Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Репродуктивное старение является одной из сторон системного процесса старения организма, промотором которого являются процессы свободно-радикального окисления. В начале ХХ века И.И. Мечников предложил использовать обогащение микрофлоры пробиотическими микроорганизмами как способ замедления процессов старения организма. Долгое время считалось, что продление срока жизни в данном случае связано только со снижением заболеваемости. Однако оказалось, что метаболиты пробиотических бактерий обладают выраженным антиоксидантным и ДНК-протекторным действием. Задачей данного проекта является разработка способа замедления репродуктивного старения кур за счет введения в их рацион препаратов пробиотических бактерий рода Bacillus, способных выделять в культуральную среду вещества с антиоксидантной и ДНК-протекторной активностью. Для реализации проекта в 2016 году были сформированы 8 групп суточных цыплят родительского стада кросса «Хайсекс браун» (4 группы курочек по 70 голов и 4 группы петушков по 7 голов в каждой. Группы формировались следующим образом: контрольная, I, II и III – опытные. Контрольная группа получает стандартный рацион, в рацион опытных вводятся препараты пробиотических штаммов (I группа - на основе штамма Bacillus subtilis KATMIRA 1933, II группа - на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens B-1895 и III группа – на основе Bacillus subtilis KATMIRA1933 и Bacillus amyloliquefaciens B-1895 в равных пропорциях). Препараты обоих использованных штаммов обладают антиоксидантной и ДНК-протекторной активностью. Для получения экспериментальных препаратов в необходимых количествах на базе Поволжского научно-исследовательского института производства и переработки мясомолочной продукции в 2016 г был запущен участок их производства. В ходе наблюдений за птицами выявлены: эффект стимуляции роста, увеличение содержания лакто и бифидобактерий в ЖКТ опытных групп, присутствие в помете спор одного из использованных штаммов. Разработаны методики определения длины теломер и уровня повреждения митохондриальной ДНК в клетках крови кур. Отмечено статистически значимое уменьшение относительной длины теломер в I (2.2 раза), II (1.5 раза) и III (2.4 раза) группах по сравнению с контролем, а также статистически значимое снижение уровня повреждения мтДНК во II группе. Насколько эти эффекты соответствуют физиологическим проявлениям старения, будет ясно из дальнейших исследований. На основе анализа существующей стратегии контроля качества корма, принято решение в данном эксперименте использовать дополнительно параметры, характеризующие генотоксичность и мутагенную активность кормов. Выявлена непригодность коммерческого препарата фракции S-9 печени крыс для активации промутагенов, а также высокое качество аналогичного препарата получаемого в лабораторных условиях. С помощью оптимизированного протокола подтверждено отсутствие генотоксичности и мутагенности образцов корма, использованного в проекте. Важными побочными результатами проекта являются: Обнаружение способность пептида субтилосина, выделяемого Bacillus subtilis KATMIRA 1933 подавлять образование биопленок опасного патогена G. vaginalis, что может быть использовано для совершенствования стратегии лечения гарднереллезов Подтверждение способность препаратов на основе KATMIRA 1933 и B-1895 стимулировать прирост массы кур в опытах на больших выборках птиц и при продолжительной экспозиции. Таким образом, эти безопасные препараты могут быть внедрены как заменители синтетических стимуляторов роста при выращивании бройлеров. Более подробная информация о результатах проекта в базе данных http://homebear.ru/rsfchicken/

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Задачей данного проекта является разработка способа замедления репродуктивного старения кур за счет введения в их рацион препаратов пробиотических бактерий рода Bacillus, способных выделять в культуральную среду вещества с антиоксидантной и ДНК-протекторной активностью. В 2016 г на базе Поволжского научно-исследовательского института производства и переработки мясомолочной продукции был запущен участок производства необходимых для исследования пробиотических препаратов. В 2017 году на данном участке, по методике, подробно описанной в отчете за 2016 год, было проведено по 15 выработок препаратов каждого штамма. Выход сухого препарата за одну выработку составил 750±50 г, содержание жизнеспособных клеток использованных штаммов составило 10^9–10^10 КОЕ в одном грамме сухого препарата. В ходе исследований на данном этапе были выделены