Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Кишечная палочка (Escherichia coli) является одним из компонентов нормальной микрофлоры кишечника, но при определенных условиях может вызывать диарею, а некоторые штаммы ответственны за более серьезные заболевания, такие как энтероколиты, геморрагическую лихорадку и гемолитико-уремический синдром. E. coli - один из наиболее гетерогенных видов бактерий в отношении О-антигенов, которые представляют собой полисахаридные цепи липополисахаридов, встроенных во внешнюю мембрану бактериальной клетки. Большинство специфических генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза О-антигенов, собраны в генный кластер на хромосоме, и вариации этих генов определяют наблюдаемое разнообразие структур О-полисахаридов. Схема типирования штаммов кишечной палочки, необходимая для серодиагностики инфекционных заболеваний, основана на иммуноспецифичности О-антигенов и включает более 180 О-серогрупп. В настоящее время серодиагностика вытесняется молекулярной диагностикой, основанной на специфических генах биосинтеза О-антигенов. В рамках проекта проводится структурно-генетическое изучение О-антигенов с целью создания надежной основы и уточнения классификации E. coli. К настоящему времени неизученными остаются менее 10 О-серогрупп этих бактерий. За отчетный период охарактеризованы О-антигены двух ранее неисследованных серогрупп (O50 и O92) и трех штаммов выделенных из окружающей среды (F5, F17 и 8up). О-полисахарид серогруппы O92 идентифицирован как новый фруктан, отличающийся по структуре от известных фруктанов левана и инулина. О-полисахарид серогруппы O50 оказался гетерополисахаридом, родственным О-полисахариду E. coli серогруппы O2, который отличается только присутствием дополнительного бокового моносахарида 3-ацетамидо-3-дезокси-D-фукозы (D-Fuc3NAc). В генных кластерах О-антигенов обеих бактерий, которые идентичны на 99%, присутствуют гены для биосинтеза D-Fuc3NAc, но в серогруппе O50 один из этих генов инактивирован и, как следствие, биосинтез D-Fuc3NAc в этом штамме заблокирован. Структура О-полисахарида и генный кластер биосинтеза О-антигена одного из штаммов из окружающей среды F17 не встречались у других бактерий. На основании этого для штамма F17 предложено создать новую О-серогруппу E. coli и считать его типовым штаммом этой серогруппы. О-полисахариды двух других штаммов из окружающей среды F5 и 8up оказались структурными вариантами О-полисахаридов серогрупп O28 и O109, соответственно. Они отличались положением замещения глицерофосфата (O28/F5) или характером О-ацетилирования (O109/8up). Как ожидалось, генные кластеры О-антигенов этих бактерий характеризовались высокой степенью гомологии. На основании полученных данных предложено разделить каждую из серогрупп E. coli O28 и O109 на подгруппы и включить в эти серогруппы штаммы F5 и 8up в качестве новых подгрупп. В рамках проекта найдено, что установленная нами ранее структура О-полисахарида E. coli O62 не соответствует генному кластеру О-антигена, который по составу и организации генов практически идентичен генному кластеру другой серогруппы - E. coli O68. Оказалось, что у бактерии E. coli O62 этот генный кластер не является функциональным вследствие инактивации одного из генов, участвующих в биосинтезе L-рамнозы - одного из основных компонентов О-полисахарида E. coli O68. В результате E. coli O62 не синтезирует O68-антиген, но экспрессирует О-полисахарид с другим составом (он содержит D-глюкопиранозу и D-галактофуранозу) и другой структурой. Полногеномное секвенирование позволило обнаружить генный кластер биосинтеза этого альтернативного О-антигена в другом месте генома E. coli O62. В нем присутствует ген glf для синтеза D-галактофуранозы, гены гликозилтранфераз для построения основной цепи О-полисахарида из остатков D-галактофуранозы и гены ABC-транспортера для трансмембранного переноса синтезированного О-антигена. Гены для присоединения двух боковых остатков глюкозы найдены вне генного кластера О-антигена в геноме профага, включенного в хромосому E. coli O62. Функциональность альтернативного генного кластера О62-антигена подтверждена мутацией wzm – одного из генов ABC-транспортера, которая привела к потери способности синтезировать О-полисахарид. Комплементация плазмидой с геном wzm E. coli O62 восстановила исходный хемотип. Биоинформатический анализ показал, что альтернативный функциональный генный кластер О62-антигена на 97% идентичен генетической области в хромосоме Enterobacter aerogenes CAV1320. Был сделан вывод, что штамм E. coli O62 произошел от штамма E. coli O68 в результате двух событий: инактивации генного кластера О68-антигена и приобретения нового генного кластера O-антигена от бактерии E. aerogenes. Кроме О-полисахаридов E. coli в рамках проекта проводится структурно-генетическое исследование О-антигенов Escherichia albertii - нового вида энтеробактерий, близкородственного E. coli. Штаммы этого вида являются возбудителями спорадических и эпидемических кишечных инфекций у людей и птиц. На основании О-антигенов выявлено cемь О-серотипов (EAO1-EAO7), из которых четыре (EAO1-EAO3 и EAO6) исследованы в отчетный период. О-антигены двух серотипов E. albertii EAO3 и EAO6 оказались близкородственными О-антигенам E. coli O181 и О3, соответственно. Так, они либо имеют идентичные по структуре О-полисахариды (EAO6/O3), либо отличаются только присутствием в одном из О-полисахаридов О-ацетильной группы (EAO3/O181). Соответственно, генные кластеры О-антигенов этих бактерий попарно практически идентичны (ген ацетилтрансферазы, модифицирующий О-полисахарид E. coli O181, находится вне генного кластера О-антигена). В связи с антигенным родством и близостью многих других характеристик, рекомендуется объединить классификационные схемы E. coli и E. albertii и включить серогруппы E. albertii EAO3 и EAO6 в существующие серогруппы E. coli O181 и O3, соответственно, в качестве новых подгрупп. О-полисахариды E. albertii EAO1 и EAO2 имеют уникальные структуры, и в объединенной классификационной схему E. coli и E. albertii они должны получить статус типовых штаммов новых серогрупп. Отметим особенность состава O-полисахарида E. albertii EAO1, который включает два производных редковстречающихся в природе кислых моносахаридов 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-маннуроновой кислоты и 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкуроновой кислоты. При этом производное D-глюкуроновой кислоты с ацетимидоильной группой CH3C(=NH) при атоме азота в положении 2 обнаружено впервые в природе. Фаготерапия является перспективным методом борьбы с инфекционными заболеваниями, имеющим ряд преимуществ перед антибиотикотерапией. Важное значение имеет первая стадия взаимодействия бактериофагов с бактериями, включающая связывание и расщепление бактериального поверхностного полисахарида рецепторным белком бактериофага, так как она позволяет фаговой частице приблизиться к поверхности бактериальной клетки и осуществить последующую инъекцию фагового генома внутрь клетки. В связи с этим проводится поиск вирулентных бактериофагов, специфичных к патогенным бактериям, таким как E. coli O157, вызывающей геморрагическую лихорадку и гемолитико-уремический синдром. Одним из вирулентных бактериофагов, специфичных к E. coli O157, является фаг CBA120, который имеет четыре рецепторных белка, отличающихся по своей специфичности. В отчетный период нами изучен механизм расщепления О-полисахарида E. coli O157 рекомбинантным рецепторным белком gp163dd бактериофага CBA120, а также О-полисахаридов двух других O-серогрупп E. coli рекомбинантными рецепторными белками gp164 и gp165d этого же бактериофага. Найдено, что все три изученных рецепторных белка являются полисахаридными деполимеразами (гидролазами), расщепляющими различные О-полисахариды по различным гликозидным связям. Каждый из трех белков gp163dd, gp164 и gp165d строго специфичен к определенному O-полисахариду, а именно E. coli O157, O78 и O77, соответственно. В качестве продуктов расщепления О-полисахаридов идентифицированы олигосахариды, соответствующие повторяющемуся звену О-полисахарида (E. coli O157 и O78) и/или его олигомеру (E. coli O157 и O77). Наличие у одного бактериофага нескольких рецепторных белков с различной специфичностью по отношению к полисахаридным субстратам является уникальным и обнаружено в природе впервые. Таким образом, все работы, запланированные на отчетный период, выполнены. По результатам исследования опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и сделано 3 сообщения на российских и международных научных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Кишечная палочка (Escherichia coli) является одним из компонентов нормальной микрофлоры кишечника, но при определенных условиях может вызывать диарею, а некоторые штаммы ответственны за более серьезные заболевания, такие как энтероколиты, геморрагическую лихорадку и гемолитико-уремический синдром. E. coli - один из наиболее гетерогенных видов бактерий в отношении О-антигенов, которые представляют собой полисахаридные цепи липополисахаридов (О-полисахариды), встроенных во внешнюю мембрану бактериальной клетки. О-полисахариды построены из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев). Большинство специфических генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза О-антигенов, собраны в хромосомный генный кластер, и вариации этих генов определяют наблюдаемое широкое разнообразие структур О-полисахаридов. Схема типирования штаммов кишечной палочки, необходимая для серодиагностики инфекционных заболеваний, основана на иммуноспецифичности О-антигенов и включает около 200 О-серогрупп. В настоящее время серодиагностика вытесняется молекулярной диагностикой, основанной