Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Первый год проекта «Метаболическая инженерия мозга» был посвящен поиску новых независимых инструментов метаболической инженерии, основанных на использовании D-аминокислот, их клонированию, оценке функциональной активности в эукариотических клетках, а также смене субстратной специфичности ранее описанных нами подобных инструментов. Бактериальные и дрожжевые ферменты использующие субстраты, которые не характерны для высших эукариот, такие как D-аминокислоты, обеспечивают уникальные возможности для контроля метаболических процессов в клетках животных. Поэтому именно среди бактериальных ферментов мы искали подходящих кандидатов. В ходе поиска была обнаружена дегидрогеназа DadA из Pseudomonas aeruginosa PAO1, участвующая в окислительном дезаминировании D-аминокислот, в результате которого происходит образования 2-оксо-кислоты и FAD восстанавливается до FADH2. Мы предположили потенциальное использование этого фермента в эукариотических клеточных системах для прецизионного изменения внутриклеточного уровня пирувата, при использовании в качестве субстрата D-аланина. Клонировав ген dadA и получив эукариотическую клеточную линию, стабильно экспрессирующую DadA, с помощью флуоресцентного сенсора на пируват Pyrates мы подтвердили возможность использовать дегидрогеназу DadA в качестве инструмента независимой продукции внутриклеточного пирувата в присутствии D-аланина. Кроме того, мы клонировали meso-DAPDH из Ureibacillus thermosphaericus, катализирующую дезаминирование meso-DAP (компонент бактериальной стенки некоторых бактерий, отсутствующий у высших эукариот) с параллельным восстановлением NADP+ до NADPH. Этот метаболический инструмент будет в дальнейшем использован для манипуляций с отношением NADP+/NADPH в нейронах и астроцитах наряду с ранее клонированной нами DAAD (субстат D-лизин). С помощью литературного поиска был найден охарактеризованный мутант DAAD Asp94Ala, позволяющий использовать в качестве субстрата гидрофобные аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (D-фенилаланин, D-лейцина и т.д). Дегидрогеназа DAAD(D94A) клонирована нами и получена стабильно экспрессирующая ее клеточная линия Hela Kyoto. Для оксидазы D-аминокислот DAO из Rhodotorula gracilis, используемой нами при модуляции уровня пероксида в клетках эукариот, подобран еще один субстрат — D-норвалин, в микромолярных концентрациях способный вызывать продукцию пероксида количественно аналогичную миллимолярному присутствию D-аланина. Полученные клеточные линии, стабильно экспрессирующие DAAD и DadA, позволили охарактеризовать некоторые метаболические изменения в клетках эукариот, происходящий в присутствии D-аминокислотных субстратов, а также охарактеризовать влияние этих изменений на клеточную физиологию. Показано, что в присутствии D-лизина в клетках экспрессирующих DAAD происходит падение отношения NADP+/NADPH, а также тормозится скорость роста некоторых раковых клеточных культур. Кроме того восстановительные реакции в таких клетках происходят со скоростью отличной от контрольных клеток не экспрессирующих DAAD (показано на изменении скорости восстановления окисленного сенсора на пероксид Hyper3). Нами установлено, что клетки экспрессирующие DadA в присутствии D-аланина увеличивают продукцию пирувата. На основании полученных данных мы предполагаем дальнейшее использование наших метаболических нструментов в нейрональных клеточных системах. В ходе выполнения работы, помимо заявленного в планах на первый год проекта, нам удалось обнаружить ранее не описанный в научной литературе факт. Диффузии пероксида водорода из митохондрий в цитоплазму даже при длительном поддержании в матриксе митохондрий концентрации H2O2 порядка десятков нМ практичеки не происходит. При образовании пероксида водорода в цитоплазме или ядре его миграция в митохондрии идет достаточно активно и зависит от концентрации D-аминокислоты в среде. Также было обнаружено, что диффузия H2O2 в цитоплазме ограничена действием антиоксидантных систем. Показано, что тиоредоксиновая система играет ключевую роль в ограничении распространения H2O2 в цитоплазме от места ее образования. Нами также был разработан сенсор рН нового поколения SypHer3s, с помощью которого мы продемонстрировали метаболическую гетерогенность митохондрий нейронов на уровне одной клетки.