Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В работах 2017 г. методами молекулярного моделирования с использованием супер-компьютерных расчетов исследован аллостерический контроль фермента человека аспартоацилазы (hAsp). По результатам моделирования предложен механизм аллостерического ингибирования при гидролизе N-ацетил-аспартата (NAA), одного из самых распространенных производных аминокислот в головном мозге, hAsp. Детали этой реакции важны для разработки практических способов контроля активности фермента. Поиск аллостерических сайтов с использованием веб-сервера Allosite и программы SiteMap позволил идентифицировать сайты связывания субстрата, расположенные на границе раздела субъединиц молекулы димера hAsp. Методами молекулярного докинга был предсказал конкретный сайт, в котором молекула NAA взаимодействует с аминокислотными остатками Gly237, Arg233, Glu290 и Lys292. Анализ траекторий молекулярной динамики (общее время моделирования превышало 1,5 мкс) показал, что связывание NAA с аллостерическим сайтом приводит к закрытию ворот, ведущих к активному центру фермента. Результаты объясняют наблюдаемое уменьшение скорости реакции гидролиза NAA ферментом hAsp при высоких концентрациях субстрата. Результаты опубликованы в статье: E.D. Kots, S.V. Lushchekina, S.D. Varfolomeev, A.V. Nemukhin «Role of Protein Dimeric Interface in Allosteric Inhibition of N AcetylAspartate Hydrolysis by Human Aspartoacylase», Journal of Chemical Information and Modeling (IF=3.760, Q1), 2017, 57, 1999−2008; DOI: 10.1021/acs.jcim.7b00133 (http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jcim.7b00133). Гидролиз (NAA) аспартоацилазой человека (hAsp) характеризуется специфической зависимостью скорости реакции от концентрации субстрата. При низких концентрациях NAA наблюдается сигмоидальная форма кинетической кривой, за которой следует типичный рост скорости реакции, катализируемой ферментом, тогда как при высоких концентрациях NAA происходит самоингибирование. Результаты моделирования показывают, что эта зависимость скорости согласуется с молекулярной моделью, в которой N-ацетиласпартат выступает в данной реакции как активатор при низких концентрациях, субстрат в умеренных концентрациях и ингибитор при высоких концентрациях. Для доказательства этого вывода идентифицированы следующие сайты связывания NAA на димере hAsp: на поверхности белка (сайты активации) и на интерфейсе димера (сайт ингибирования). Используя подход модели Маркова, показано, что заселенность либо активирующего, либо ингибирующего сайта сдвигает равновесие между конформациями димера hAsp с открытыми и закрытыми воротами, ведущими к активному сайту фермента внутри белка. Эти выводы согласуются с вычисленными значениями констант связывания NAA на димере hAsp, указывая, что активирующий сайт с более высоким сродством к NAA должен быть занят первым, тогда как сайт ингибирования с более низким сродством к NAA должен быть занят позднее. Применение динамического сетевого анализа показывает, что пути распространения сигнала между аллостерическими сайтами (активирующими или ингибирующим) и воротами в активный сайте не мешают друг другу. На основании данной модели разработан кинетический механизм и выведено уравнение для скорости реакции верное для всего диапазона концентраций NAA. Согласие теоретических и экспериментальных кинетических данных подтверждает предложенный механизм катализа. Результаты опубликованы в статье: M.G. Khrenova, E.D. Kots, S.D. Varfolomeev, S.V. Lushchekina, A.V. Nemukhin «Three Faces of N Acetylaspartate: Activator, Substrate, and Inhibitor of Human Aspartoacylase», Journal of Physical Chemistry B (IF=3.177, Q1), 2017, 121, 9389−9397; DOI: 10.1021/acs.jpcb.7b08759 (http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcb.7b08759). Для изучения роли полиморфизма в бутирилхолинэстеразе (BChE) выполнено моделирование методами молекулярной динамики (МД) для ингибированного фермента BChE человека для трех единичных замен (G117S, P285L и F398I), трех двойных замен (G117S/P285L; G117S/F398I и P285L/F398I), и тройных мутантов (G117S/P285L/F398I и G117H / P285L / F398I). Ингибированный фермент BChE был фосфорилирован по остатку