Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Антиретровирусная терапия (АРТ) достаточно эффективно позволяет продлевать жизнь и улучшать качество жизни ВИЧ-инфицированных людей. Однако она не позволяет полностью удалить вирус из организма человека, поскольку не действует на клетки, содержащие интегрированный провирус в транскрипционно-неактивном состоянии. Исследование молекулярных механизмов поддержания вируса в неактивном латентном состоянии и механизмов выхода из него важно с точки зрения создания новых подходов к терапии ВИЧ, которые позволили бы полностью удалить вирус из организма. Латентная стадия вирусной инфекции характеризуется отсутствием полноценной транскрипции с вирусного промотора. Однако в определенных условиях транскрипция может активироваться, что при отсутствии терапии вызывает развитие СПИДа. Изучение клеточных белков, участвующих в активации транскрипции с промотора ВИЧ-1 при переходе вируса из латентной фазы в активную, крайне актуально, поскольку в перспективе поможет понять механизм этого процесса и найти подходы к его регуляции. В настоящем проекте впервые проводится систематическое исследование влияния клеточного белка Ku на уровень транскрипции с промотора ВИЧ-1. Белок Ku является гетеродимером, состоит из субъединиц Ku70 и Ku80 и участвует в большом числе клеточных процессов. Достаточно детально изучено его участие в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК путем негомологичного соединения концов (NHEJ), где Ku выступает в качестве ДНК-связывающего компонента ДНК-зависимой протеин-киназы (DNA-PK). Показано также его участие в транскрипции ряда клеточных генов. В ряде работ обнаружено его влияние на транскрипцию ВИЧ-1, однако механизм этого влияния мало исследован. В большинстве работ вывод о влиянии всего гетеродимера Ku на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 делается на основании данных по снижению внутриклеточного уровня только одной из его субъединиц. Вместе с тем, появляется все больше данных о том, что отдельные субъединицы белка Ku имеют свои собственные функции в клетке, и нокаут одной из них не подавляет полностью функционирование другой. Соответственно, возможно, что каждая из субъединиц белка Ku может оказывать свое действие на транскрипцию. Именно по этой причине в настоящей работе проводится исследование влияния каждой из субъединиц Ku на уровень транскрипции с промотора ВИЧ-1. Для повышения внутриклеточной концентрации субъединиц Ku70 и Ku80 используются соответствующие вектора для эукариотической экспрессии этих белков, которые были сконструированы нами ранее в ходе выполнения проекта РНФ № 14-14-00489, а для понижения их концентрации используется система РНК-интерференции с помощью малых интерферирующих РНК, а также нокаут генов белков Ku70 и Ku80 с использованием технологии CRISPR/Cas9. Работа проводится с использованием клеток линии НЕК 293Т, а также линии лимфоидного происхождения Jurkat, которая является более адекватной моделью для изучения репликации ВИЧ. За отчетный период получены генетические конструкции, позволяющие изучать влияние различных факторов на транскрипцию с промотора ВИЧ-1, находящегося в так называемом длинном концевом повторе (long terminal repeat - LTR). Для этого была использована система на основе вектора pGL3, который кодирует ген люциферазы светлячка и сконструирован таким образом, что позволяет встроить в него любую промоторную последовательность для контроля экспрессии люциферазы. Соответственно, был получен вектор, в котором ген люциферазы контролируется промотором ВИЧ-1 (pGL3_LTR_HIV). Для нормировки данных, полученных для промотора LTR ВИЧ-1, получена конструкция pGL3_hPGK, с встроенным промотором фосфоглицерат-киназы 1 человека, поскольку для этого промотора ранее была показано, что Ku не влияет на его активность, и конструкция pGL3_CMV, с промотором цитомегаловируса, так как для этого промотора описано подавляющее влияние DNA-PK на его активность. Также был получен вектор