Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Отработан синтез флуоресцентного зонда, представляющего собой конъюгат катиона трифенилфосфония с флуоресцентной меткой BODIPY581/591 (BODIPY581-TPP), предназначенного для количественной и селективной оценки перекисного окисления кардиолипина во внутренней мембране митохондрий in vivo. Окисление диенового фрагмента этого зонда происходит при взаимодействии с перекисными липидными радикалами и сопряжено с повышением флуоресценции в зеленой области и с уменьшением флуоресценции в красной области. Наличие положительно заряженной группы и амидных групп в линкере обеспечивает сродство зонда к отрицительно заряженным группам на поверхности мембраны, в первую очередь к кардиолипиновыми доменами. 2. Методами молекулярного моделирования и квантово-химических расчетов было определено положение диена в молекуле BODIPY581-TPP относительно окисленного диена в жирнокислотных остатках кардиолипина. Сделан вывод, что способный окисляться остаток в молекуле BODIPY581-ТРР должен располагаться вблизи от перокси-групп жирных кислот кардиолипина. Молекулярно-динамическое моделирование указывает на то, что линкерная часть зонда BODIPY581-ТРР расположена вдоль мембраны, так что ее длина и состав мало влияют на глубину расположения диенового остатка. Предполагается, что внесение модификаций в линкерную часть может повысить сродство зонда к кардиолипину, не изменив его чувствительности к окислению жирнокислотных остатков. Молекулярно-динамическое моделирование указывает на высокую эффективность и селективность нового зонда BODIPY581-ТРР по отношению к окисленной форме кардиолипина. 3. Исследовано влияние низкомолекулярных миметиков BODIPY581-TPP на окисление кардилипиновых липосом, которое запускалось двумя разными методами. В первом случае для инициации цепной перекисной реакции использовали гидрофобный азоинициатор 2,2′-азобис-(4-метокси-2,4-диметилвалеронитрил) (MeO-AMVN). При этом оценивалась способность миметиков тушить пероксильные радикалы. Во втором случае для инициации цепной перекисной реакции использовали цитохром c, который при взаимодействии с липидными перекисями, всегда присутствующими в мембране, способен превращаться в пероксидазу и окислять молекулы кардиолипина. Этом случае исследовалась еще и способность миметиков связыватся с кардиолипином и препятствовать его взаимодействию с цитохромом с. В качестве миметиков использовались креатин, карнозин и L-карнитин, низкомолекулярные соединения, присутствующие в клетках в больших количествах. Креатин и карнозин имеют амидо- и аминогруппы, а L-карнитин имеет положиельно заряженную холиновую группу и обладает способностью связываться с жирными кислотами. Исследование этих соединений представляло интерес не только с методической точки зрения, но и одновременно позволяло прояснить антиокислительные свойства этих соединений, функция которых в клетке остается неясной уже около ста лет. Нельзя было исключить, что многочисленные сообщения о способности этих соединений предотвращать апоптоз могут отражать их способность связываться с кардиолипином и препятствовать его окислению цитохромом с. Ни одно из испытанных соединений не оказалось истинным антиоксидантом по отношению к кардиолипину. Карнозин, однако, обладал слабым прооксидантным действием. Испытанные соединения в высокой концентрации 1 мМ не оказывали влияния на индуцированное цитохромом c окисление кардиолипина, что говорит об их неспособности препятствовать взаимодействию кардиолинина с цитохромом с. 4. Исследовалась способность BODIPY581-TPP отслеживать окисление липидов в клетках в разных моделях окислительного стресса. BODIPY581-TPP оказался способен детектировать митохондриальный стресс в клетках, обработанных перекисью водорода или гидроперекисью кумола, добавление митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1, способного в концентрации 20 нМ эффективно предотвращать окислительный стресс, предотвращало и ответ BODIPY581-TPP во всех вариантах индукции. Для индукции митохондриального окислительного стресса были также использованы ингибиторы дыхательной цепи пьерицидин и антимицин, а также редокс медиаторы менадион и бриллиантовый зеленый, которые восстанавливаются в митохондриях и образуют АФК, реагируя с кислородом. Было показано, что редокс медиаторы вызывали значительную дозо-зависимую генерациию АФК, тогда как ингибиторы дыхания не вызывали существенного окислительного стресса. Соответственно, и флуоресценция BODIPY581-TPP не менялась существенно в ответ на добавление ингибиторов, но заметно менялась в присуствии медиаторов. 