прошедшие через желудочный тракт птицы бактерии (т. н. армированные штаммы). Были проведены исследования их биологической активности с помощью бактериальных LUX-биосенсоров и препаратов на основе платины («Цисплатин» и «Оксиплат»), которые позволяют моделировать эффекты преждевременного старения на клеточном уровне. Спектр и интенсивность генерации АФК изученными препаратами платины статистически значимо различались. Для дальнейших исследований был выбран выбран «Оксиплат» (оксалиплатин) как препарат, вызывающий не только генотоксический, но и прооксидантный эффект. Было установлено, что значения протекторных эффектов армированных штаммов в большинстве случаев не имели статистически значимых отличий от таковых для исходных вариантов штаммов. Так, для штамма Bacillus subtilis KATMIRA 1933 был показан протекторный эффект, составивший 67,5±5,7 % для исходного и 66,7±6,1 % для армированного варианта. Следовательно, ппродемонстрированные в опытах ДНК-протекторная и антиоксидантная активности пробиотических бактерий сохраняются при колонизации данными штаммами кишечника птиц и могут служить основой для защиты от агрессивных факторов среды, ускоряющих старение. Для определения антагонистической активности обычных и армированных штаммов бацилл были поставлены опыты с патогенными штаммами видов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus intermedius и р. Candida, выделенных у амбулаторных пациентов г. Ростова-на-Дону. Для определения антагонизма применяли дисковый метод. Было показано, что бактерии B. subtilis KATMIRA, как обычные, так и армированные, проявляли антагонистическую активность к виду P. gingivalis. Бактерии B. amyloliquefaciens B1895 проявляли антагонистическую активность к виду S. intermedius. Разницы между действием обычных и армированных штаммов обнаружено не было. К остальным патогенным штаммам изучаемые бактерии антагонистической активности не проявляли. Для установления химической природы действующего вещества в ферментатах пробиотических бацилл была проведена серия опытов, в которых ферментаты подвергали действию температуры, протеиназы и РНКазы, а затем измеряли их ДНК-протекторную активность на бактериальных биосенсорах. Было показано, что ДНК-протекторная активность ферментатов не изменяется после воздействия данных факторов, из чего можно заключить, что оно не является сложным белковым соединением либо сигнальной РНК. На основании анализа данных литературы можно предположить, что целевую активность проявляют более короткие и стабильные молекулы, такие, как олигопептиды, являющиеся вторичными метаболитами клеток бацилл либо результатами ферментации субстрата. В ходе изучения динамики характеристик и параметров микрофлоры ЖКТ было установлено, что микрофлора птиц не изменялась в течение всего периода наблюдений. Бактерии р. Bacillus при стандартной дозировке полностью усваивались птицей и из экскрементов не выделялись. Мониторинг микрофлоры птиц показал, что после достижения ими полового созревания и стабильной массы микрофлора птиц так же стабилизировалась. Достоверных отличий между группами, как и тенденций к изменению параметров, отмечено не было. Внесение в рацион пробиотика не оказало негативного действия на микрофлору птиц. Было осуществлено также индивидуальное мечение птиц: в возрасте 15 недель подопытная птица, при переводе в цех родительского стада, была окольцована индивидуальными ножными бирками для более четкого учета за развитием и продуктивностью. Для эксперимента (условия подробно описаны в отчете 2016 года) изначально были сформированы 8 групп суточных цыплят родительского стада кросса «Хайсекс браун». Группы формировались следующим образом: контрольная, I, II и III – опытные. Контрольная группа получает стандартный рацион, в рацион опытных вводятся препараты пробиотических штаммов (I группа - на основе штамма Bacillus subtilis KATMIRA 1933, II группа - на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens B-1895 и III группа –на основе Bacillus subtilis KATMIRA1933 и Bacillus amyloliquefaciens B-1895). Мониторинг физиологических параметров опытных и контрольной групп птиц показал, что к началу яйцекладки набор живой массы во всех опытных группах был выше, чем в контрольной, но находился в пределах нормативных показателей для данного кросса птицы, так же как и развитие репродуктивных органов ремонтного молодняка. Масса яичника и длина яйцевода ремонтных молодок опытных групп достоверно превышала контроль. Развитие внутренних органов ремонтного молодняка в возрастном аспекте находилось на уровне физиологической нормы, органы не имели каких-либо