Аннотация результатов, полученных в 2017 году
На моделях беспозвоночных и позвоночных животных показано участие серотонинергической системы в формирующихся адаптационных программах потомков. Продемонстрировано повышение локального уровня серотонина в нейронах, обеспечивающих активность буккального генератора, необходимого для выхода зародышей большого прудовика (Lymnaea stagnalis) из яйца. При этом комбинация активности специфических рецепторов 5-HT1, 5-HT6 и 5-HT7 определяет частоту работы центрального генератора буккального ритма. В долговременных экспериментах выявлены четкие сезонные вариации темпов развития зародышей пресноводной катушки (Helisoma trivolvis), опосредованные активацией серотонинергических нейронов зародышей. Установлен вклад каждого из специфических рецепторов 5-HT1, 5-HT4 и 5-HT7 в модуляцию темпов эмбрионального развития на двух критических стадиях: преметаморфной и метаморфной. Таким образом, конкретное проявление программ развития и поведения определяется уровнем экспрессии специфических рецепторов серотонина. Это обеспечивает молекулярную базу лабильности этих адаптационных физиологических и экологических программ, способных модулироваться внешними сигналами и эпигенетическими факторами, в том числе поступающими из материнского организма. Выявлена нейрональная сеть серотонин-содержащих элементов в женской части половой системы гермафродитного моллюска, при прохождении через которую осуществляется модуляция уровня серотонина в созревающей яйцеклетке со стороны материнского организма. У плодов крыс Вистар и мышей линии BalbC обнаружен нетрадиционный паттерн распределения двух изоформ триптофангидроксилазы, ключевого фермента синтеза серотонина: мозговой (ТРН2) и периферической (ТРН1). В ряде периферических органов выявлен относительно высокий уровень экспрессии мозговой изоформы ТРН2, в то время как в определенных отделах мозга представлены в сравнимых количествах обе изоформы фермента. При детальном исследовании эмбрионального тимуса обнаружилось, что баланс уровней ТРН1 и ТРН2 имеет выраженную динамику, зависимую от стадии формирования органа. Это указывает на наличие локальных источников серотонина в тканях плодов, а также на возможность альтернативных механизмов регуляции уровня серотонина через различные изоформы фермента синтеза в зависимости от стадии онтогенеза. Отработана методика наименее травмирующего и стандартизируемого метода повышения уровня серотонина в половых путях самок мышей. Потомки экспериментальных животных линии BalbC, уровень серотонина у которых был повышен на предимплантационных стадиях, включая стадию раннего дробления, проявляли статистически достоверное ослабление тревожных и депрессивно-подобных реакций. Это подтверждает наличие механизмов долговременной модуляции поведения потомков, опосредованных уровнем серотонина в организме матери. Комплексный биоинформационный анализ позволил выявить консервативные пулы белков, являющихся вероятными мишенями для трансглутаминаз-опосредованного моноаминилирования. Установлено, что экспрессия мРНК белков, обладающих повышенным содержанием глутаминов (преимущественной аминокислоты для серотонилирования и дофаминилирования) и высоким уровнем контекстов для трансглутаминаз, существенно выше на стадиях раннего развития (дробление-бластула), чем во всем последующем онтогенезе. Хотя процент таких транскриптов невелик и составляет 0,01-0.02% от всех экспрессирующихся в раннем развитии, они являются высоко консервативными в ряду беспозвоночных и позвоночных животных (морской еж, шпорциевая лягушка, рыба данио, человек). Выявленные пулы белков участвуют в таких процессах как: фосфорилирование и ацетилирование, белок-белковые взаимодействия, альтернативный сплайсинг, белковый транспорт, связывание РНК, организация и деградация микротрубочек. При этом кандидатные для трансамидирования белки ассоциированы с такими клеточными компонентами как: ядро и ядрышко, реснички, центросомы. Это указывает на возможность регуляции каждого из перечисленных процессов со стороны трансглутаминаз при модуляции уровня моноаминов именно на ранних стадиях развития. Совмещение биоинформационного анализа и наших экспериментальных данных позволило выделить белок, продукт экспрессии гена c1orf95/stum/spec3, как вероятный кандидат для трансглутаминаз-опосредованных посттрансляционных модификаций, функционально значимых для цилиогенеза и морфогенеза отростков клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведен анализ формирования моноаминзависимых программ в