КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-14-01086

НазваниеМетаболическая инженерия мозга

РуководительБелоусов Всеволод Вадимович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2017 - 2019 

КонкурсКонкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словаНейробиология, метаболическая инженерия, метаболизм, синапсы, пластичность, обучение, память

Код ГРНТИ34.15.43


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
На протяжении нескольких десятилетий классическая нейробиология была сосредоточена на исследованиях электрофизиологических свойств нейронов и механизмов синаптической передачи сигналов. Несколько менее изученными оставались вопросы о сигнальных каскадах вовлеченных в функционировании нейронов. При этом остался огромный пробел в знаниях о метаболических основах различных состояний нейронов и мозга. Тем не менее, эти метаболические состояния являются эволюционно консервативными и изменения в метаболизме могут быть не только следствием, но и причиной некоторых особенностей нервной системы, таких как пластичность и сон. Методики синтетической биологии могли бы помочь заполнить образовавшийся пробел в знаниях. Данный проект направлен на изучение того как ключевые процессы функционирования мозга зависят от метаболизма в разных клетках мозга, а также от модуляции активности мозга при помощи метаболической инженерии. Для достижения данной цели сформулированы следующие задачи: 1) разработать новые молекулярные инструменты для метаболической инженерии; 2) использовать инструменты метаболической инженерии для изучения того, как локальные изменения в метаболизме влияют на нейрональные функции на клеточном и субклеточном уровнях ; 3) разработать модели животных, модифицированных с помощью метаболической инженерии, для исследования метаболического контроля пластичности и обучения. В результате работы над проектом будут получены: 1) набор молекулярных инструментов для метаболической инженерии, позволяющий модулировать нейрональные метаболические пути на различных уровнях: в клетках определенного типа, в клеточных компартментах, в функциональных суб-компартментах (например в пре-и постсинаптических окончаниях);2) данные о влиянии специфических изменений метаболических параметров, полученных при помощи инструментов метаболической инженерии, на функционирование нейронов; 3) ключевые знания о воздействии метаболизма на пластичность и обучение.

Ожидаемые результаты
1. Набор молекулярных инструментов для метаболической инженерии, позволяющий модулировать нейрональные метаболические пути на различных уровнях: в клетках определенного типа, в клеточных компартментах, в функциональных суб-компартментах (например, в пре- и постсинаптических окончаниях). 2. Данные о влиянии специфических изменений метаболических параметров, полученных при помощи инструментов метаболической инженерии, на функционирование нейронов. 3. Ключевые знания о воздействии метаболизма на поведение животных, необходимые для модуляции поведенческих программ и патологий при помощи изменений метаболизма. Полученные результаты позволят впервые понять на молекулярном уровне метаболические основы функционирования нейронов в моделях разного уровня сложности, от in vitro до in vivo. Методология, созданная в рамках проекта, может быть применена для изучения метаболизма широкого круга физиологических и патологических процессов в живых системах. Инструменты синтетической биологии и подходы метаболической инженерии помогут нам понять метаболические основы нейрональной пластичности и ее нарушений, что, в свою очередь, заложит основы будущих терапевтических подходов широкого круга патологий мозга.