Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году было продолжено комплексное исследование фукозилированных хондроитинсульфатов (ФХС) по всем выбранным ранее направлениям: (1) выделение и структурная характеристика природных полисахаридов; (2) изучение биологической активности полученных биополимеров; (3) синтез структурно родственных олигосахаридов; (4) спектроскопический (ЯМР) и теоретический конформационный анализ полученных соединений, докинг; (5) сопоставление биологической активности поли- и олигосахаридов. При выполнении данного проекта были отработаны методы выделения, очистки и структурной характеристики ФХС из различных видов морских огурцов, собранных в акваториях Охотского, Японского, Восточно-Китайского и Филиппинского морей. На настоящий момент были изучены 9 различных полисахаридов и показано, что цепи ФХС могут быть построены из разных типов повторяющихся звеньев. Помимо звеньев типа I, описанного в литературе, нами были обнаружены еще 4 разновидности повторяющихся фрагментов, а именно: (1) фрагмент II, в котором при О-3 глюкуроновой кислоты содержится избирательно сульфатированный дифукозильный заместитель, (2) фрагмент III, в котором монофукозильный заместитель присоединен к О-6 остатка N-ацетил-галактозамина, (3) фрагмент IV, состоящий из 2,3-ди-О-сульфатированного остатка глюкуроновой кислоты и 6-О-сульфатированного остатка N-ацетил-галактозамина, (4) фрагмент V, построенный из 3-О-сульфатированного остатка глюкуроновой кислоты и 4-О- или 4,6-О-ди-сульфатированного остатка N-ацетил-галактозамина. В 2017 году были выделены и охарактеризованы не описанные ранее ФХС HT и HS из двух видов морских огурцов Holothuria tubulosa и Holothuria stellati, собранных в Адриатическом море. С использованием методов 1D и 2D ЯМР-спектроскопии было показано, что основная цепь биополимеров состоит из дисахаридных блоков →3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→, в которых при О-3 GlcA содержатся фукозные заместители. Полисахариды различались положением сульфатных групп в остатках N-ацетил-D-галактозамина и L-фукозы. Таким образом, полисахариды HT и HS построены из звеньев I типа. Полученные данные представлены в статье в журнале Carbohydrate polymers. В отчетном году были продолжены исследования сульфатированных полисахаридов из морского огурца Stichopus horrens. Установлено, что наряду с фукозилированным хондроитинсульфатом в этом животном продуцируется и фукан-сульфат SHFS – высокосульфатированный полимер L-фукозы. Полимеры этой группы, как и ФХС, проявляют выраженные антикоагулянтные и антитромботические свойства. Поэтому, развивая предыдущее исследование сульфатированных полисахаридов, нам удалось выделить и структурно охарактеризовать и фукан-сульфат из морского огурца Stichopus horrens. Оказалось, что это уникально регулярный биополимер, который состоит из повторяющихся 2-О-сульфатированных (13)-связанных остатков α-L-фукопиранозы. Полученные данные представлены в отдельной статье в журнале Carbohydrate research. Сам же фукан-сульфата SHFS представляет собой ценную модель для изучения взаимосвязи структуры и биологической активности в ряду сульфатированных полисахаридов, что являестся одной из задач настоящего проекта. Полученные в 2017 году полисахариды были изучены на антитромботическую и антикоагулянтную активность. Было показано, что ФХС HT и HS, в отличие от фукан-сульфата SHFS и гепариноидов, эффективно блокируют агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристомицином. Это свидетельствует о влиянии ФХС на фактор Виллебранда и фактор VIII. Кроме того, было показано, что ФХС эффективно ингибируют полимеризацию фибрина за счет усиления связывания антитромбина III с тромбином и фактором Xa. Такой тип активности схож с действием гепариноидов. Фукан-сульфат демонстрировал низкую активность в этих экспериментах. Таким образом, было показано, что величина биологического эффекта существенно зависит от структуры биополимеров: типов повторяющихся звеньев, наличия разветвлений, степени сульфатирования, положения сульфатных групп. Новым направлением исследований в 2017 году была оценка способности ФХС влиять на связывание