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение второго года реализации проекта мы дополнительно охарактеризовали инструменты метаболической инженерии в нейронах и не-нейронных клетках и изучили, как окислительно-восстановительные метаболические изменения в нейронах и астроцитах определяют основные характеристики нейронных сетей in vitro. Нейроны в клеточных культурах, которые мы используем, образуют сети, которые демонстрируют спонтанную нейронную активность вследствие синаптического сопряжения между отдельными нейронами. Кроме того, астроцитарные глиальные клетки, присутствующие в культуре, поддерживают нейроны метаболитами и паракринными сигналами. Поэтому смешанные нейро-глиальные культуры демонстрируют основные особенности типичной нейронной сети. Важно проверить инструменты метаболической инженерии в такой сети, прежде чем начинать эксперименты на животных, чтобы понять потенциальную безопасность или, напротив, токсичность, целевые или нецелевые эффекты и т.д. Мы продемонстрировали, что метаболические изменения как в нейронах, так и в астроцитах определяют свойства сети. Мы разработали протоколы доставки генов в клетки с использованием липосомальной трансфекции или вирусной трансдукции культивируемых нейронов и астроцитов. В частности, мы продемонстрировали, что устойчивая окислительная нагрузка как в астроцитах, так и в нейронах приводит к снижению сетевой активности. Некоторые из субстратов метаболических инженерных ферментов, по-видимому, воздействуют на нейроны, вызывая снижение активности. Поэтому мы оптимизировали условия эксперимента, чтобы минимизировать влияние субстрата в отсутствие фермента. Тем не менее, наши эксперименты указывают на необходимость контролей в наших будущих экспериментах in vivo, где будет оцениваться влияние самих субстратов. Наконец, мы впервые продемонстрировали применимость метаболической инженерии in vivo. Мы экспрессировали DAAO в сердечных миоцитах живых крыс, чтобы вызвать сердечную недостаточность. Окислительный стресс считается центральным событием во многих патологиях сердечно-сосудистой системы. Однако ранее было невозможно понять, является ли это причиной или следствием заболевания, и в какой степени окислительный стресс способствует развитию патологии: некоторые симптомы и молекулярные паттерны могут быть результатом как окислительного стресса, также и многих других процессов. Чтобы ответить на этот вопрос, мы применили систему DAAO/HyPer. Мы обнаружили, что доставка слитого белка HyPer-DAAO через адено-ассоциированный вирус серотипа 9 обеспечивает устойчивую экспрессию в сердце крыс. In vitro стимуляция кардиомиоцитов у этих животных D-аланином вызывает реакцию стресса с повышенной экспрессией мишеней транскрипционных факторов Nrf2 и NF-κB. In vivo активация DAO путем добавления D-аланина в питьевую воду животных в течение нескольких недель приводит к тяжелой систолической дисфункции, связанной с дефосфорилированием фосфоламбана и уменьшением экспрессии тяжелой цепи альфа-миозина. Наши результаты показывают, что хемогенетическая in vivo генерация H2O2 в кардиомиоцитах вызывает состояние систолической сердечной недостаточности без фиброзного преобразования. В целом, результаты 2-го года проекта создали прочную основу для 3-го года экспериментов, в которых будут изучаться метаболические эффекты на функции мозга.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Третий год проекта был посвящен созданию животных моделей, позволяющих изучать влияние метаболизма и редокс статуса нейрональных компартментов на обучение и нейрональную пластичность. Для этого полученные и охарактеризованные на ранних стадиях проекта инструменты метаболической инженерии DAAO (производит пероксид), DAAD и mesoDAPDH (изменяют соотношение NADP+/NADPH) адресовали в новообразованные синапсы в дендритные шипики моторной коры мыши. Мы создали генетические конструкты на основе синтетического нейронального промотора генов раннего ответа P-RAM, активность которого регулируется потенциацией нейронов, сенсорным и поведенческим опытом (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27661450). Фрагменты ДНК, кодирующие инструменты метаболической инженерии, сшили N-концом с белком постсинаптической плотности Homer1c, а С-конец снабдили последовательностью DTE (dendritic targeting element) из мРНК гена Arc, позволяющей запускать трансляцию мРНК в новоактивированных сегментах дендритов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16367764/). Кроме того, для визуализации экспрессии мы добавили к конструктам зеленый флуоресцентный белок Venus. В качестве контрольных мы использовали генетические конструкты с неактивными версиями ферментов метаболической инженерии, которые мы получили с помощью направленного точечного мутагенеза. Конструкты на основе P-RAM промотора не превышали 5 kb, что позволило нам использовать в качестве системы доставки в мозг животного адено-ассоциированные вирусы (AAV). Количественный титр произведенных нами AAV серотипа 9/2 с генетически кодируемыми метаболическими инструментами составлял 1012-1013 вирусных геномов / мл. Тестирование генетических конструктов на первичной культуре кортикальных нейронов показало низкий уровень фоновой экспрессии и активности в отсутствии потенциации, высокую чувствительность экспрессии к активирующим нейроны стимулам, локализованную экспрессия изучаемых белков во вновь-потенциированных дендритных синапсах. Все это позволит изучать нейрональную пластичность с высоким временным и пространственным разрешением. Мы провели эксперименты по доставке вирусных частиц в моторную кору и тестированию влияния наших метаболических инструментов на способность мышей к обучению новым моторным навыкам. Хотя из-за недостаточного инфекционного титра вирусных частиц мы не получили однозначно интерпретируемых результатов, мы полностью отработали все необходимые процедуры – инъекция вирусов в моторную кору, подбор способа введения D-аминокислоты в животных, тестирование способности к моторному обучению с помощью теста «ротарод». На следующем этапе проведения работы мы планируем оптимизировать производство частиц адено-ассоциированного вируса и добиться более высокого инфекционного титра. Это позволит нам повторить in vivo тестирование по уже отработанному протоколу и получить доступные для интерпретации результаты. Нами был создан новый рациометрический генетически кодируемый сенсор на пероксид - HyPer7, который по сравнению с предыдущими версиями Hyper более яркий, pH-стабильный, сверхбыстрый и сверхчувствительный, способный детектировать, по меньшей мере, в 30 раз более низкие концентрации H2O2, и развивать ответ в 80 раз быстрее. С помощью Hyper7 и инструмента метаболической инженерии DAAO in vivo удалось продемонстрировать однонаправленность перемещения пероксида из вне клетки, через цитоплазму в митохондриальный матрикс. Обратный выход пероксида, продуцируемого а матриксе mito-DAAO в ответ на добавку D-Ala, за пределы наружней мембраны митохондрии не происходит, однако внутренняя мембрана в этом направлении остается проницаема для пероксида. Мы показали, что элиминация пероксида в направлении митохондрия-цитоплазма регулируется тиоредоксиновой антиоксидазной системой. С помощью HyPer7 было показано, что Комплекс I высвобождает H2O2 в матриксную сторону внутренней митохондриальной мембраны. С помощью HyPer7 мы показали, что экспрессируемая в нейронах DAAO осуществляет окислительное дезаминирование эндогенного внутриклеточного субстрата в цитоплазме и дендритах, однако в ядре нейронов этого не происходит. В клетках первичной гиппокампальной культуры и нейроэндокринных клетках мы визуализировали распределение внутриклеточного эндогенного пероксида водорода с помощью связанного с актиновым цитоскелетом HyPer7-LifeAct. Также нами были показаны различия в редокс-статусе нейронов и астроцитов Повышенная чувствительность Hyper7 к пероксиду и его pH-стабильность дали нам возможность предположить, что совместное использование новой версии сенсора с метаболическим инструментом DAAO в нейронах позволит повысить “разрешающую способность” экспериментальных клеточных систем и изучать изменения нейронального редокс статуса и метаболизма на новом уровне. В целом, результаты 3-го года проекта полностью удовлетворяют заявленному плану.