Ser198. Результаты показали, что в тройном мутанте доступность атома фосфора к молекуле воды значительно увеличивается по сравнению с BChE дикого типа и двойными мутантами. Доступность атома фосфора к воде является критическим фактором в спонтанной реакции дефосфорилирования. МД моделирование показывает, что все три мутации играют роль в спонтанной реактивации фермента. F398I создает пространство для молекулы воды вблизи атома фосфора. P285L увеличивает доступность воды вокруг остатка диэтоксифосфата. Роль замены G117S - другая. Область вокруг диэтоксифосфатного аддукта сильно гидрофобна в мутанте P285L/F398I; мутация G117S делает область более гидрофильной, и водная оболочка S117 служит источником молекул воды для реакции дефосфорилирования. Это также ускоряет деацилирование интермедиата при гидролизе субстрата. Результаты опубликованы в статье: A.J. Dafferner, S.Lushchekina, P.Masson, G.Xiao, L.M. Schopfer, O.Lockridge «Characterization of butyrylcholinesterase in bovine serum», Chemico-Biological Interactions (IF=3.143, Q2), 2017, 266, 17-27; DOI:10.1016/j.cbi.2017.02.004; (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009279716306615). Изучены новые подходы для доказательства того, что реакция гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) малой ГТФазой Ras в комплексе с ускоряющим белком GAP требует участия Gln61 от Ras в химических превращениях. Профили энергии реакции, рассчитанные методом КМ/ММ, сравниваются для трех модельных систем Ras-GAP-GTP: (1) с сохранением Gln в КМ-части; (2) с перемещением Gln в ММ-часть; (3) с заменой Gln на нитро-аналог в нитро-форме. Результаты показывают, что каталитический остаток Gln участвует в переносе протонов при расщеплении фосфор-кислородной связи в ГТФ и образовании неорганического фосфата. Имидная таутомерная форма Gln появляется в инетрмедиатах реакции. Элементарные стадии расщепления P-O связи и образования неорганического фосфата отвечают низкоэнергетическим процессам, а для восстановления амидной формы Gln требуются более высокие энергетические барьеры, высота которых хорошо согласуется с результатами кинетических экспериментов. Показано, что замена Gln на нитро-Gln в нитроформе должна сохранять каталитическую активность Ras-GAP, но реакция идет по другому механизму.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На втором этапе проекта (2018 г) проводились работы по трем направлениям: моделирование роли генетического и структурного полиморфизма аспартоацилазы человека, моделирование роли генетического и структурного полиморфизма холинэстераз, моделирование механизма реакции ферментативного гидролиза гуанозинтрифосфата. Результаты моделирования структурного и генетического полиморфизма аспартоацилазы человека hAsp объясняют наблюдаемое снижение активности фермента при заменах Y231C и F295S, встречающиеся у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями. Принципиальная новизна модели связана с тем, что по результатам компьютерных расчетов анализируются свойства димера, а не одной молекулы белка, что существенно приближает модель к экспериментальным условиям. Два мономера химически идентичны, но различаются по динамическим свойствам. В каждом мономере и природного фермента, и мутантных форм можно выделить активный центр, к которому с поверхности белка ведет транспортный канал, вход в который контролируется аминокислотными остатками, расположенными на пептидных петлях 62–74 и 282–294. Наиболее важные пары молекулярных групп, образующие своеобразные ворота, составляют Arg71–Glu293 и Tyr64–Lys291. По результатам молекулярно-динамических расчетов с последующим анализом по модели состояний Маркова показано, что константа равновесия между конформациями с открытыми воротами hAsp (Open) и конформациями с закрытыми воротами hAsp (Closed) может сдвигаться для мутантов Y231C и F295S так же, как и при заселенности молекулами субстрата ингибирующих аллостерических сайтов димерной молекулы hAsp. Аналогичный анализ для мутанта K213E показывает, что модель объясняет результаты экспериментальных исследований, согласно которым замещение K213E не влияет на каталитическую функцию фермента. Публикации: https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facs.jcim.8b00666 https://link.springer.com/article/10.3103/S0027131418040041. Поиск путей эффективной реактивации ферментов АХЭ и БХЭ, т.