тромбина и гепарин-кофактора II. Оказалось, что некоторые из полученных нами полисахаридов существенно превосходят по активности гепарин и низкомолекулярный гепарин, что свидетельствует о различии механизмов их действия, хотя все эти биополимеры относятся к классу гликозаминогликанов. Детальное изучение обнаруженного эффекта и исследование его зависимости от структуры ФХС будет продолжено в 2018 году с использованием всех полученных в данном проекте образцов ФХС. Еще одним новым направлением исследований в проекте была оценка способности ФХС стимулировать гемопоэз. Эти исследования начались с отработки экспериментальных протоколов при использовании полученного ранее ФХС PS-FCS из морского огурца Massinium magnum. На модели иммуносупрессии у мышей было показано, что после курса ФХС восстанавливается популяция клеток крови, а также заселенность селезенки спленоцитами. Этот эффект был сопоставим с действием препарата Филграстим (rG-CSF рекомбинантным колониестимулирующим фактором), используемым в настоящее время для стимуляции гемопоэза после курса химиотерапии. Результаты работ представлены в статье в специализированном журнале Marine Drugs. Ранее нами были синтезированы олигосахариды, построенные из звеньев типа I (от ди- до додекасахаридов) и типа V (от ди- до гексасахаридов), а также избирательно сульфатированные дисахариды Fuc(16)GalNAc – фрагменты звена типа III. В 2017 году синтетические работы были существенно расширены. Так, были получены разветвленные тетрасахариды А1 и В1, родственные ФХС, построенным из повторяющихся звеньев типов II и III. Также были получены ди-, тетра- и гексасахариды С1-С3, родственные ФХС, включающим 2,3-ди-О-сульфатированные остатки глюкуроновой кислоты. Эти соединения вызывают особый интерес, поскольку наличие сульфатных групп в соседних положениях приводит к существенному изменению конформации пиранозного цикла глюкуроновой кислоты, и, как следствие, к изменению пространственной организации всей полимерной цепи. Соединения С1-С3 являются адекватными моделями, конформационный анализ которых позволит сделать выводы о степени искажения пиранозных циклов. Для более детального исследования влияния ФХС на клетки крови (тромбоциты, иммунокомпетентные клетки) необходимы гликоконъюгаты на основе олигосахаридов, несущие флуоресцентную метку. В связи с этим, было принято решение синтезировать все целевые соединения в виде производных, содержащих аминопропильный агликон-спейсер на «восстанавливающем» конце, для того чтобы в дальнейшем провести конъюгацию олигосахаридных лигандов с флуоресцеинизотиоцианатом с образованием флуоресцентно меченных производных для экспериментов на клетках крови с регистрацией результатов методами проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. На 2018 год запланирован синтез крупных олигосахаридов, родственных ФХС. Для их получения в 2017 году были синтезированы тетра-, гекса- и окстасахаридный предшественники, содержащие свободные ОН-группы для последующего фукозилирования. Ранее нами были проведены спектральный (ЯМР) и конформационный анализы олигосахаридов, построенных из звеньев типов I и V, а также дисахаридов Fuc(16)GalNAc – фрагментов звена типа III. В развитие этих работ в 2017 году были изучены синтетические олигосахариды, построенные из звеньев типов II, III и IV. Были определены величины спектральных эффектов гликозилирования и сульфатирования, необходимые для анализа спектров природных полисахаридов класса ФХС. С использованием методов ЯМР-спектроскопии NOESY и J-HMBC, а также квантово-химических расчётов ab initio, был проведен конформационный анализ синтезированных олигосахаридов. Наиболее интересные результаты были получены в случае соединений, содержащих сполна замещенные остатки D-глюкуроновой кислоты (2,3-ди-О-сульфатированные (14)-связанные фрагменты цепи). Были рассчитаны энергии как обоих конформеров типа «кресло» (4С1 и1С4), так и нескольких твист-форм (OS2, 3S1 и 1S5). В результате было найдено, что конформеры OS2 и 3S1 имеют самые низкие энергии. Квантово-механический расчет констант спин-спинового взаимодействия и химических сдвигов 1Н для всех конформеров и их сопоставление