pRL_hPGK, кодирующем люциферазу Renilla под промотором hPGK. Учитывая, что люциферазу Renilla можно детектировать в одном растворе с люциферазой светлячка, этот вектор является контролем эффективности трансфекции клеток и подготовки препаратов для анализа. Использование системы с двумя векторами, кодирующими две разные люциферазы, значительно упрощает работу и повышает достоверность полученных данных. Все полученные конструкции эффективно поддерживали экспрессию люциферазы при тестировании их активности на культуре клеток HEK 293T и Jurkat. При исследовании влияния внутриклеточного уровня белков Ku70 и Ku80 на транскрипцию с разных промоторов в клетках линии НЕК 293Т обнаружено, что снижение концентрации обеих субъединиц Ku приводит к значительному и независимому от промотора уменьшению уровня экспрессии люциферазы. Очевидно, это связано со стрессом, который испытывают клетки из-за большого недостатка Ku70/Ku80, который препятствует своевременной репарации генома и, вероятно, стимулирует ограничение всей клеточной транскрипции. По этой причине влияние одновременного нокдауна обеих субъединиц Ku путем РНК-интерференции в дальнейшем не рассматривалось. Учитывая, что Ku участвует в репарации разрывов в ДНК в составе ДНК-зависимой протеин-киназы, мы проверили, как влияет подавление ферментативной активности ее каталитической субъединицы DNA-PKcs коммерчески-доступным ингибитором. Оказалось, что оно приводит к незначительному повышению уровня экспрессии люциферазы со всех промоторов в равной степени, что говорит о неспецифическом влиянии ингибирования DNA-PKcs на транскрипцию. В связи с этим дальнейших экспериментов с DNA-PKcs также не проводилось. Вместе с тем, нами было обнаружено и специфичное по отношению к промотору ВИЧ-1 влияние Ku на транскрипцию. Так для промотора LTR ВИЧ-1 наблюдается значительно более сильная, чем для других промоторов, активация экспрессии люциферазы при суперэкспрессии отдельной субъединицы Ku80 и всего гетеродимера в клетках НЕК 293Т. Ответ на суперэкспрессию субъединицы Ku70 при этом незначительный. Нокаут отдельных субъединиц Ku в этих клетках снижает уровень транскрипции со всех промоторов, но негативный эффект от отсутствия Ku значительно более выражен для промотора LTR, причем нокаут гена ku80 приводит к более сильному падению уровня транскрипции. Таким образом, для промотора LTR показан специфический эффект от изменения внутриклеточного уровня Ku, более сильно выраженный, чем для других промоторов. Результаты о характере влияния пониженной/повышенной внутриклеточной концентрации белков Ku70 и Ku80 на транскрипционную активность промотора LTR ВИЧ-1 в клеточной линии Jurkat в целом коррелируют с результатами, полученными на клетках НЕК 293Т. Снижение уровня Ku70 с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК) приводит к снижению экспрессии люциферазы с промотора LTR примерно на 30%. Добавление миРНК к Ku80 также снижает эффективность транскрипции c промотора LTR, хотя эффект менее выражен. Суперэкспрессия субъединиц Ku70 и Ku80 как по отдельности, так вместе приводит к тому, что уровень транскрипции с промотора LTR возрастает примерно в два раза по сравнению с исходным (базальным) уровнем. Эффективность транскрипции с промотора LTR ВИЧ-1 может увеличиваться как при активации инициации транскрипции, так и при активации элонгации транскрипции. В этой связи мы исследовали, как изменяется активность транскрипции с промотора LTR под действием индукторов обоих процессов. Белок TNF-α является классическим активатором инициации транскрипции генов ВИЧ-1. Мы показали, что под действием TNF-α транскрипция активируется независимо от уровня Ku в клетках, но негативный эффект нокаута Ku на транскрипцию при этом сохраняется. Следовательно, эффект Ku на транскрипцию с LTR промотора не связан со стадией инициации транскрипции. Активатором элонгации транскрипции ВИЧ-1 является вирусный белок Tat. Связываясь с РНК-шпилькой TAR, формирующейся на 5’-конце вирусной мРНК при