиологии этого заболевания на ранних стадиях. Полученные нами результаты несомненно внесут вклад в общее понимание патофизиологических процессов в тканях мозга при инсульте. Уникальность нашего исследования заключается в том, что мы сосредоточимся на изучении процессов на ранних стадиях патологии. Результаты, полученные в ходе реализации настоящего Проекта, будут представлять ценность не только для понимания фундаментальных механизмов патофизиологии инсульта, но и могут оказаться полезными для разработки новых подходов терапии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Используя классические методы определения биохимических параметров, мы не выявили их изменений в тканевых экстрактах мозга крыс в острой фазе развития ишемического инсульта. Например, уровни восстановленного глутатиона, холесторола, свободных жирных кислот заметно снижаются лишь через 24 часа с момента начала ишемии. По этой причине визуализация динамики изменения метаболических и окислительно-восстановительных параметров клеток in vivo в режиме реального времени в локальной зоне мозга с помощью генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров представляет собой крайне актуальное и перспективное направление в области исследований патогенеза инсульта. Данный подход позволит регистрировать события в ткани мозга уже с первых минут развития повреждения. С помощью аденоассоциированных вирусов мы экспрессировали в клетках коры головного мозга крыс биосенсор SoNar для регистрации соотношения НАД+/НАДН. Далее с помощью специально собранной установки, подключаемой к вживленным в мозг животного оптическим волокнам, мы регистрировали in vivo, как изменяется флуоресцентный сигнал биосенсора в коре головного мозга при развитии ишемического инсульта. По нашим предварительным результатам масштабные окислительно-восстановительные события происходят не только в области поражения, но и в здоровом полушарии мозга. Наиболее выраженные изменения мы наблюдали в острой фазе ишемии-реперфузии. Данный метод изучения биохимических процессов in vivo при инсульте был применен впервые. На следующем этапе проекта мы планируем исследовать с помощью генетически кодируемых биосенсоров, как изменяются некоторые ключевые внутриклеточные параметры при развитии этой патологии отдельно в нейронах и клетках глии, а также в их компартментах.

 

Публикации

1. Д. С. Билан, В. В. Белоусов In vivo imaging of hydrogen peroxide with HyPer probes. Antioxidants & Redox Signaling, - (год публикации - 2017).

2. Д. С. Билан, И. В. Кельмансон, В. В. Белоусов Влияние типа анестезии и условий прокрашивания тканей мозга красителем 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым (ТТХ) на оценку ишемического повреждения мозга крыс на ранних стадиях патогенеза. Вестник РГМУ, - (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Мы завершили часть Проекта, посвященную биохимическому анализу тканей мозга крыс при ишемии. Мы выявили, что использование классических биохимических подходов позволяет обнаружить изменения некоторых важных внутриклеточных параметров не ранее чем через 6 часов с момента начала развития патологии. При определении некоторых параметров (например, малонового диальдегида) достоверную разницу удалось зафиксировать лишь через сутки. Поэтому развитие подходов, позволяющих исследовать патогенез инсульта in vivo с первых секунд его развития, является крайне востребованным направлением. С помощью генетически кодируемых биосенсоров (SoNar, HyPer-3 и SypHer3s) мы исследовали, как изменяются такие внутриклеточные параметры, как соотношение НАД+/НАДН, концентрация пероксида водорода (Н2О2) и рН в условиях гипоксии в клетках нейробластомы SH-SY5Y, демонстрирующих нейрон-подобный фенотип. С первых минут гипоксии мы наблюдали значительное увеличение НАДН в цитоплазме клеток, что вероятно связано с активацией гликолиза. Последующая реоксигенация вновь нормализует соотношение НАД+/НАДН. Кроме того, гипоксия приводит к понижению рН цитоплазмы. Несмотря на общепринятое мнение о масштабной генерации активных форм кислорода (АФК) при ишемии-реперфузии, в данной системе мы зарегистрировали небольшое изменение сигнала биосенсора на Н2О2. Возможно, потому что биосенсор был локализован в цитоплазме, в то время как генерацию АФК при реоксигенации обычно приписывают митохондриям. Мы косвенно это проверили с помощью нового редокс-биосенсора, который мы разработали и протестировали во многих биологических системах в рамках настоящего Проекта. Новый биосенсор позволяет визуализировать динамику редокс-состояния пула глутатиона. Мы показали, что при гипоксии и последующей реоксигенации внутриклеточный глутатион значительно меняет свой редокс-статус именно в матриксе митохондрий, в то время как в цитоплазме этих же клеток изменений не происходит (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231718309340?via%3Dihub). Для in vivo системы мы получили коллекцию аденоассоцированных вирусов (AAV9 и AAV2), несущих гены биосенсоров SoNar (для регистрации соотношения НАД+/НАДН), HyPer-3 (для регистрации Н2О2) и SypHer3s (для регистрации рН) под общим промотором САG, а также специфическими промоторами hSyn1 (для экспрессии в нейронах) и GFAP (для экспрессии в астроцитах). Также были получены конструкции, содержащие сигнальные последовательности, для направленной локализации указанных биосенсоров в матриксе митохондрий выбранных типов клеток. Все полученные вирусы были протестированы на культуре клеток и в тканях мозга крыс. С помощью собранной высокочувствительной установки мы исследовали динамику биосенсоров SoNar, HyPer-3 и SypHer3s в коре головного мозга крыс при развитии ишемического инсульта в режиме реального времени. Для этого в кору головного мозга крыс в оба полушария были инъецированы соответствующие вирусы и имплантированы в эти же области мозга оптические волокна. Далее этим животным проводилась хирургическая операция по окклюзии средней мозговой артерии, приводящая к развитию ишемического инсульта. Регистрацию параметров мы проводили одновременно в двух полушариях мозга с момента введения животного в наркоз. Мы обнаружили, что после начала ишемии в коре больного полушария начинаются волнообразные изменения рН, выражающиеся быстрым закислением среды с последующим более медленным восстановлением. За период гипоксии, длившейся 90 минут, у большинства животных мы регистрировали как минимум две таких волны. Столь сильные изменения рН влияли на сигнал биосенсоров HyPer-3 и SoNar. По предварительным нашим результатам мы не зафиксировали мощной генерации Н2О2 при ишемии, в то время как биосенсор SoNar демонстрировал отличающуюся динамику сигнала, связанную вероятнее всего с увеличением в ткани НАДН. Окончательные выводы будут сделаны после дополнительной серии экспериментов. При восстановлении кровотока мы наблюдали мгновенное снижение рН, причем не только в области повреждения мозга, но и в здоровом его полушарии. Этот результат позволяет сделать вывод о том, что при ишемии-реперфузии резкое снижение рН характерно для всех тканей мозга, в том числе в областях, удаленных от самого очага инсульта. Данное наблюдение может оказаться крайне важным для изучения патогенеза инсульта и подбора терапии лечения. Кроме того мы усовершенствовали конструкцию установки и используемые нами методы, что позволит нам регистрировать исследуемые параметры одновременно в трех координатах мозга. С помощью нового подхода мы сможем регистрировать изменение параметров в ядерной зоне инсульта, а также формирующейся позже зоне ишемической полутени или, так называемой, зоне пенумбры, параллельно регистрируя при этом события в тканях здорового полушария. В настоящий момент мы полностью завершили тестовые эксперименты.