с экспериментальными величинами показал, что именно две указанных формы вносят наибольший вклад в конформационное равновесие. Таким образом, нами впервые было показано, что в исчерпывающе сульфатированном остатке глюкуроновой кислоты не происходит полной инверсии пиранозного цикла, как это предполагалось ранее. Результаты данной работы, опубликованные в статье в специализированном журнале Carbohydrate Research, очень важны для понимания пространственной структуры гексозаиминогликанов, в которых содержатся сполна замещенные остатки D-глюкуроновой кислоты. Полученные данные о пространственной организации ФХС были использованы в расчетах энергий связывания углеводных лигандов с белками-мишенями, определяющими протекание процессов коагуляции крови и тромбообразования. Было показано, что наличие дифукозильного фрагмента при О-3 глюкуроновой кислоты, а также фукозильного заместителя при О-6 N-ацетил-галактозамина значимо увеличивает энергию связывания углевода с активными центрами белков, по сравнению с линейным хондроитинсульфатом, не содержащим фукозных или сульфатных групп в остатках глюкуроновой кислоты. Важно отметить, что для образования тринарного комплекса ФХС-тромбин-антитромбин III углеводная цепи должна состоять, как минимум, из 16 остатков. Полученные же результаты для фактора Ха свидетельствуют, что активность можно ожидать уже для октасахаридных соединений. Дальнейшее развитие исследований в данном приоритетном направлении предусмотрено в 2018 году. Нами проведён систематический скрининг в экспериментах in vitro биологической активности полученных ФХС и синтетических олигосахаридов, отвечающих фрагментам ФХС, для выяснения взаимосвязи структуры анализируемых производных углеводов и их антикоагулянтной и антитромботической активности. Результаты этого исследования и все выявленные закономерности, в сочетании с данными о конформационной подвижности олигосахаридов и фрагментов полисахаридов, а также их пространственной комплементарности с углеводсвязывающими доменами белков-рецепторов, будут завершены в 2018 году и подробно рассмотрены в заключительном отчёте по данному проекту. Они дополнят систематические работы, которые проводятся в ИОХ РАН по междисциплинарному исследованию сложных органических и гибридных молекулярных систем.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году было завершено комплексное исследование природных полисахаридов фукозилированных хондроитинсульфатов (ФХС), выделенных из разных видов морских огурцов, а также синтетических олигосахаридов, структурно родственных фрагментам ФХС. Работы были выполнены по следующим направлениям: 1. ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ. Были выделены и охарактеризованы не описанные ранее фукозилированные хондроитинсульфаты CD и PP из 2 видов морских огурцов - Cucumaria djakonovi и Psolus peroni, собранных в Авачинской бухте (Камчатка). Выделение было выполнено по разработанной в данном проекте методике, очистку полисахаридов проводили методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Был установлен моносахаридный состав и содержание сульфата в образцах. Было показано, что главными компонентами полисахаридов являются остатки D-глюкуроновой кислоты, N-ацетил-D-галактозамина и L-фукозы. Для детального установления структуры полисахаридов использовали методы 1D и 2D ЯМР-спектроскопии. Было показано, что в состав полисахарида CD наряду с описанным нами ранее структурным элементом ФХС I входит дисахаридный блок II, состоящий из незамещенной по О-2 и О-3 глюкуроновой кислоты и остатка галактозамина. Такой фрагмент обнаружен в составе ФХС впервые. Полученные данные опубликованы в журнале Marine Drugs (Q1). Полисахарид РР из P. peroni состоял из блоков I и III, которые были исследованы нами в рамках данного проекта ранее как структурные компоненты ФХС из других видов морских огурцов. Суммируя все проведённые структурные исследования ФХС, на завершающем этапе проекта была проведена систематизация данных о структурах ФХС из разных видов морских огурцов. Всего нами было изучено 13 полисахаридов из разных видов голотурий и опубликовано 9 статей по этой тематике в ведущих