транскрипции, Tat привлекает транскрипционный фактор P-TEFb, обеспечивающий фосфорилирование РНК-полимеразы II и активирующий элонгацию. По нашим предварительным данным, при суперэкспрессии белка Tat активация транскрипции в клетках НЕК 293Т дикого типа происходит несколько слабее, чем в клетках, нокаутных по ku70 и ku80, в результате эффективность транскрипции с LTR промотора во всех клетках выравнивается. Суперэкспрессия Tat в клетках Jurkat приводит к 20-кратному повышению уровня экспрессии люциферазы. Однако, суперэкспрессия Tat параллельно с суперэкспрессией Ku80 или гетеродимера Ku приводит к значительно меньшей активации экспрессии люциферазы, чем при нормальном уровне Ku. На основании этих результатов высказана гиротеза, что в отсутствии Tat белок Ku является активатором элонгации транскрипции с промотора LTR, хотя его активирующий эффект значительно слабее, чем эффект Tat. В присутствии Tat наблюдается конкуренция между двумя активаторами.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Антиретровирусная терапия (АРТ) достаточно эффективно позволяет продлевать жизнь и улучшать качество жизни ВИЧ-инфицированных людей. Однако она не позволяет полностью удалить вирус из организма человека, поскольку не действует на клетки, содержащие интегрированный провирус в транскрипционно-неактивном состоянии. Исследование молекулярных механизмов поддержания вируса в неактивном латентном состоянии и механизмов выхода из него важно с точки зрения создания новых подходов к терапии ВИЧ, которые позволили бы полностью удалить вирус из организма. Латентная стадия вирусной инфекции характеризуется отсутствием полноценной транскрипции с вирусного промотора. Однако в определенных условиях транскрипция может активироваться, что при отсутствии терапии вызывает развитие СПИДа. Изучение клеточных белков, участвующих в активации транскрипции с промотора ВИЧ-1 при переходе вируса из латентной фазы в активную, крайне актуально, поскольку в перспективе поможет понять механизм этого процесса и найти подходы к его регуляции. В настоящем проекте впервые проводится систематическое исследование влияния клеточного белка Ku на уровень транскрипции с промотора ВИЧ-1. Белок Ku является гетеродимером, состоит из субъединиц Ku70 и Ku80 и участвует в большом числе клеточных процессов. Достаточно детально изучено его участие в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК путем негомологичного соединения концов (NHEJ), где Ku выступает в качестве ДНК-связывающего компонента ДНК-зависимой протеин-киназы (DNA-PK). Показано также его участие в транскрипции ряда клеточных генов. В ряде работ обнаружено влияние как отдельных субъединиц гетеродимера Ku, так и каталитической субъединицы DNA-PK на репликацию ВИЧ-1 вообще и на транскрипцию, в частности, однако механизм этого влияния мало исследован. В настоящей работе впервые проводится исследование влияния каждой из субъединиц Ku, а также каталитической субъединицы DNA-PK на уровень транскрипции с промотора ВИЧ-1. Для повышения внутриклеточной концентрации этих белков используются соответствующие вектора для эукариотической экспрессии, которые были сконструированы нами ранее при выполнении проекта РНФ № 14-14-00489. Для понижения их концентрации используется нокаут генов с использованием технологии CRISPR/Cas9. Разработаны протоколы получения стабильных нокаутов по генам белков комплекса DNA-PK в клетках линии НЕК 293Т. Для облегчения отбора нокаутных клеток в разрезаемый Cas9 участок ДНК встраивался ген репортерного флуоресцентного белка (GFP) или маркерной конструкции на основе GPI-белка CD52 со встроенным эпитопным тагом HA, который экспрессируется на поверхности клетки. В результате отбора и анализа клонов получены линии c моноаллельным нокаутом генов белков Ku70, Ku80, DNA-PKcs. Клетки с полным нокаутом этих генов не выживают после сортировки, очевидно, в связи с тем, что эти белки необходимы для реализации жизненно важных для клетки процессов. За отчетный период разработан