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Первый год проекта «Метаболическая инженерия мозга» был посвящен поиску новых независимых инструментов метаболической инженерии, основанных на использовании D-аминокислот, их клонированию, оценке функциональной активности в эукариотических клетках, а также смене субстратной специфичности ранее описанных нами подобных инструментов. Бактериальные и дрожжевые ферменты использующие субстраты, которые не характерны для высших эукариот, такие как D-аминокислоты, обеспечивают уникальные возможности для контроля метаболических процессов в клетках животных. Поэтому именно среди бактериальных ферментов мы искали подходящих кандидатов. В ходе поиска была обнаружена дегидрогеназа DadA из Pseudomonas aeruginosa PAO1, участвующая в окислительном дезаминировании D-аминокислот, в результате которого происходит образования 2-оксо-кислоты и FAD восстанавливается до FADH2. Мы предположили потенциальное использование этого фермента в эукариотических клеточных системах для прецизионного изменения внутриклеточного уровня пирувата, при использовании в качестве субстрата D-аланина. Клонировав ген dadA и получив эукариотическую клеточную линию, стабильно экспрессирующую DadA, с помощью флуоресцентного сенсора на пируват Pyrates мы подтвердили возможность использовать дегидрогеназу DadA в качестве инструмента независимой продукции внутриклеточного пирувата в присутствии D-аланина. Кроме того, мы клонировали meso-DAPDH из Ureibacillus thermosphaericus, катализирующую дезаминирование meso-DAP (компонент бактериальной стенки некоторых бактерий, отсутствующий у высших эукариот) с параллельным восстановлением NADP+ до NADPH. Этот метаболический инструмент будет в дальнейшем использован для манипуляций с отношением NADP+/NADPH в нейронах и астроцитах наряду с ранее клонированной нами DAAD (субстат D-лизин). С помощью литературного поиска был найден охарактеризованный мутант DAAD Asp94Ala, позволяющий использовать в качестве субстрата гидрофобные аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (D-фенилаланин, D-лейцина и т.д). Дегидрогеназа DAAD(D94A) клонирована нами и получена стабильно экспрессирующая ее клеточная линия Hela Kyoto. Для оксидазы D-аминокислот DAO из Rhodotorula gracilis, используемой нами при модуляции уровня пероксида в клетках эукариот, подобран еще один субстрат — D-норвалин, в микромолярных концентрациях способный вызывать продукцию пероксида количественно аналогичную миллимолярному присутствию D-аланина. Полученные клеточные линии, стабильно экспрессирующие DAAD и DadA, позволили охарактеризовать некоторые метаболические изменения в клетках эукариот, происходящий в присутствии D-аминокислотных субстратов, а также охарактеризовать влияние этих изменений на клеточную физиологию. Показано, что в присутствии D-лизина в клетках экспрессирующих DAAD происходит падение отношения NADP+/NADPH, а также тормозится скорость роста некоторых раковых клеточных культур. Кроме того восстановительные реакции в таких клетках происходят со скоростью отличной от контрольных клеток не экспрессирующих DAAD (показано на изменении скорости восстановления окисленного сенсора на пероксид Hyper3). Нами установлено, что клетки экспрессирующие DadA в присутствии D-аланина увеличивают продукцию пирувата. На основании полученных данных мы предполагаем дальнейшее использование наших метаболических нструментов в нейрональных клеточных системах. В ходе выполнения работы, помимо заявленного в планах на первый год проекта, нам удалось обнаружить ранее не описанный в научной литературе факт. Диффузии пероксида водорода из митохондрий в цитоплазму даже при длительном поддержании в матриксе митохондрий концентрации H2O2 порядка десятков нМ практичеки не происходит. При образовании пероксида водорода в цитоплазме или ядре его миграция в митохондрии идет достаточно активно и зависит от концентрации D-аминокислоты в среде. Также было обнаружено, что диффузия H2O2 в цитоплазме ограничена действием антиоксидантных систем. Показано, что тиоредоксиновая система играет ключевую роль в ограничении распространения H2O2 в цитоплазме от места ее образования. Нами также был разработан сенсор рН нового поколения SypHer3s, с помощью которого мы продемонстрировали метаболическую гетерогенность митохондрий нейронов на уровне одной клетки.