5. BODIPY581-TPP был также применен для исследования особенностей развития окислительного стресса при наследственной оптической нейропатии Лебера (LHON). Было показано, что BODIPY581-TPP отслеживал как окисление липидов, так и его предотвращение антиоксидантами. Таким образом, нами было показана возможность применения BODIPY581-TPP для изучения окислительного повреждения митохондриальной мембраны в ответ на окислительный стресс различной природы и на различных объектах. Поскольку ранее было показано, что в ответ на окислительный стресс окисляется почти исключительно кардиолипин, использовавшийся нами флуоресцентый зонд BODIPY581-TPP сообщал именно о его окислении. 6. Разработана модель, в соответствии с которой конечная судьба клетки определяется балансом между запускающимися в ответ на окисление кардиолипина проапоптотическими и антиапоптотическими реакциями. Идентифицирована цепь антиапоптозных реакций. Благодаря наличию двух противоположно направленных регуляторных путей, митохондриально направленные антиоксиданты, уменьшая количество окисляющегося кардиолипина, могут смещать баланс в сторону выживания как клеток, так и организмов в случае многих патологий.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018г оптимизирована схема синтеза нового флуоресцентного митохондриально-направленного зонда MitoCLox, чувствительного к окислению кардиолипина. Предложенная схема будет использована для синтеза новых вариантов зонда. Уже синтезирован новый вариант зонда в который введен положительно заряженный остаток аминокислоты аргинина. Предполагается, что наличие двух положительных зарядов позволит увеличить селективность зонда по отношению к кардиолипину. С помощью молекулярного моделирования и квантово-химических расчетов детально исследовано взаимодействие MitoCLox с окисленным кардиолипином в бислойной мембране. Проведено сравнение с разработанным ранее зондом MitoPerox. Показано, что в обоих зондах глубина погружения диен-содержащего фрагмента, чувствительного к окислению, соответствует положению двойных связей в остатках жирных кислот в молекуле кардиолипинат.е. оптимальна для защиты кардиолипина от окисления. Анализ распределения зондов в плоскости мембраны показал возможность тесного взаимодействия зонда как с восстановленным, так и с окисленным кардиолипином. Исследования связывания MitoCLox с липосомами показали, что зонд одинаково хорошо связывается с липосомами, содержащими кардиолипин в различных пропорциях с иными фосфолипидами. Наличие одного положительного заряда не дает измеряемого преимущества на фоне термодинамически очень выгодного взаимодействия между гидрофобными частями зонда и липидной мембраной. Исследована возможность использования MitoCLox для отслеживания окисления кардиолипина в липосомах. В качестве индуктора окисления был использован цитохром с, который приобретает пероксидазную активность при связывании с кардиолипином. Проведено одновременное измерение кинетики образования диеновых конъюгатов (продуктов окисления кардиолипина) и окисления MitoCLox. Было показано, что как накопление диенов, так и окисление MitoCLox инициированное цитохромом с во времени развиваются линейно. MitoClox не влиял на окисление кардиолипина цитохромом с, что делает возможным его использование в качестве флуоресцентного зонда in vivo. Антиоксидант трет-бутилгидрохинон (TBHQ) блокировал как окисление кардиолипина, так и окисление MitoCLox. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 в восстановленной форме эффективно подавлял окисление кардиолипина и MitoCLox. Окисленная форма SkQ1 не влияла на окисление, что позволило исключить возможные взаимодействия SkQ1 с цитохромом с и с зондом. Показано, что при понижении доли кардиолипина в липосомах до 50% его окисление цитохромом с практически прекращается. Видимо, способность цитохрома с окислять кардиолипин обусловлена его связыванием с кардиолипиновыми доменами. Это может служить одной из причин селективного окисления кардиолипина в ответ на окислительный стресс in vivo. Исследована кинетика накопления MitoCLox в клетках и подтверждена селективность его связывания с митохондриями. С помощью проточной цитофлуориметрии проведены измерения ответа MitoCLox на окислительный стресс, вызванный различными агентами. Показано, что эффективность окисления зонда органической гидроперекисью существенно выше, чем у перекиси водорода. Это согласуется с данным о более высокой эффективности органических гидроперекисей в индукции перекисного окисления липидов в мембране митохондрий. Интересно, что в клетках карциномы RKO, различия в эффекте перекиси водорода и органической гидроперекиси оказались значительно более