патологических изменений. Гематологические показатели и биохимический состав крови подопытной птицы находились на уровне нормативных показателей. Содержание гемоглобина, эритроцитов в крови, уровни общего белка и альбуминов, содержание мочевины в сыворотке крови птиц, получавших изучаемые добавки, достоверно увеличилось по отношению к контролю на протяжении всего изучаемого периода. Содержание витамина А, витамина Е, витамина В1, витамина В2 в печени птиц опытных групп значительно превышало контроль. Самцы опытных групп превосходили контрольную группу по концентрации спермиев, общему числу спермиев и суммарному содержанию аминокислот в эякуляте, количество морфологически аномальных клеток было достоверно ниже. Продуктивность кур на всем протяжении учетного периода была высокой и соответствовала ее стандарту породы, однако в опытных группах яйценоскость кур-несушек превышала контроль. Морфологический анализ инкубационных яиц, проведенный перед инкубацией, выявил более высокие значения следующих показателей в опытных группах относительно контроля: масса яиц; масса желтка; толщина скорлупы яиц; индекс белка; число единиц ХАУ. Содержание каротиноидов, витамина А, витамина Е, витамина В1 в желтке яиц, витамина В2 в белке яиц, полученных от кур опытных групп, превышало контроль. Результаты закладок яиц в инкубатор (выводы 05.04.2017; 04.07.2017; 01.10.2017) показали, что во всех подопытных группах вывод цыплят оказался высоким и соответствовал нормативам, характеризующим кросс. Вывод цыплят повысился во всех подопытных группах. Более высокий вывод цыплят в опытных группах был получен за счет увеличения оплодоторенности яиц и снижения гибели эмбрионов в первые 7 суток инкубации. Был проведен анализ относительной длины теломерных участков хромосом повреждений ядерной и митохондриальной ДНК в клетках крови у контрольной и трех опытных групп кур в различные временные периоды эксперимента: 75, 225, 445 дней. С увеличением возраста во всех группах наблюдали статистически значимое уменьшение длины теломер и увеличение числа повреждения ДНК. Статистически значимых различий в относительной длине теломер и стабильности ядерной ДНК между контрольной и экспериментальными группами не установлено. Однако, по сравнению с контрольной группой было выявлено снижение относительного числа повреждений в митохондриальной ДНК I группы на 20- 22 %. Полученные значения длины теломерных участков хромосом и повреждения митохондриальной и ядерной ДНК у контрольной и опытных групп кур свидетельствуют об отсутствии негативного (генотоксического) влияния пробиотических препаратов, а также позитивном (увеличение стабильности митохондриальной ДНК) эффекте пробиотической добавки Bacillus subtilis KATMIRA1933. Для сведения к минимуму контактов тест-объекта с экзогенными токсинами проводился мониторинг на потенциальную генотоксичность и мутагенность компонентов используемых кормов. Был подобран адекватный задачам метод метаболической активации с использованием ферментов микросомальной фракции печени кур. Тестирование токсичности и генотоксичности образцов корма (экстракта корма и кормовой добавки) показало, что образцы корма и использованной для его обогащения кормовой добавки, содержащей препараты на основе пробиотических бактерий, не демонстрируют токсических, генотоксических и прооксидантных эффектов и не содержат потенциальных генотоксинов и мутагенов. Более подробная информация о результатах проекта в базе данных http://homebear.ru/rsfchicken/

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
При изучении динамики характеристик и параметров микрофлоры желудочно-кишечного тракта было установлено, что после достижения половой зрелости микрофлора стабилизировалась и больше не менялась в течение всего периода наблюдения. Бактерии рода Bifidobacterium всегда находились в количестве более 10^6 КОЕ / г, Lactobacillus - более 10^7 КОЕ / г. Бактерии Bacillus при введении в стандартной дозировке полностью поглощались птицей и не выделялись из экскрементов. Было показано, что обычные и армированные штаммы способны к биоплёнкообразованию. Получены электронные микрофотографии биоплёнок в готовом препарате, показано, что бактерии в препарате плотно упакованы в матриксе. Был проведен ряд экспериментов по оптимизации параметров твердофазной ферментации спорообразующих бацилл. Было обнаружено, что соя и горох могут быть подходящим субстратом для приготовления препарата. Жмых подсолнечника также может служить субстратом, но в этом случае выход бактерий меньше. Были подобраны оптимальные параметры инокуляции, температуры инкубации (42° С) и