 

Публикации

1. Ермакова Ю.Г., Пак В.В., Богданова Ю.А., Котлобай А.А., Ямпольский И.В., Шохина А.Г., Панова А.С., Марыгин Р.А., Староверов Д.Б., Билан Д.С., Сиес Г., Белоусов В.В. SypHer3s: genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and improved dynamic range Chemical Communications, - (год публикации - 2017).

2. Загайнова Е.В., Дружкова И.Н., Мишина Н.М., Игнатова Н.И., Дуденкова В.В., Ширманова М.В. Imaging of Intracellular pH in Tumor Spheroids Using Genetically Encoded Sensor SypHer2 Advances in Experimental Medicine and Biology. Multi-Parametric Live Cell Microscopy of 3D Tissue Models, Springer, Cham (Switzerland), vol. 1035, p 105-119 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение второго года реализации проекта мы дополнительно охарактеризовали инструменты метаболической инженерии в нейронах и не-нейронных клетках и изучили, как окислительно-восстановительные метаболические изменения в нейронах и астроцитах определяют основные характеристики нейронных сетей in vitro. Нейроны в клеточных культурах, которые мы используем, образуют сети, которые демонстрируют спонтанную нейронную активность вследствие синаптического сопряжения между отдельными нейронами. Кроме того, астроцитарные глиальные клетки, присутствующие в культуре, поддерживают нейроны метаболитами и паракринными сигналами. Поэтому смешанные нейро-глиальные культуры демонстрируют основные особенности типичной нейронной сети. Важно проверить инструменты метаболической инженерии в такой сети, прежде чем начинать эксперименты на животных, чтобы понять потенциальную безопасность или, напротив, токсичность, целевые или нецелевые эффекты и т.д. Мы продемонстрировали, что метаболические изменения как в нейронах, так и в астроцитах определяют свойства сети. Мы разработали протоколы доставки генов в клетки с использованием липосомальной трансфекции или вирусной трансдукции культивируемых нейронов и астроцитов. В частности, мы продемонстрировали, что устойчивая окислительная нагрузка как в астроцитах, так и в нейронах приводит к снижению сетевой активности. Некоторые из субстратов метаболических инженерных ферментов, по-видимому, воздействуют на нейроны, вызывая снижение активности. Поэтому мы оптимизировали условия эксперимента, чтобы минимизировать влияние субстрата в отсутствие фермента. Тем не менее, наши эксперименты указывают на необходимость контролей в наших будущих экспериментах in vivo, где будет оцениваться влияние самих субстратов. Наконец, мы впервые продемонстрировали применимость метаболической инженерии in vivo. Мы экспрессировали DAAO в сердечных миоцитах живых крыс, чтобы вызвать сердечную недостаточность. Окислительный стресс считается центральным событием во многих патологиях сердечно-сосудистой системы. Однако ранее было невозможно понять, является ли это причиной или следствием заболевания, и в какой степени окислительный стресс способствует развитию патологии: некоторые симптомы и молекулярные паттерны могут быть результатом как окислительного стресса, также и многих других процессов. Чтобы ответить на этот вопрос, мы применили систему DAAO/HyPer. Мы обнаружили, что доставка слитого белка HyPer-DAAO через адено-ассоциированный вирус серотипа 9 обеспечивает устойчивую экспрессию в сердце крыс. In vitro стимуляция кардиомиоцитов у этих животных D-аланином вызывает реакцию стресса с повышенной экспрессией мишеней транскрипционных факторов Nrf2 и NF-κB. In vivo активация DAO путем добавления D-аланина в питьевую воду животных в течение нескольких недель приводит к тяжелой систолической дисфункции, связанной с дефосфорилированием фосфоламбана и уменьшением экспрессии тяжелой цепи альфа-миозина. Наши результаты показывают, что хемогенетическая in vivo генерация H2O2 в кардиомиоцитах вызывает состояние систолической сердечной недостаточности без фиброзного преобразования. В целом, результаты 2-го года проекта создали прочную основу для 3-го года экспериментов, в которых будут изучаться метаболические эффекты на функции мозга.

 

Публикации

1. Педре, Б., Янг, Д., Шарли, Д., Мауренза, А., Росадо, Л.А., Маркос-Паскаль Л., Вани К., Мартенс Е., Г де ла Рубла А., Белоусов В.В., Матеос Л.М., Мессенс Й. Structural snapshots of OxyR reveal the peroxidatic mechanism of H2O2 sensing Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, pii: 201807954 (год публикации - 2018).

2. Рощин М., Ермакова Ю.Г., Ланин А.А., Чеботарев А.С., Кельмансон И.В., Балабан П.М., Желтиков А.М., Белоусов В.В., Никитин Е.С. Thermogenetic stimulation of single neocortical pyramidal neurons transfected with TRPV1-L channels Neuroscience Letters, Volume:687 Pages:153-157 (год публикации - 2018).