 

Публикации

1. Костюк А.И., Котова Д.А., Демидович А.Д., Панова А.С., Кельмансон И.В., Белоусов В.В., Билан Д.С. Изменение ключевых параметров метаболизма липидов в тканях мозга крыс при перманентной ишемии Вестник РГМУ, - (год публикации - 2018).

2. Костюк А.И., Панова А.С., Билан Д.С., Белоусов В.В. Redox biosensors in a context of multiparameter imaging Free Radical Biology and Medicine, 128 (2018),23-39 (год публикации - 2018).

3. Шохина А.Г., Костюк А.И., Ермакова Ю.Г., Панова А.С., Староверов Д.Б., Егоров Е.С., Баранов М.С., Качински Д.М., Бэль Г.Ж., Белоусов В.В., Билан Д.С. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry Redox Biology, - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Мы полностью завершили тестирование полученной коллекции аденоассоциированных вирусов (серотипы 9 и 2/1), несущих гены биосенсоров SypHer3s, HyPer-3 и SoNar с использованием промоторов CAG, hSyn1 и GFAP. Биосенсор SoNar был протестирован в матриксе митохондрий в культуре клеток, однако полученная версия демонстрирует смешанный тип внутриклеточной локализации, поэтому не может быть использована in vivo. На предыдущих этапах Проекта регистрацию флуоресцентного сигнала биосенсоров проводили в коре головного мозга крыс в области, совпадающей с ишемической полутенью. К настоящему момент удалось инъецировать вирусные частицы и имплантировать оптические волокна в хвостатое ядро мозга обоих полушарий, таким образом, регистрировать биохимические события стало возможно непосредственно в ядерной зоне инсульта, формирующейся после окклюзии средней мозговой артерии. При развитии ишемического инсульта в нейронах и астроцитах в зоне повреждения происходят значительные изменения внутриклеточного рН. Для определения точного значения рН экспериментальная установка была откалибрована, для этого при одинаковых настройках сигнал рН-биосенсора SypHer3s был точным образом измерен на выделенном препарате белка при заданном значении рН в диапазоне 3,0 – 9,5, а также в цитоплазме клеток при использовании подхода точного изменения рН внутриклеточной среды в диапазоне 5,5 – 8,5. На основе полученных результатов была построена точная зависимость значения флуоресцентного сигнала от величины рН. При использовании одинаковых настроек оптическая установка позволяет с высокой точностью определить значение рН в тканях мозгах in vivo. В результате была зафиксирована динамика изменения рН в цитоплазме и матриксе митохондрий в нейронах и астроцитах в области хвостатого ядра головного мозга, эта структура попадает в ядерную зону инсульта. В этой точке головного мозга при окклюзии средней мозговой артерии происходит резкое снижение внутриклеточного рН в течение нескольких минут. В цитоплазме нейронов исходное среднее значение рН 7.71±0.17 снизилось до значения 7.06±0.15. В матриксе митохондрий нейронов значение рН 7.9±0.04 снизилось до значения 6.84±0.1. Пониженные значения рН сохраняются на протяжении всей длительности ишемии (60 минут). При восстановлении кровотока значение рН увеличивалось и достигало первоначальных значений в течение двух часов с момента реперфузии. Для астроцитов была зафиксирована схожая динамика изменения рН. В цитоплазме астроцитов исходное значение pH 7.68±0.03 при ишемии снизилось до значения 6.97±0.07 с последующим медленным увеличением до исходного значения после реперфузии. В матриксе митохондрий значение рН 7.69±0.02 снижалось до значения 6.96±0.08 при ишемии, после чего медленно возвращалось к норме после реперфузии. В этой же области мозга здорового полушария мы не зарегистрировали изменений рН в нейронах и