е. способов восстановления аминокислотного остатка серина каталитической триады после его фосфорилирования при взаимодействии с фосфорорганическими агентами, составляет предмет интенсивных экспериментальных и теоретических исследований. Задачей группы молекулярного моделирования, участвующей в этих совместных работах, было предсказание перспективных полиморфных модификаций ферментов, с которыми реакция реактивации может происходить с невысокими активационными барьерами. На основании расчетов путей реакции реактивации методом КМ/ММ были предложены новые варианты мутантов БХЭ (помимо известного ранее варианта G117H), с которыми на энергетических профилях реакции получаются активационные барьеры в пределах 15 ккал/моль, в то время как для нативного (wild-type) фермента и для мутанта G117H величины определяющих барьеров составляют 35 и 25 ккал/моль, соответственно. Показано, что за счет выбора направления нуклеофильной атаки можно подавлять конкурирующую реакцию старения, приводящую к нереактивируемому аддукту. Проведены расчеты для путей переноса протона в активном сайте нативной БХЭ. Эти результаты необходимы для построения корректных систем при моделировании реакций ингибирования, старения и реактивации в нативных и мутантных холинэстеразах с учетом протонированных состояний ключевых аминокислотных остатков, наличия цепей молекул воды и возможности перехода протона между ними, как в ходе реакций, так и на предшествующих или последующих стадиях. Помимо генетического полиморфизма, холинэстеразы отличает полиморфизм структурный — в организме они существуют в мономерной, димерной, и тетрамерной формах. Нами построена модель, полностью отвечающая данным криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновского рассеяния. Эта модель и молекулярно-динамические (МД) расчеты использовались для обработки и уточнения экспериментальных данных, и позволили получить информацию о структуре димера, недоступную из экспериментальных данных из-за низкого разрешения. В результате совместной работы с несколькими группами экспериментаторов, объединяя данные молекулярного моделирования, криоэлектронной микроскопии и малоуглового рассеяния была описана структура и организация нативного тетрамера БХЭ плазмы человека. Публикации: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.00211/full https://www.mmsl.cz/artkey/mms-201888-0013_computational-analysis-of-reaction-mechanisms-for-optimization-of-butyrylcholinesterase-based-catalytic-bioscav.php https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300483X18301896?via%3Dihub http://www.bioscirep.org/content/38/3/BSR20180609.long https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300908418302992?via%3Dihub https://www.mmsl.cz/artkey/mms-201888-0082_dimerization-interface-of-cholinesterases-analysis-of-crystal-structures-free-energy-molecular-dynamics-calcu.php На основании новых расчетов методами квантовой механики/молекулярной механики приведены дополнительные доказательства того, что реакция гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) малой ГТФазой Ras в комплексе с ускоряющим белком GAP требует участия аминокислотного остатка Gln61 от Ras в химических превращениях. Значение этих исследований связано с ролью генетического полиморфизма белка человека Ras в развитии онкологических заболеваний, поскольку мутации по позиции 61 характерны для большого числа пациентов. Результаты моделирования элементарных стадий реакции гидролиза ГТФ показывают, что каталитический остаток Gln61 участвует в переносе протонов при расщеплении фосфор-кислородной связи в ГТФ и образовании неорганического фосфата. Наиболее интересным результатом является реализация амид-имидной таутомеризации боковой цепи глутамина на двух сегментах реакционного пути. Имидная таутомерная форма Gln появляется в интермедиатах реакции; затем на стадии регенерации фермента происходит восстановление более энергетически выгодной амидной формы. Публикация: https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2018/CP/C8CP04817G#!divAbstract