Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В полном соответствии с заявкой, в работах первого года проекта проводились исследования вариантов GFP-подобных белков с хромофорами, построенными по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича», а также вариантов флавин-содержащего белка iLOV. На основе компьютерных расчетов предсказан вариант красного флуоресцентного белка с хромофором, зажатым между двумя ароматическими кольцами аминокислотных остатков тирозина по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича». Согласно нашему предыдущему (2013 г.) теоретическому предсказанию, такой тирозин-хромофор-тирозин комплекс с π-стэкингом может быть осуществлен в зеленом флуоресцентном белке (GFP). В недавнем (2016 г.) экспериментальном исследовании была сделана попытка реализовать подобный мотив и был получен вариант красного белка под названием mRojoA-VYGV с двумя аминокислотными остатками тирозина, окружающими хромофор. Однако, анализ кристаллографической структуры показал, что в π-стэкинге участвовала только пара тирозин-хромофор, тогда как второй тирозин был ориентирован перпендикулярно по отношению к хромофору. Мы предлагаем более перспективный вариант этого красного флуоресцентного белка с хромофором, построенным по мотивам «трёхэтажного (triple-decker) сэндвича», что достигается введением дополнительных мутаций в mRojoA. Структуры и оптические свойства модельных белковых систем, основанных на структурах mCherry и mRojoA, рассчитаны методами QM(DFT)/MM. Электронные переходы в связанных с белками хромофорах вычислены современными методами квантовой химии. Согласно нашим расчетам, хромофор в новом варианте красного флуоресцентного белка стабилен внутри белковой макромолекулы, и его оптические полосы сдвинуты в красную сторону относительно исходных белков mCherry и mRojoA. Результаты опубликованы в статье: Khrenova M.G., Polyakov I.V., Grigorenko B.L., Krylov A.I., Nemukhin A.V., "Improving the Design of the Triple-Decker Motif in Red Fluorescent Proteins", Journal of Physical Chemistry B, 2017, DOI:10.1021/acs.jpcb.7b07517 (http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcb.7b07517). Предложены новые варианты флуоресцентного маркера в живых клетках iLOV с флавин-содержащим хромофором. Первые попытки (2015, 2016 гг) улучшить спектральные свойства iLOV показали, что единичная замена Q489K может привести к перспективному варианту, но практическая реализация такого варианта (2016 г) не была успешной из-за неблагоприятной конформации, отворачивающей гибкую боковую цепь аминокислотного остатка лизина от хромофора. Новые результаты молекулярного моделирования показывают, что расположение заряженного остатка лизина вблизи изоаллоксазинового кольца хромофора может быть зафиксировано путем введения дополнительных мутаций в iLOV. Методами классической и квантовой молекулярной динамики с последующей оптимизацией структур методом QM/MM в основном и возбужденном состояниях характеризованы несколько перспективных вариантов мутантов iLOV. Энергии перехода между состояниями S0 и S1 вычисляются с использованием современных квантовохимических методов TD-DFT, SOS-CIS(D) и XMCQDPT2. Согласно нашим расчетам, хромофор-содержащие карманы для вариантов iLOV, содержащих лизин либо в положении 392 (вариант V392K/F410V/A426S), либо в положении 489 (вариант Q489K/L470T) должны быть стабильными и иметь полосы поглощения и излучения сдвинутыми на 40-50 нм в сторону более длинных волн относительно iLOV. Результаты опубликованы в статье: Khrenova M.G., Meteleshko Yu.I., Nemukhin A.V., "Mutants of the Flavoprotein iLOV as Prospective Red-Shifted Fluorescent Markers", Journal of Physical Chemistry B, 2017, 121, 10018-10025; DOI:10.1021/acs.jpcb.7b07533 (http://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcb.7b07533).