на специфических генах биосинтеза О-антигенов. Недавно был открыт другой вид эшерихий – Escherichia albertii, штаммы которого являются возбудителями инфекционных заболеваний у людей и птиц. В рамках проекта проводится структурно-генетическое изучение О-антигенов эшерихий с целью создания надежной основы для классификации этих бактерий. За отчетный период охарактеризованы О-антигены трех ранее неисследованных серогрупп E. coli (O33, O106 и O179) и трех серогрупп E. albertii (O4, O5 и O7). Найдено, что все изученные О-полисахариды являются регулярными полимерами, построенными из О-звеньев. Наряду с так называемыми общими моносахаридами (D-Glc, D-Gal, D-GlcNAc, D-GalNAc), в составе изученных полисахаридов обнаружены D-манноза (E. coli O106), L-рамноза и L-фукоза (E. albertii O4), D-глюкуроновая кислота и 2-ацетамидо-2-дезокси-L-фукоза (обе у E. coli O57), N-ацетилнейраминовая кислота (E. albertii O7), а также неуглеводный компонент глицерин-2-фосфат (E. coli O33). Особенностью О-полисахаридов E. albertii O5 и O7 является присутствие остатка галактозы в фуранозной форме. Cтруктура О-полисахарида E. coli O179 совпадает с ранее установленной структурой капсульного полисахарида K43, продуцируемого бактерией E. coli O8. Можно предполагать, что в ходе эволюции бактерий генный кластер биосинтеза K43 был приобретен E. coli O179 от одного из штаммов E. coli O8 путем горизонтального переноса и был использован новым хозяином для синтеза О-полисахарида.. Сравнением с последовательностями в доступных базах данных аннотированы гены, входящие в секвенированные генные кластеры О-антигенов изученных штаммов эшерихий, и показано соответствие предсказанных функций генов установленным структурам их О-полисахаридов. В этих кластерах идентифицированы гены wzx и wzy, которые указывают на то, что биосинтеза О-антигенов проходит по флипаза Wzx/О-антиген-полимераза Wzy-зависимому пути. Найдены также гены для необходимого числа гликозилтрансфераз, участвующих в сборке О-звеньев на липидном носителе. Они были отнесены к определенным гликозидным связям в О-полисахаридах путем сравнения с генами гликозилтрансфераз с установленными или надежно предсказанными функциями, депонированные в базе данных GenBank, или с последовательностями в базах данных для бактериальных полисахаридов с известными структурами. На основании полученных данных создана Интернет-доступная база данных гликозилтранфераз путей биосинтеза О-антигенов кишечных бактерий (http://csdb.glycoscience.ru/gt.html), которая будет востребована для функционального анализа других бактериальных гликозилтранфераз. Таким образом, к настоящему времени изучены О-антигены всех известных О-серогрупп эшерихий. Полученные данные расширяют наши представления о структурном разнообразии О-антигенов этих бактерий и о взаимосвязях между ними, а также о генетических факторах, участвующих в биосинтезе О-антигенов. Они проливают свет на молекулярные механизмы диверсификации О-антигенных форм в ходе эволюции кишечных бактерий, позволяющей патогенам избегать защитного действия приобретенного иммуннитета инфицированного организма. Эти данные позволили уточнить схему типирования E. coli и предложить объединенную классификационную схему кишечных бактерий, необходимую для повышения эффективности и надежности типирования их штаммов. Полученные данные о новых О-полисахаридах E. albertii указывают на структурно-генетическую близость О-антигенов этого вида и E. coli. В связи с этим О-серогруппы E. albertii включены в предложенную нами ранее объединенную классификационную схему E. coli и Shigella spp., основанную на О-антигенах. В этой схеме типовые штаммы О-серогрупп E. albertii, как и типовые штаммы Shigella spp., в случае полной идентичности О-антигенов объединены с типовыми штаммами E. coli в простые О-группы, а в случае близкородственных О-антигенов - в сложные О-группы, включающие две или более подгрупп. Выяснен механизм одной из начальных стадий инфицирования специфическим бактериофагом phi92 штаммов различных О-серогрупп E. coli, продуцирующих капсульный полисахарид - колановую кислоту. Ферменативное расщепление колановой кислоты бактериофагами обеспечивает возможность для фаговой частице приблизиться к поверхности бактериальной клетки для последующей инъекции генетического материала внутрь клетки. Показано, что рецепторный белок бактериофага phi92, кодируемый геном gp150, строго специфичен к колановой кислоте и являются гидролазой, расщепляющей этот полисахарид по гликозидной связи остатка beta-D-Glc, давая олигосахарид, соответствующий повторяющемуся звену колановой кислоты. Таким образом, этот белок потенциально является перспективным терапевтическим агентом для борьбы с инфекционными заболеваниями, вызываемых эшерихиями, а также для предотвращения образования бактериальных биопленок на биотических и абиотических поверхностях.