международных журналах (главным образом, из списка Q1). Примечательно, что, помимо описанного ранее в литературе фактически только одного структурного типа ФХС I, нами были обнаружены пять новых типов повторяющихся звеньев, которые различались строением боковых заместителей, положением сульфатных групп в остатках глюкуроновой кислоты, N-ацетил-галактозамина и фукозы. Так, нами было показано, что остатки глюкуроновой кислоты могут не содержать заместители при О-2 и О-3 (см. блок II), нести сульфатные группы либо одновременно при О-2 и О-3 (блок III), либо только при О-3 (блок IV), включать дифукозидные звенья при О-3 (блок V). Монофукозильные заместители могут располагаться не только при О-3 GlcA, но и при О-6 остатка N-ацетил-галактозамина (блок VI). Полученные данные о структурном разнообразии ФХС рассмотрены в обзоре в журнале Pure and applied chemistry (Q1). Кроме этого, был подготовлен еще один обзор для публикации в журнале Carbohydrate research, в котором были рассмотрены различные методы исследования ФХС, включая анализ моносахаридного состава, химическую модификацию, частичную деполимеризацию, спектральные методы исследования. 2. СИНТЕЗ КРУПНЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ, СТРУКТУРНО РОДСТВЕННЫХ ФХС, ПОЛУЧЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Основными объектами синтезов в 2018 году были крупные линейные олигосахариды, построенные из звеньев типов II, III и IV, а также разветвленные олигосахариды, состоящие из звеньев типов V и VI. Выбор целевых объектов в этой части проекта проведён с учётом установленных нами новых типов ФХС. Сборка углеводных скелетов целевых соединений была выполнена с использованием синтетических блоков, полученных в 2017 году. В 2018 году нами была разработана новая конвергентная схема синтеза основной цепи целевых олигосахаридов, которая позволила более чем на 50% увеличить выход предшественников целевых олигосахаридов. По оригинальным синтетическим схемам были получены избирательно сульфатированные линейные октасахариды, разветвленные окта-, додека- и гексадекасахариды. После удаления защитных групп целевые соединения выделяли методом гель-проникающей хроматографии и характеризовали с использованием методов ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Важным направлением синтетических работ в 2018 году было получение флуоресцентно меченных производных целевых олигосахаридов. Наличие аминопропильного спейсера в структуре целевых соединений позволило провести реакцию с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и получить образцы, необходимые для исследования взаимодействия ФХС с клетками крови методами проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. 3. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЙ (ЯМР) И КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗЫ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОСАХАРИДОВ, ДОКИНГ В 2018 году был проведен спектроскопический (ЯМР) анализ полученных синтетических олигосахаридов. Были рассчитаны величины эффектов гликозилирования, сульфатирования и отклонения от аддитивности в указанных структурных фрагментах. Эти данные необходимы для расшифровки спектров более сложных природных полисахаридов. Теоретический конформационный анализ полученных соединений проводили методами квантовой механики в приближении Хартри-Фока, с использованием базисного набора 6-311++G**. Влияние растворителя (воды) учитывалось с использованием континуальной модели сольватации COSMO. Наиболее интересные результаты были получены для олигосахаридов, построенных из звеньев III типа. Было показано, что предпочтительной конформацией для кольца глюкуроновой кислоты, несущей сульфатные группы при О-2 и О-3, является 0S2, в то время как для остальных структурных блоков ФХС характерно наличие остатка GlcA в виде 4С1–конформера. С помощью методик J-HMBC были измерены дальние константы спин-спинового взаимодействия С-Н (3JC-H) вокруг гликозидных связей. Данные константы непосредственно связаны с величиной двугранного угла уравнением Карплуса и, таким образом, характеризуют конформацию гликозидной связи. Полученные экспериментальные данные хорошо