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В работах второго года проекта проводились исследования модельных систем, описывающих варианты модифицированных бактериальных фитохромов с ковалентно пришитым хромофором – биливердином, исследования вариантов флавин-содержащего белка iLOV с замещенными флавинами, исследование механизма обратимо фотопереключаемого GFP-подобного белка Dreiklang. Рассчитаны структуры и спектры возбуждения системы, моделирующей домен бактериофитохрома с ковалентно пришитым линейным тетрапирролом – биливердином. Данный вариант, называемый IFP1.4, рассматривается как перспективный инфракрасный флуоресцентный маркер. В расчетах методами квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) были определены равновесные геометрические параметры и решена важная задача о состоянии протонирования пиррольных колец. Построены две конформации хромофора, соответствующие формам Pr и Pfr фитохрома. Показано, что с найденными по результатам расчетов КМ/ММ геометрическими параметрами можно практически количественно воспроизвести положения максимумов полос в спектрах возбуждения. [Polyakov I.V., Grigorenko B.L., Mironov V.A., Nemukhin A.V. “Modeling structure and excitation of biliverdin-binding domains in infrared fluorescent proteins”, Chemical Physics Letters, 2018, 710, 59-63; DOI: 10.1016/j.cplett.2018.08.068. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261418307012]. Рассмотрен механизм формирования фитохрома miRFP670 – маркера в ближней инфракрасной области. Согласно экспериментальным данным в доменах PAS и GAF бактериофитохрома могут образовываться ковалентные аддукты при связывании биливердина как через остаток цистеина только из одного домена, так и через два остатка цистеина из разных доменов. Столь необычный механизм формирования фитохрома был проверен методами молекулярного моделирования. По результатам моделирования методами КМ/ММ и молекулярной динамики с потенциалами КМ/ММ сформулированы механизмы реакции взаимодействия биливердина с остатками цистеина из доменов PAS и GAF. Рассчитанные энергетические профили и результаты анализа кинетических уравнений с оцененными по теории переходного состояния константами скорости элементарных стадий показывают, что возможны оба канала реакции. [Khrenova M.G., Kulakova A.M., Nemukhin A.V. “Competition between two cysteines in covalent binding of biliverdin to phytochrome domains”, Organic and Biomolecular Chemistry, 2018, 16, 7518-7529; DOI: 10.1039/c8ob02262c. https://pubs.rsc.org/ru/content/articlehtml/2018/ob/c8ob02262c?page=search]. Одним из перспективных флуоресцентных белков с хромофором на основе флавин-мононуклеотида (FMN) является белок iLOV. Основное ограничение флуоресцентных белков на основе флавина (FbFPs) связано с тем, что все они характеризуются близкими значениями максимумов полос поглощения и испускания. Таким образом, для расширения цветовой гаммы необходимо предложить новые варианты флуоресцентных белков на основе флавина. По результатам молекулярного моделирования предложены варианты iLOV с точечными заменами аминокислотных остатков и аналогами флавина. Показано, что точечными мутациями белка и заменами FMN на 8-амино-FMN или на 8-метиламино-FMN можно добиться сдвига полос испускания до 100 нм в красную сторону. Замена FMN на 1-деазо-FMN с соответствующими точечными мутациями приводит к серии флуоресцентных белков с полосами флуоресценции в «окне прозрачности» для проникновения света сквозь биологические ткани. Новые варианты флуоресцентных белков на основе флавина могут быть использованы для многоцветной визуализации, а также как компоненты FRET-пар. [Meteleshko Yu.I., Nemukhin A.V., Khrenova M.G. “Novel flavin-based fluorescent proteins with red-shifted emission bands: a computational study”, Photochemical and Photobiological Sciences, 2018, DOI: 10.1039/C8PP00361K. https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2018/PP/C8PP00361K#!divAbstract]. Построены молекулярные модели обратимо фотопереключаемого флуоресцентного белка Dreiklang в активном (флуоресцирующем) и неактивном состояниях. Методами квантовой механики/молекулярной механики оптимизированы геометрические параметры систем и показано, что рассчитанные энергии вертикальных электронных переходов хорошо согласуются с экспериментальными положениями максимумов в оптических спектрах поглощения. Рассчитаны энергетические профили для основного S0 и первого возбужденного S1 состояний модельной системы, связывающие геометрические конфигурации активного и неактивного состояний, что позволяет предложить механизм обратимой фотоиндуцированной гидратации хромофора.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