метод, на основе количественной ПЦР, впервые позволяющий определить эффективность репарации повреждений в геноме клетки, возникающих в результате интеграции вирусной ДНК. С помощью этого метода доказано, что эффективная транскрипция с интегрированного провируса действительно происходит только после репарации повреждений в геноме. Также впервые установлено, что уровень постинтеграционной репарации существенно (в 2-4 раза) понижен в клетках со сниженным уровнем любого из компонентов DNA-PK: Ku70, Ku80, DNA-PKcs. Этот факт ранее никогда не учитывался при изучении влияния компонентов DNA-PK на транскрипцию ВИЧ-1. По результатам первого года выполнения проекта выдвинута гипотеза о конкурентном механизме активации транскрипции белками Ku и Tat за счет их взаимодействия с последовательностью TAR РНК. Для проверки этой гипотезы за отчетный период получены генетические конструкции, позволяющие изучать влияние различных факторов на транскрипцию гена люциферазы светлячка с промотора ВИЧ-1 дикого типа (LTR), а также промотора, в котором удалена область, кодирующая последовательность TAR РНК (dTAR), или эта последовательность «испорчена» таким образом, что синтезируемая РНК хуже связывается с Ku (mTAR). Проверка эффективности транскрипции со всех полученных векторов в клетках НЕК 293Т, а также в линиях на основе НЕК с моноаллельным нокаутом каждого из компонентов DNA-PK: Ku70, Ku80 и DNA-PKcs, - показала, что, независимо от структуры LTR промотора, нокаут гена белка Ku70 снижал уровень экспрессии люциферазы светлячка. Таким образом, мы установили, что негативный эффект белка Ku70 на транскрипцию с LTR промотора не является TAR-зависимым. Следовательно, взаимное негативное влияние белков Tat и Ku70 при активации транскрипции с LTR промотора нельзя объяснить их конкуренцией за связывание с TAR РНК.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Антиретровирусная терапия (АРТ) достаточно эффективно позволяет продлевать жизнь и улучшать качество жизни ВИЧ-инфицированных людей. Однако она не позволяет полностью удалить вирус из организма человека, поскольку не действует на клетки, содержащие интегрированный провирус в транскрипционно-неактивном состоянии. Исследование молекулярных механизмов поддержания вируса в неактивном латентном состоянии и механизмов выхода из него важно с точки зрения создания новых подходов к терапии ВИЧ, которые позволили бы полностью удалить вирус из организма. Латентная стадия вирусной инфекции характеризуется отсутствием полноценной транскрипции с вирусного промотора. Однако в определенных условиях транскрипция может активироваться, что при отсутствии терапии вызывает развитие СПИДа. Изучение клеточных белков, участвующих в активации транскрипции с промотора ВИЧ-1 при переходе вируса из латентной фазы в активную, крайне актуально, поскольку в перспективе поможет понять механизм этого процесса и найти подходы к его регуляции. В настоящем проекте впервые проводится систематическое исследование влияния отдельных субъединиц ДНК-зависимой протеин-киназы (DNA-PK) на уровень транскрипции с LTR промотора ВИЧ-1. В состав DNA-PK входят белок Ku, который является гетеродимером, состоит из субъединиц Ku70 и Ku80 и участвует в большом числе клеточных процессов, а также каталитическая субъединица DNA-PKcs. За отчетный период исследовано влияние белков Ku70, Ku80 и DNA-PKcs на экспрессию репортерного белка с вектора pNL4-3.Luc.R-E-, кодирующего полный геном ВИЧ-1, в котором в ген nef встроен ген люциферазы светлячка. Для того чтобы при трансфекции этого вектора в клетки не происходила сборка новых вирионов, в генах env и vpr произведен сдвиг рамки считывания, нарушающий синтез белков оболочки и регуляторного белка Vpr. Используя этот вектор, можно оценить влияние клеточных белков на экспрессию с промотора LTR в присутствии вирусных белков. Оказалось, что как нокаут, так и ингибирование каталитической активности DNA-PKcs стимулируют экспрессию люциферазы с промотора ВИЧ-1. Однако это