согласовывались с результатами теоретического конформационного анализа. Были суммированы результаты конформационных исследований за все 5 лет выполнения проекта. Были сделаны выводы о пространственной организации различных фрагментов ФХС. Вместе с описанием синтеза эти результаты представлены в 2 статьях, которые направлены в печать. Эти данные были использованы для изучения топологии связывания целевых соединений с белками-мишенями, играющими ключевые роли в развитии процессов коагуляции крови, тромбообразования и клеточной адгезии. Было показано, что наличие дифукозильного фрагмента при О-3 глюкуроновой кислоты, а также фукозильного заместителя при О-6 N-ацетил-галактозамина значимо увеличивает энергию связывания углевода с активными центрами белков, по сравнению с линейным хондроитинсульфатом, не содержащим фукозных или сульфатных групп в остатках глюкуроновой кислоты. Важно отметить, что для образования тринарного комплекса ФХС-тромбин-антитромбин III углеводная цепь должна состоять, как минимум, из 16 остатков. Полученные же результаты для комплекса ФХС-фактор Ха-антитромбин III свидетельствуют, что активность можно ожидать уже для октасахаридных соединений. Также значимая активность была предсказана для октасахаридов в случае связывания тромбина и гепарин-кофактора II. 4. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ ПОЛИ- И ОЛИГОСАХАРИДОВ Был завершен in vitro скрининг всех полученных в проекте поли- и олигосахаридов и изучена взаимосвязь между их структурой и проявляемой антикоагулянтной и антитромботической активностями. Для оценки влияния исследуемых соединений на процесс формирования фибринового сгустка были выполнены тесты АЧТВ (активированное частично тромбопластиновое время) с использованием нормальной плазмы. Затем были проведены эксперименты с очищенными белками – тромбином, фактором Ха, антитромбином III и гепарин-кофактором II. Также была изучена способность полученных соединений блокировать формирование агрегатов из тромбоцитов, для чего были проведены эксперименты с плазмой, обогащенной тромбоцитами. В качестве образцов сравнения в указанных экспериментах были использованы гепарин и низкомолекулярный гепарин – медицинские препараты, широко применяемые в настоящее время в медицинской практике для лечения и профилактики тромбозов и тромбоэмболических состояний Было показано, что полученный в 2018 году полисахарид CD, содержащий незамещенные по О-2 и О-3 остатки глюкуроновой кислоты, неэффективно ингибирует формирование фибринового сгустка и агрегацию тромбоцитов по сравнению с другими ФХС, полученными нами ранее. Это свидетельствует о ключевой роли боковых фукозных заместителей и сульфатных групп в структуре ФХС. Этот вывод был однозначно подтвержден с использованием синтетических олигосахаридов. Наименее активными были соединения, состоящие из звеньев типа II, в то время как высокоразветвленные крупные олигосахариды, построенные из звеньев типов V и VI, демонстрировали активность, превышающую таковую для низкомолекулярного гепарина. Примечательно, что в экспериментах с очищенными белками синтетические олигосахариды были активнее гепариноидов в тесте с гепарин-кофактором II. Именно эти олигосахариды были выбраны в качестве соединений-лидеров для дальнейшей разработки антикоагулянтных и антитромботических препаратов новых типов. В 2018 году была изучена противовоспалительная активность полученных соединений на модели острого перитонита у крыс. Наименее активным был образец CD (45% ингибирования), в то время как высокоразветвленные поли- и олигосахариды показывали активность в интервале 85-95% ингибирования. Механизм действия, обусловленный связыванием с P-селектином, был однозначно подтвержден с использованием флуоресцентно меченных олигосахаридов в экспериментах с клетками крови: тромбоцитами и нейтрофилами. Регистрация результатов была проведена методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии на оборудовании, установленном в биохимическом модуле ИОХ РАН. Результаты биологических испытаний вместе с синтезом и конформационным анализом олигосахаридов, родственных ФХС, рассмотрены в двух статьях, направленных в печать.