сушки препарата (45 ° С - сушка занимала 3 дня при этой температуре, количество бактерий составляло 4,9 × 10^9 КОЕ / г, посторонней микрофлоры не наблюдалось). Показано, что исследуемые бактерии способны разлагать крахмал и белок, что позволяет им хорошо расти на предлагаемых субстратах. Было продолжено лабораторное производство препаратов, необходимых для исследования эффектов пробиотических бактерий, по разработанной нами методике. Выход сухого препарата за одну выработку составил 750+50 г, содержание жизнеспособных клеток использованных штаммов составило 4-8·10^9 КОЕ в одном грамме сухого препарата. Тестирование токсичности и генотоксичности образцов корма (экстракта корма и кормовой добавки) показало, что образцы корма и использованной для его обогащения кормовой добавки, содержащей препараты на основе пробиотических бактерий, не демонстрируют токсических, генотоксических и прооксидантных эффектов и не содержат потенциальных генотоксинов и мутагенов. Была получена коллекция пробиотических штаммов бактерий, выделенных из кишечника птиц и идентифицированных с помощью масс-спектрометрии: Lactobacillus salivarius 01, Lactobacillus salivarius 02, Lactobacillus salivarius 03, Lactobacillus вольеры, Lactobacillus crispatus 01, Lactobacillus crispatus 02, Lactobacillus crispatus, 03, Lactobacillus ацидофилин, лактобактерии delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Enterococcus durans, Bifidobacterium ovatus 01, Bifidobacterium ovatus 02, Bifidobacterium bifidum. Было обнаружено, что ДНК-защитная активность штаммов сохраняется во фракции метаболитов <3 кДа для B. amyloliquifaciens B-1895 (активность выделенной фракции составляет 61,02 ± 5,3%) и <10 кДа для B. subtilis KATMIRA 1933 (60, 11 ± 6,1% в выделенной фракции). С использованием метода масс-спектрометрии с разделением по молекулярным ионам, было обнаружено, что целевые метаболиты имеют m/z 876, 836, 577 и 390. Эти и другие ранее установленные свойства этих веществ позволяют предположить, что это короткие стабильные молекулы олигопептидов. Тенденции в изменении физиологических параметров, установленные нам на предыдущем этапе исследования, сохранились и получили развитие в 2018 г. Тенденция к увеличению живой массы во всех экспериментальных группах по сравнению с контрольной группой сохранялась в течение всей жизни птиц вплоть до 81 недели ( в I группе - 4,31%, во II группе - 3,86% и III группе - на 0,83%). Различия в параметрах репродуктивных органов также сохранялись на протяжении всего периода. Масса яйцевода цыплят из разных экспериментальных групп значительно (P <0,05) превысила контроль: в I группе на 17,93%, во II группе - на 8,29%, в III группе - на 7,98%. Длина яйцевода также превысила контрольное значение на 9,49%, 5,69% и 4,85% соответственно. Вес семенников петухов опытных групп был выше, чем у контрольной группы: в I группе на 9,44% (P <0,01), во II группе на 8,77% (P <0,01) и в III группе на 5,09% (P < 0,05). Тенденции к улучшению биохимических показателей крови сохранились. К концу эксперимента наблюдалось значительное увеличение содержания общего белка в сыворотке крови у цыплят экспериментальной группы по сравнению с контролем: на 12,68% (P <0,01) в группе I, 9,16% (P <0,01) в группе II и 6,20. % (P <0,05) в группе III. Аналогичная тенденция наблюдалась у петухов с увеличением на 9,95% (P <0,01), 6,57% (P <0,05) и 5,62% (P <0,05) соответственно. Было обнаружено увеличение уровня глюкозы, не превышающее стандартных показателей. Для всех групп наблюдалось естественное снижение яйценоскости, связанное с возрастом, но в экспериментальных группах I и II оно происходило медленнее. На 82-й неделе яйценоскость в группах I и II по-прежнему превышала контроль. Наиболее значимый результат наблюдался в I группе (на 4%). Увеличение количества кальция и фосфора наблюдалось в яйцах кур экспериментальных групп. Содержание кальция в яйцах первой опытной группы было выше контрольной на 40,94 (р <0,05), второй опытной - на 27,0 и третьей - на 21,34%, что подтверждает высокие результаты инкубации, несмотря на снижение содержания кальция в сыворотке крови кур и яичной скорлупы. Концентрация фосфора также выше, чем в контрольной группе в экспериментальных группах: 52,40 (р <0,05), 42,64 и 42,28% соответственно. В возрасте 82-х недель самцы опытных групп превосходили контрольную по объему эякулята на 9,80, 5,88 и 3,92%, концентрации спермиев в эякуляте – на 16,06 (Р<0,01), 7,23 и 5,22%, и общему числу спермиев в эякуляте – на 11,56 (Р<0,05), 8,16 и 9,52% соответственно группам. В опытных группах, несмотря на некоторое увеличение