влияние неспецифическое, поскольку такой же эффект зарегистрирован и для других промоторов. Для белков Ku70 и Ku80 обнаружено специфичное влияние на транскрипцию с промотора ВИЧ-1: снижение уровня любого их этих белков приводило к понижению эффективности экспрессии люциферазы и количества ее мРНК с промотора ВИЧ-1 и не оказывало влияния в случае промотора цитомегаловируса. Анализ влияния Ku на транскрипцию с интегрированного провируса показал, что повышение уровня как Ku70, так и Ku80 стимулирует экспрессию люциферазы, а снижение внутриклеточной концентрации этих белков понижает уровень экспрессии люциферазы. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что обе субъединицы гетеродимера Ku являются позитивными факторами для транскрипции с промотора ВИЧ-1 как в составе плазмидного вектора, так и интегрированного провируса, а DNA-PKcs не оказывает значительного влияния. Мы также провели иммунопреципитацию хроматина в клетках линии HEK 293T, трансфецированных вектором, кодирующим люциферазу светлячка под контролем промотора ВИЧ-1, и показали, что Ku ассоциирован с промотором ВИЧ-1. С целью установления возможного механизма регуляции транскрипции белком Ku мы изучили возможность взаимодействия белка Ku с 7SK РНК, которая является важным регулятором транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II (РНКП II). В клетках эта РНК формирует малый ядерный рибонуклеопротеиновый комплекс 7SK мяРНП. Мы также проанализировали, может ли Ku взаимодействовать с такими компонентами 7SK мяРНП, как белки HEXIM1 и Cdk9, которые являются важными участниками регуляции транскрипции ВИЧ-1. Именно Cdk9, будучи каталитической субъединицей фактора транскрипции P-TEFb, фосфорилирует С-концевой домен РНКП II, что приводит к снятию элонгационного блока и переходу в стадию активной транскрипции. HEXIM1 в составе 7SK мяРНП комплекса ингибирует Cdk9, таким образом, является негативным регулятором транскрипции ВИЧ-1. Установлено, что белок Ku способен связывать РНК 7SK как in vitro, так и в клетках HEK 293T. Также впервые показана возможность непосредственного взаимодействия белка Ku с белком Cdk9. Что касается взаимодействия Ku с белком HEXIM1, то оно опосредовано 7SK РНК. Примечательно, что оба белка предпочтительно связываются с первой шпилькой 7SK РНК. Обнаруженная нами способность белка Ku взаимодействовать с компонентами 7SK мяРНП позволяет рассматривать Ku как новый компонент комплекса 7SK мяРНП, участвующий в регуляции транскрипции клеточных генов и ВИЧ-1. Таким образом, нами впервые показано, что белок Ku стимулирует транскрипцию с промотора ВИЧ-1 и ассоциирован с этим промотором. В этом процессе Ku участвует без каталитической субъединицы ДНК-зависимой протеинкиназы и по TAR-независимому механизму. Ku взаимодействует с 7SK РНК, а также белками 7SK мяРНП, и, возможно, именно это взаимодействие определяет привлечение Ku к промотору ВИЧ-1. Проведен анализ данных РНК-секвенирования полных транскриптомов клеточных линий на основе НЕК 293T с моноаллельным нокаутом и с дополнительным нокдауном каждой из субъединиц DNA-PK: Ku70, Ku80 и DNA-PKcs, - в сравнении с контрольной группой HEK293T + контрольная миРНК. Получен список из 679 генов, которые дифференциально экспрессировались в нокаутах по генам Ku70 и Ku80, но при этом их экспрессия не изменялась в нокауте по DNA-PKcs. Среди генов, уровень экспрессии которых изменился при нокауте обеих субъединиц Ku70 и Ku80 минимум в полтора раза и не изменился при нокауте по DNA-PKcs, отобрано 15 генов, которые гипотетически могли бы влиять на транскрипцию с промотора ВИЧ-1, поскольку имеют аннотацию, связанную с транскрипционной регуляцией. Данные количественной ПЦР для выбранных генов подтвердили данные транскриптомного анализа. Для транскрипционных факторов ATF3 и Sall4 проверено их влияние на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 путем нокдауна их генов и показано, что белки ATF3 и Sall4 действительно влияют на транскрипцию, но их влияние неспецифичное.