3. Штейнхорн Б., Соррентино А., Бадоле С., Богданова Ю.А., Белоусов В.В., Мишел Т. Chemogenetic generation of hydrogen peroxide in the heart induces severe cardiac dysfunction Nature Communications, 9(1):4044. (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Третий год проекта был посвящен созданию животных моделей, позволяющих изучать влияние метаболизма и редокс статуса нейрональных компартментов на обучение и нейрональную пластичность. Для этого полученные и охарактеризованные на ранних стадиях проекта инструменты метаболической инженерии DAAO (производит пероксид), DAAD и mesoDAPDH (изменяют соотношение NADP+/NADPH) адресовали в новообразованные синапсы в дендритные шипики моторной коры мыши. Мы создали генетические конструкты на основе синтетического нейронального промотора генов раннего ответа P-RAM, активность которого регулируется потенциацией нейронов, сенсорным и поведенческим опытом (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27661450). Фрагменты ДНК, кодирующие инструменты метаболической инженерии, сшили N-концом с белком постсинаптической плотности Homer1c, а С-конец снабдили последовательностью DTE (dendritic targeting element) из мРНК гена Arc, позволяющей запускать трансляцию мРНК в новоактивированных сегментах дендритов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16367764/). Кроме того, для визуализации экспрессии мы добавили к конструктам зеленый флуоресцентный белок Venus. В качестве контрольных мы использовали генетические конструкты с неактивными версиями ферментов метаболической инженерии, которые мы получили с помощью направленного точечного мутагенеза. Конструкты на основе P-RAM промотора не превышали 5 kb, что позволило нам использовать в качестве системы доставки в мозг животного адено-ассоциированные вирусы (AAV). Количественный титр произведенных нами AAV серотипа 9/2 с генетически кодируемыми метаболическими инструментами составлял 1012-1013 вирусных геномов / мл. Тестирование генетических конструктов на первичной культуре кортикальных нейронов показало низкий уровень фоновой экспрессии и активности в отсутствии потенциации, высокую чувствительность экспрессии к активирующим нейроны стимулам, локализованную экспрессия изучаемых белков во вновь-потенциированных дендритных синапсах. Все это позволит изучать нейрональную пластичность с высоким временным и пространственным разрешением. Мы провели эксперименты по доставке вирусных частиц в моторную кору и тестированию влияния наших метаболических инструментов на способность мышей к обучению новым моторным навыкам. Хотя из-за недостаточного инфекционного титра вирусных частиц мы не получили однозначно интерпретируемых результатов, мы полностью отработали все необходимые процедуры – инъекция вирусов в моторную кору, подбор способа введения D-аминокислоты в животных, тестирование способности к моторному обучению с помощью теста «ротарод». На следующем этапе проведения работы мы планируем оптимизировать производство частиц адено-ассоциированного вируса и добиться более высокого инфекционного титра. Это позволит нам повторить in vivo тестирование по уже отработанному протоколу и получить доступные для интерпретации результаты. Нами был создан новый рациометрический генетически кодируемый сенсор на пероксид - HyPer7, который по сравнению с предыдущими версиями Hyper более яркий, pH-стабильный, сверхбыстрый и сверхчувствительный, способный детектировать, по меньшей мере, в 30 раз более низкие концентрации H2O2, и развивать ответ в 80 раз быстрее. С помощью Hyper7 и инструмента метаболической инженерии DAAO in vivo удалось продемонстрировать однонаправленность перемещения пероксида из вне клетки, через цитоплазму в митохондриальный матрикс. Обратный выход пероксида, продуцируемого а матриксе mito-DAAO в ответ на добавку D-Ala, за пределы наружней мембраны митохондрии не происходит, однако внутренняя мембрана в этом направлении остается проницаема для пероксида. Мы показали, что элиминация пероксида в направлении митохондрия-цитоплазма регулируется тиоредоксиновой антиоксидазной системой. С помощью HyPer7 было показано, что Комплекс I высвобождает H2O2 в матриксную сторону внутренней митохондриальной мембраны. С помощью HyPer7 мы показали, что экспрессируемая в нейронах DAAO осуществляет окислительное дезаминирование эндогенного внутриклеточного субстрата в цитоплазме и дендритах, однако в ядре нейронов этого не происходит. В клетках первичной гиппокампальной культуры и нейроэндокринных клетках мы визуализировали распределение внутриклеточного эндогенного пероксида водорода с помощью связанного с актиновым цитоскелетом HyPer7-LifeAct. Также нами были показаны различия в редокс-статусе нейронов и астроцитов Повышенная чувствительность Hyper7 к пероксиду и его pH-стабильность дали нам возможность предположить, что совместное использование новой версии сенсора с метаболическим инструментом DAAO в нейронах позволит повысить “разрешающую способность” экспериментальных клеточных систем и изучать изменения нейронального редокс статуса и метаболизма на новом уровне. В целом, результаты 3-го года проекта полностью удовлетворяют заявленному плану.

 

Публикации

1. Белоусов В.В. How imaging transforms our understanding of oxidative stress Oxidative Stress, 87-96 (год публикации - 2019).

2. Ермакова Ю.Г., Мишина Н.М., Шульц К., Белоусов В.В. Visualization of Intracellular Hydrogen Peroxide with the Genetically Encoded Fluorescent Probe HyPer in NIH-3T3 Cells Methods in Molecular Biology, 1982:259-274 (год публикации - 2019).

3. Мишина Н.М., Богданова Ю.А., Ермакова Ю.Г., Панова А.С., Котова Д.А., Билан Д.С., Штейнхорн Б., Арнер Е., Мишел Т, Белоусов В.В. Which Antioxidant System Shapes Intracellular H2O2 Gradients? Antioxidants & Redox Signaling, 31(9):664-670 (год публикации - 2019).

4. Нанадикар М.С., Вергель Леон А.М., Боровик С., Хиллеманн А., Зисенисс А., Белоусов В.В., Богески И., Рейлинг П., Дудек Д., Качински Д.М. O2 affects mitochondrial functionality ex vivo Redox Biology, 22:101152 (год публикации - 2019).

5. Пак В.В., Эзерина Д., Люблинская О.Г., Педре Б., Тюрин-Кузьмин П.А., Мишина Н.М., Таувин М., Янг Д, Вахни К, Мартинес Гаше С.А., Демидович А.Д., Ермакова Ю.Г., Маслова Ю.Д., Щохина А.Г., Эроглу Е., Билан Д.С., Богески И., Ultrasensitive genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide identifies novel roles for cellular oxidants in cell migration and mitochondrial function Cell Metabolism, - (год публикации - 2020).