развитии беспозвоночных животных. Показано, что для активации буккального ритма – ведущей программы, задействованной при выходе зародышей моллюска большого прудовика из яйца – необходима активация рецепторов серотонина 5-HT6 и 5-HT7 типов, расположенных на нейронах церебрального ганглия. В то время как активация серотониновых рецепторов 5-HT1 вызывает замедление буккального ритма. Ранние серотонин- и дофаминергические нейроны большого прудовика и катушки, активность которых определяет частоту биения локомоторных ресничек зародышей и их вращение в яйце, необходимое для нормального развития, могут менять свою медиаторную специфичность в присутствии предшественника другого моноамина. При этом уровень серотонина является определяющим для ускорения биения ресничек. У пресноводного двустворчатого моллюска дрейсены самые ранние нейроны личинок содержат серотонин и пептид FMRFамид. Все нейроны личинки реагируют на изменение солености внешней среды, а серотонинергические нейроны активируют биение локомоторных ресничек, адаптивно меняя пространственное распределение личинок в толще воды. Таким образом, конкретное проявление определенного поведения зависит от уровня серотонина в нейронах личинки и экспрессии специфических рецепторов серотонина. Это обеспечивает молекулярную базу лабильности описанных адаптационных физиологических и экологических программ, способных модулироваться внешними сигналами и эпигенетическими факторами, в том числе поступающими из материнского организма. Выявлены изменения в поведении, происходящие у потомков мышей при повышении уровня серотонина в материнском организме. Как самки, так и самцы - потомки мышей, у которых уровень серотонина в половых путях был повышен на предъимплантационных стадиях развития эмбриона - демонстрировали статистически значимое снижение тревожных ответов, начиная с 1 месяца после рождения и до 3х месячного возраста (молодые половозрелые животные). Кроме того, у экспериментальных молодых животных были ослаблены депрессивные реакции и усилено защитное стереотипное поведение. Полученные данные указывают на то, что нейроны гиппокампа и префронтальной коры являются наиболее вероятными мишенями для морфологических и/или биохимических изменений, вызванных повышением уровня серотонина в организме матери на ранних сроках беременности. Проанализированы источники синтеза эндогенного серотонина и возможность захвата серотонина разными органами у плодов крыс. Исследована динамика экспрессия двух изоформ фермента синтеза серотонина, триптофангидроксилазы, и транспортера серотонина. Тимус, тонкий кишечник, почка и кожа выбраны как наиболее перспективные органы для исследования паттернов серотонилированных белков в развитии. Подробный анализ серотонилированных белков в тимусе плодов крыс на Э16- Э21 выявил ежедневную смену профиля серотонилированных белков. Белок SPEC, продукт экспрессии гена c1orf95/stum/spec3, является одним из мишеней серотонилирования в дифференцирующихся тимоцитах. Выявлена цитоморфологическая мишень для долговременных эпигенетических изменений, наблюдаемых при повышении уровня серотонина в организме матери на ранних сроках развития плода у ряда животных различной филогенетической принадлежности. Показано, что при увеличении уровня серотонина в организме матери или в окружающей эмбрион среде, концентрация серотонина значительно повышается именно в ядрах дробящихся бластомеров. Наряду с этим, в бластомерах происходит образование и накопление белков, имеющих специфическую трансглутаминаз-зависимую необратимую пострансляционную модификацию – серотонилирование. Данный феномен установлен для пресноводных и морских моллюсков, морских ежей, а также рыб, и характерен для клеток дифференцирующихся эктодермальных зачатков. Cравнение транскриптомов предъимплантационных бластоцист мышей линии Balb/c (контрольных и от матерей с повышенным уровнем серотонина) выявило статистически достоверное изменение в экспрессии 262 генов, потенциально участвующих в сигнальных путях синтеза и захвата ГАМК, высвобождения моноаминов, формирования клеточных контактов и трафика регуляторных молекул, фрагментации и метилирования ДНК, редактирования малых РНК.