данного показателя в сравнении с предыдущими, число морфологически аномальных клеток в эякуляте оказалось ниже по отношению к контролю на 33,91 (P<0,01), 28,55 (P<0,01) и 28,23% (P<0,01) соответственно группам. Согласно результатам анализа длины теломерных участков хромосом, статистически значимых различий в относительной длине теломер между контрольной и экспериментальной группами обнаружено не было. Анализ относительной длины теломер проводился по методике, разработанной нами и описанной в прошлогоднем отчете. Что касается стабильности ядерной и митохондриальной ДНК, статистически значимое уменьшение числа повреждений митохондриальной ДНК было обнаружено в группе I по сравнению с контрольной группой, тогда как статистически значимых различий в стабильности нДНК обнаружено не было. Относительный уровень повреждения мтДНК у цыплят составил: 2,26 ± 0,56 в контрольной группе, 1,69 ± 0,45 в группе I, 2,17 ± 0,46 в группе II, 2,23 ± 0,6 в группе III. По сравнению с контрольной группой статистически значимое снижение количества травм в I группе выявлено на 34% (р = 0,009). Было установлено, что пробиотическая добавка Bacillus subtilis KATMIRA1933 (группа I) увеличивала транскрипционную активность генов синтеза вителлогенина (vtg1, vtg2, vtg3), а комбинированный препарат (группа III) вызывал повышение экспрессии генов vtg1 и vtg3. Вителлогенин является белком-предшественником яичного желтка, и гены, контролирующие его синтез, активно экспрессируются в печени цыплят в течение их репродуктивного периода. У птиц три гена синтеза вителлогенина: vtg1, vtg2, vtg3. В нашем исследовании анализ экспрессии генов проводился методом ОТ-ПЦР с использованием разработанной нами панели праймеров, специфичной для генов vtg1, vtg2, vtg3, actb, gapdh, taf2 и taf4 (последние четыре использовались в качестве референсных генов). Относительный уровень экспрессии гена vtg1 у кур составил: 52.9±10.1 в контрольной группе, 69.8±17.8 в I группе, 58.5±14.6 во II группе, 63.5±12.8 в III группе. Достоверное повышение уровня мРНКvtg1 отмечено для I группы на 31 % (P=0.005) и III группы на 20 % (P=0.038). Относительный уровень экспрессии гена vtg2 у кур составил: 73.5±8.5 в контрольной группе, 99.5±29.4 в I группе, 85.5±15.3 во II группе, 82.5±13.5 в III группе. Достоверное увеличение транскрипционной активности гена vtg2 было выявлено только у кур I группы на 35 % (P=0.003). Относительный уровень экспрессии гена vtg3 у кур составил: 0.011±0.002 в контрольной группе, 0.020±0.006 в I группе, 0.015 ± 0.007 во II группе, 0.017 ± 0.007 в III группе. По сравнению с контролем уровень мРНКvtg3 былдостоверно выше у кур I группы на 82 % (P=0.0003) и у кур III группы на 58 % (P=0.0029). На основании полученных данных построена регрессионная математическая модель, позволяющая оценить степень замедления репродуктивного старения птиц. Модель была основана на данных по производству яиц. Из модели следует, что относительная (по сравнению с контролем) яйценоскость в статистически значимых случаях (для I и II экспериментальных групп) увеличивается со временем. Рассматривая яйценоскость как характеристику степени старения у цыплят, на основании полученных данных можно сделать вывод, что скорость старения в этих группах замедляется. Так, на 82-й неделе производство яиц в группе I превысило контроль на 4%. Регрессионный анализ динамики изменения относительной яйценоскости позволяет сделать вывод о том, что скорость старения цыплят в опытной группе I по сравнению с контрольной группой замедлилась на 2,1%. Таким образом, эксперимент, который продлился 82 недели, показал, что хроническое введение препарата, содержащего пробиотические бациллы, выделяющие комплекс природных антиоксидантов и ДНК-протекторов, не только стимулирует рост и яйценоскость продуктивной птицы, но и замедляет возрастное падение яйценоскости, а, следовательно, замедляет репродуктивное старение. Молекулярной основой такого замедления является стабилизация митохондриальной ДНК, но не замедление укорочения теломер. Физиологической основой, по-видимому, является стимуляция выработки вителлогенина. Результаты, полученные в ходе проекта, открывают путь к созданию семейства пробиотических препаратов нового поколения, действие которых направлено на получение целого спектра полезных для птицеводства эффектов через стабилизацию митохондриального генома. Облегчает движение в этом направлении то, что в ходе проекта нами была апробирована твердофазная ферментация пробиотических бацилл, которая может стать основой производства с недостижимыми до сих пор параметрами экономической эффективности.