выраженными чем в фибробластах. Эти результаты согласуются с данными о том, что клетки RKO обладают высокой резистентностью к цитотоксическому действию перекиси водорода. Исследовано действие митохондриально-направленных и традиционных антиоксидантов на окисление липидов в мембране митохондрий. Показано, что митохондриально-направленные антиоксиданты семейства SkQ предотвращают окисление MitoCLox в значительно более низких концентрациях, чем традиционные антиоксиданты. Эти результаты согласуются с данными о высокой эффективности митохондриально-направленных антиоксидантов в защите клеток от гибели при окислительном стрессе. Полученные результаты позволяют предполагать, что окисление кардиолипина играет основную роль в индукции гибели клеток при окислительном стрессе.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках проекта в течение 2017-2019 гг нами были впервые разработаны, синтезированы и изучены новые митохондриально-направленные флуоресцентных зонды для регистрации окисления кардиолипина in vivo, в митохондриях живых клеток. Первым был изучен зонд MitoCLox, было показано, что этот зонд селективно накапливается в митохондриях и служит чрезвычайно удобным индикатором окисления митохондриальных липидов. Мы использовали MitoCLox как платформу для получения новых зондов с еще большей избирательностью по отношению к кардиолипину. Один из возможных подходов, основанный на увеличении положительного заряда зонда, был испытан при создании зонда, несущего остаток аргинина в составе линкера (MitoCLox-Arg). Эксперименты на липосомах позволили измерить количественные различия в сродстве синтезированных нами флуоресцентных зондов к кардиолипину и к нейтральным фосфолипидам. Проведенные измерения показали, что как MitoCLox, так и MitoCLox-Arg значительно лучше связываются с кардиолипиновыми липосомами, чем с липосомами из нейтрального фосфолипида. Разница в сродстве оказалась выше в случае MitoCLox-Arg, который оказался специфичным по кардиолипину и очень плохо связывался с нейтральными липидами, такими как фосфатидилхолин. Эксперименты с изолированными митохондриями показали, что MitoCLox-Arg обладает высокой чувствительностью к окислению липидов, которая мало отличалась от чувствительности MitoCLox. Эксперименты с клетками, однако, показали, что введение дополнительного заряда в молекулу MitoCLox-Arg несколько снизило способность зонда проникать через внешнюю мембрану клетки, так что часть зонда попадала в клетку путем эндоцитоза. Дальнейшее использование MitoCLox-Arg возможно с использованием липофильных анионных соединений, которые могут способствовать его проникновению через мембрану и предотвращать эндоцитоз. Экранирование остатка аргинина ароматическими остатками в составе линкера так же может повысить способность молекулы зонда проникать через мембрану. В настоящее время разрабатывается схема синтеза подобной молекулы. С помощью MitoCLox мы исследовали роль перекисного окисления митохондриальных липидов в падении мембранного потенциала при окислительном стрессе. Было показано, что окисление MitoCLox начинается сразу после индукции окислительного стресса перекисью водорода, а снижение мембранного потенциала происходит лишь через 40 минут после добавки перекиси водорода. Можно предполагать, что мембранный потенциал может поддерживаться столь продолжительное время за счет гидролиза запасов внутриклеточного АТФ, образуемого за счет гликолиза, с помощью АТФ-синтазы, что может компенсировать утечку протонов через частично окисленную мембрану. Интересно, что массовая фрагментация митохондрий наблюдалась лишь при падении мембранного потенциала, т.е. начиналась одновременно с достижением высокой степени окисленности митохондриальной мембраны. С помощью MitoCLox была исследована гетерогенность популяции митохондрий в составе одной клетки. В эндотелиальных клетках была выявлена фракция митохондрий с повышенным уровнем окисленности фосфолипидов. Эти митохондрии были небольшими, округлыми и располагались вблизи ядра. Эти же митохондрии имели пониженный уровень мембранного потенциала. Можно полагать, что перекисное окисление липидов митохондрий (прежде всего кардиолипина) может быть причиной снижения мембранного потенциала в части митохондриальной популяции. Возможно, эти митохондрии служат своеобразными датчиками клеточного окислительного стресса, и при превышении допустимого предела быстро запускать механизм клеточной гибели. Мы показали, что эти митохондрии могут служить мишенью для избирательной аутофагии (митофагии). Элиминация этих митохондрий может служить одной из причин защитного действия аутофагии при различных стрессах.