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Анализ экспрессии 50 000 генов у бластоцист мышей, полученных от контрольных особей и особей с повышенным уровнем серотонина в предъимплантационный период, показал достоверное изменение уровня экспрессии 245 генов. Соотнесение литературных данных, прямо указывающих на взаимодействие серотонилированных участков гистонов с метилированными участками гистонов (Farrely at al., 2019, Nature), с данными транскриптомного анализа позволило нам предположить, что именно гены, участвующие в гидроксиметилировании\реметилировании генома являются наиболее перспективными для дальнейшего анализа долговременных последствий модуляции уровня серотонина. В частности, под влиянием серотонина, снижается экспрессия гена белка TET3, играющего ключевую роль в репрограммировании родительского генома именно на ранних стадиях развития (до бластоцисты). Для подтверждения нашего предположения собран материал бластоцист мышей на предъимплантационных стадиях развития контрольной и экспериментальной групп, в количестве, достаточном для проведения анализа паттерна гидроксиметилирования ДНК (500 нанограмм ДНК на пробу). Кроме описанного гена TET3, менялась экспрессия линкерных гистонов H1, гена раннего развития pax6, генов, кодирующих белок клеточной полярности, белки клеточной адгезии и интегрины. Затрагивались также несколько генов, кодирующих семейство малых ГТФаз, в частности rac2 и rab3c. Менялась также экспрессия генов, ответственных за моноаминергические механизмы: ген рецептора серотонина htr7 и транспортера норадреналина slc6a2. Таким образом, подтверждено, что повышение уровня серотонина на ранних стадиях дробления приводит к изменению уровня экспрессии ряда генов, являющихся ключевыми для процессов развития и дифференцировки. У взрослых особей пресноводных моллюсков в женской половой системе находятся две не пересекающиеся локальные нервные сети, содержащие серотонин и дофамин. Обе сети связаны с ресничными эпителиальными клетками репродуктивного канала. При сезоных изменениях уровня серотонина или повышении уровня серотонина внутри бластомеров на стадиях дробления приводит к нарушениям процесса гаструляции, с большой вероятностью связанными с изменениями в дифференцировке клеток. Удалось раскрыть внутриклеточный механизм, обеспечивающий передачу серотонин-опосредованного эпигенетического сигнала от матери потомкам у зародышей морских и пресноводных моллюсков, морских ежей, и костистой рыбы данио. Установлено, что 5-НТ концентрируется в ядрах дробящихся бластомеров как у первичноротых, так и вторичноротых животных. При этом образуются и накапливаются белки, имеющие специфическую трансглутаминаз-зависимую пострансляционную модификацию – серотонилирование. Полученные результаты впервые показывают, что серотонилирование ядерных белков, способное приводить к изменению уровня экспрессии генов, происходит в плюрипотентных клетках эмбриона, каждая из которых даёт начало широкому набору тканей организма в будущем. То есть, серотонилирование ядерных белков является значимым для реализации нормального развития. У взрослых моллюсков блокада серотонилирования приводит к нарушению процесса обучения с положительным подкреплением. При этом значимо изменяется уровень белков CREB1 и CREB2 в определенных ганглиях центральной нервной системы. Выявлена разница в реакции на блокаду серотонилирования у молодых и старых особей, что позволяет предположить разницу в уровне серотонина и активности трансглутаминазы у животных разного возраста. У взрослых мышей линии Balb\c, полученных от беременных самок с повышенным уровнем серотонина на предимплантационных стадиях развития, увеличивается доля пролиферирующих нейрональных предшественников в гиппокампе в среднем в 1,2 - 1,3 раза, при этом различия сохраняются до 3х месячного возраста. Выявлено локальное повышение уровня серотонина в базальных областях волосяных фолликулов при у мышей линии Balb\c после орального введения предшественника серотонина. Подобные изменения были значительно слабее выражены у мышей линии we\we, с мутантной формой транглутаминазы 3. Повышенный уровень серотонина в критический период формирования надпочечников тормозит дифференцировку предшественников в хромаффинные клетки и приводит к уменьшению как размеров надпочечников, так и количества зрелых клеток в них у плодов мышей и крыс. Уменьшение надпочечников происходило за счет уменьшения объема медуллы, но не кортекса. Предполагается, что обнаруженный механизм изменения дифференцировки включает в себя активацию серотонинового рецептора 3 типа, находящегося на клетках-предшественниках хромаффинных клеток. Уменьшение размера надпочечников сохранялось до 3 месяцев и сопровождалось снижением содержания адреналина и норадреналина (а также их метаболитов) в надпочечниках и в плазме крови, а также в соответствующем снижении тревожных реакций у потомков.