Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект посвящен изучению системы модификации аппарата биосинтеза белка. В 2017 году наша группа занималась изучением предположительных РНК метилтрансфераз млекопитающих. Белок KIAA1456 это гомолог дрожжевой тРНК метилтрансферазы Trm9. Ранее в нашей работе создана клеточная линия, в геном которой внедрен ген химерного белка HA-KIAA1456-P2A-GFP. На этапе 2017 года определены белковые партнеры белка KIAA1456. Была получена линия мышей со сдвигом рамки считывания в области каталитического центра метилтрансферазы NSUN7. Также мы создали линию мышей, содержащих аффинный НА-эпитоп на N-конце белка NSUN7. Нам удалось успешно иммунопреципитировать HA-NSUN7 из семенников мыши.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основная задача данного проекта это исследование функции нескольких белков мыши, предположительно, по данным биоинформатического анализа, являющихся РНК метилтрансферазами. Белок KIAA1456 это гомолог дрожжевой тРНК метилтрансферазы Trm9. В геноме млекопитающих закодированы два гомолога Trm9. Кроме KIAA1456, заметным сходством с Trm9 обладает ALKBH8. В научной литературе описана функция ALKBH8, как белка, модифицирующего тРНК. Функция KIAA1456 неизвестна. В 2018 году нами определено, что внутриклеточная локализация KIAA1456 не зависит от фазы клеточного цикла. Были предприняты несколько попыток микроинъекции компонентов системы CRISPR/Cas9, направленных на инактивацию гена KIAA1456 при разрезании в области, соответствующей активному центру фермента, в зиготы мышей. Мы не добились рождения жизнеспособных мышей со сдвигом рамки считывания в области гена, соответствующей активному центру KIAA1456. Однако, с помощью направленного редактирования генома была создана линия мышей со вставкой НА довеска в KIAA1456 мыши. Ранее в ходе выполнения проекта с помощью иммунопреципитации HA-KIAA1456 из линии клеток было показано, что KIAA1456 совыделяется с TRMT112. В 2018 году, с помощью коэкспрессии генов KIAA1456 и TRMT112 в клетках E. coli было независимо доказано взаимодействие этих белков. Предположительная РНК метилтрансфераза млекопитающих WBSCR27 имеет сходство аминокислотной последовательности с другими РНК метилтрансферазами. Ее мишень, партнеры и функциональная роль пока не известны. Известно, однако, что ген WBSCR27 входит в состав области генома, которая делетирована у больных синдромом Вильямса, генетическим заболеванием, приводящим к умеренной умственной отсталости, аномалиям строения лица и ряду других проявлений. В рамках выполнения проекта в 2018 году получена линия мышей со сдвигом рамки считывания в области гена, соответствующей активному центру WBSCR27, а также линия мышей со вставкой НА довеска в WBSCR27. Мы пробовали определить партнеров белка WBSCR27 с помощью коиммунопреципитации в 2017 году и с помощью химических сшивок в 2018 году, но из-за низкого выхода сшивки и отсутствия совыделяющихся белков это оказалось невозможным. В качестве альтернативного метода поиска партнеров мы использовали метод BioID. Получены линии клеток с экспрессией генов белков BirA и WBSCR27-BirA. Определены белки, специфически биотинилирующиеся WBSCR27-BirA, но не BirA. РНК-метилтрансфераза NSUN7 это предположительная РНК C5-метилтрансфераза, которая синтезируется только в семенниках. Спонтанные мутации гена NSUN7, по данным литературы, приводят к снижению фертильности мужских особей млекопитающих. Высокая тканеспецифичность экспрессии гена NSUN7 накладывает серьезные ограничения на возможность использования клеточных линий для изучения подобного объекта. В рамках выполнения проекта в 2018 году созданы и отсеквенированы библиотеки РНК семенников мышей дикого типа и нокаутов по гену NSUN7 после бисульфитной конверсии. Проводится биоинформатический анализ полученных результатов.С помощью препаративной иммунопреципитации НА-NSUN7 из экстракта семенников мыши выявлены белки-партнеры NSUN7.