По результатам расчетов методами молекулярной динамики (МД), квантовой химии и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) определены характеристики молекулярных систем, моделирующих недавно разработанные маркеры на основе бактериофитохромов IFP1.4 (infrared fluorescent protein, version 1.4) и smURFP (small ultra-red fluorescent protein). Построены трехмерные полноатомные модели белков, определены структурные параметры хромофор-содержащих областей в основном электронном состоянии, оценены вертикальные энергии возбуждения S0 → S1. Рассчитанные характеристики хорошо согласуются с экспериментальными данными - координатами атомов, определенными при рентгено-структурных исследованиях кристаллов белков, и положениями максимумов полос в спектрах возбуждения. Впервые найдены структуры минимумов на потенциальной поверхности возбужденного состояния и рассчитаны положения полос в спектрах флуоресценции S1 → S0, а также оценены структуры и энергии точек конических пересечений S1/S0. Полученные результаты позволяют объяснить невысокий квантовый выход флуоресценции белка IFP1.4 и сформулировать предложения для более перспективных вариантов. Результаты опубликованы: V.A. Mironov, B.L. Grigorenko, V.I. Polyakov, A.V. Nemukhin “Benchmarking Quantum Chemistry Methods in Calculations of Electronic Excitations”, Supercomputing Frontiers and Innovations, 2018, 5 (4), 62-66; DOI: 10.14529/jsfi180405 (URL https://superfri.org/superfri/article/view/204). Определены индивидуальные параметры доноров и акцепторов пар биомаркеров – потенциальных участников резонансно-индуктивного переноса энергии (FRET-пар), для вариантов флуоресцентного белка iLOV, которые были предложены на предшествующих этапах проекта по результатам молекулярного моделирования. Варианты белка iLOV с расширенным оптическим диапазоном различаются как точеными мутациями аминокислотных остатков, так и составом хромофоров на основе флавинмононуклеотида (FMN). Методами квантовой химии и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) определены максимумы положений полос в оптических спектрах поглощения и флуоресценции и соответствующие дипольные моменты электронных переходов в модельных системах. Результаты опубликованы: Ю.И. Метелешко, А.В. Немухин, М.Г. Хренова «Моделирование фотофизических свойств компонентов FRET-пар на основе флавинсодержащих флуоресцентных белков и их аналогов», Химическая физика (Russian Journal of Physical Chemistry B,) 2019, 38 (6), 3-7; DOI: 10.1134/S0207401X19060074. По результатам молекулярного моделирования установлен механизм термической реактивации флуоресцентного состояния фотопереключаемого GFP-подобного белка Dreiklang. Методами молекулярной динамики и квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) построены модели белка в не флуоресцирующем (с гидратированным хромофором) и флуоресцирующем состояниях и рассчитан энергетический профиль реакции реактивации в основном электронном состоянии. Найдено, что химическая реакция термической реактивации проходит через несколько элементарных стадий, в которых принимают участие группы основной полипептидной цепи белка и ближайшие к хромофору аминокислотные остатки Glu222, Ser205, His145. Результаты опубликованы: B.L. Grigorenko, I.V. Polyakov, A.I. Krylov, A.V. Nemukhin “Computational Modeling Reveals the Mechanism of Fluorescent State Recovery in the Reversibly Photoswitchable Protein Dreiklang”, Journal of Physical Chemistry B (Q1) 2019, 123 (42), 8901-8909; DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b06988 (URL https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcb.9b06988). Опубликована статья (Feature Article), обобщающая результаты компьютерного моделирования флуоресцентных белков, используемых для многоцветной визуализации в живых системах (GFP-подобных белков, флавин-содержащих белков и фитохромов): A.V. Nemukhin, B.L. Grigorenko, M.G. Khrenova, A.I. Krylov, "Computational Challenges in Modeling of Representative Bioimaging Proteins: GFP-Like Proteins, Flavoproteins, and Phytochromes”, Journal of Physical Chemistry B (Q1) 2019, 123(29), 6133-6149; DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b00591 (URL https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcb.9b00591).