астроцитах. Примечательно, что результаты отличаются от полученных ранее в коре головного мозга. В клетках коры головного мозга также происходило снижение рН после окклюзии сосуда, однако в течение ишемии рН в клетках возвращался к исходному значению. Реперфузия вызывала еще одну волну резкого падения рН, изменения были зафиксированы не только в области коры, попадающей в зону инсульта, но и в тканях коры здорового полушария. Из-за сильного изменения рН при ишемии-реперфузии не удалось выявить генерацию активных форм кислорода и достоверно определить изменения в редокс-статусе пула НАД, поскольку используемые биосенсоры HyPer-3 и SoNar чувствительны к колебаниям рН. Однако за последние 3 года появились биосенсоры нового поколения, которые характеризуются высокой яркостью, чувствительностью и стабильностью сигнала в условиях сильных изменений рН. В частности, мы протестировали новую версию биосенсора для регистрации пероксида водорода в живых клетках в условиях изменения рН. Данная версия биосенсора, флуоресцентный сигнал которой не изменяется при колебаниях рН, позволяет регистрировать в клетках пероксид водорода в условиях ацидоза, вызванного увеличением концентрации лактата. Подобного рода биосенсоры в сочетании с разработанным нами подходом исследования биологических процессов в мозге открывают новые возможности в медико-биологических исследованиях.

 

Публикации

1. Кельмансон И.В., Почечуев М.С., Котова Д.А., Костюк А.И., Панова А.С., Бородинова А.А., Федотов И. В., Ланин А.А., Мартынов Г.Н., Балабан П.М., Федотов А.Б., Желтиков А.М., Белоусов В.В., Билан Д. С. In vivo регистрация динамики изменения рН в тканях головного мозга крыс при ишемическом инсульте ВСЕРОССИЙСКАЯ МУЛЬТИКОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ "БИОТЕХНОЛОГИЯ - МЕДИЦИНЕ БУДУЩЕГО" Новосибирск, 29 июня-02 июля 2019 г., - (год публикации - 2019).

2. Костюк А.И., Демидович А.Д., Котова Д.А., Белоусов В.В., Билан Д.С. Circularly Permuted Fluorescent Protein-Based Indicators: History, Principles, and Classification International Journal of Molecular Sciences, 20(17), 4200 (год публикации - 2019).

3. Ланин А.А., Почечуев М.С., Чеботарев А.С., Кельмансон И.В., Билан Д.С., Котова Д.А., Тарабыкин В.С., Иванов А.А., Федотов А.Б., Белоусов В.В., Желтиков А.М. Cell-specific three-photon-fluorescence brain imaging: neurons, astrocytes, and gliovascular interfaces Optics Letters, - (год публикации - 2019).

4. Почечуев М.С., Ланин А.А., Кельмансон И.В., Билан Д.С., Котова Д.А., Чеботарев А.С., Тарабыкин В., Федотов А.Б., Белоусов В.В., Желтиков А.М. Stain-free subcellular-resolution astrocyte imaging using third-harmonic generation. Optics Letters, 44(12), 3166-3169 (год публикации - 2019).

5. Субач О.М., Куницына Т.А., Минеева О.А., Лазуткин А.А., Безряднов Д.В., Барыкина Н.В., Петкевич К.Д., Ермакова Ю.Г., Билан Д.С., Белоусов В.В., Анохин К.В., Ениколопов Г.Н., Субач Ф.В. Slowly Reducible Genetically Encoded Green Fluorescent Indicator for In Vivo and Ex Vivo Visualization of Hydrogen Peroxide International Journal of Molecular Sciences, 20(13), 3138 (год публикации - 2019).

6. Чугунова А., Лосева Е., Мазин П., Митина А., Новолаев Т., Билан Д., Вишнякова П., Марей М., Головина А., Серебрякова М., Плетнев Ф., Рубцова М., Майер В., Ванюшкина А., Хайтович Ф., Белоусов В., Высоких М., Сергеев П., Донцова О. LINC00116 codes for a mitochondrial peptide linking respiration and lipid metabolism Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(11): 4940–4945 (год публикации - 2019).


Возможность практического использования результатов
нет