Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Фактические сведения, полученные при выполнении плана работ на 2016 год, тематически распределяются на два основных раздела. Первый раздел включает экспериментальные данные по изучению действия электрохимически активируемой воды в метастабильном состоянии на развитие апоптоза, индуцированного активными формами кислорода (АФК). Выбор данного объекта обусловлен не только фундаментальной актуальностью научной проблемы, но и значимостью клеточных технологий для репродукции животных в сельском хозяйстве. Основным ограничивающим фактором в данном исследовании является относительно быстрая кинетика перехода метастабильной воды в стационарное состояние, что требует доступности лабораторной модели для воздействия в течение переходного периода. С учетом всех обстоятельств, на ооцитах и клетках раннего эмбриона мыши отработана экспериментальная модель, индуцированного АФК (0,2 мМ Н2О2) на фоне действия метастабильной фракции воды. Наличие апоптоза регистрируется по типичным для данного состояния клетки морфологическим признакам, а количественным критерием начала апоптоза является сжатие клетки. Проблема измерения объема микрообъекта нестрогой геометрической формы, например 2-х клеточного эмбриона или деформированного ооцита, была решена посредством лазерной микротомографии с последующей 3-D реконструкцией объекта (QLSM), включающей стадии быстрой криофиксации и низкотемпературной дегидратации. Анализ количественных параметров морфологии в течение клеточной гибели раннего эмбриона и ооцита требовал отработать методику получения тонких срезов клетки. Используя сочетание подходов электронной микроскопии ультратонких срезов и гистологии, отработана методика получения срезов 0.5 мкм толщиной, что обеспечивает необходимое пространственное разрешение. Следует отметить две особенности полученных данных. Во-первых, ооцит устойчив к действию апоптоза, индуцированного АФК (0.2 мМ Н2О2). По-видимому, объяснение состоит в том, что пероксид водорода транспортируется в клетку через канал Q3 из семейства аквапоринов, который не активирован в мембране зрелой яйцеклетки. Во-вторых, католит, обладающий отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом, не купирует развитие апоптоза. Данный феномен требует дополнительного изучения. Он обусловлен, возможно, тем, что действие АФК реализуется не только через разрушение мембран, но и на рецепторном уровне, который требует гораздо меньших концентраций активного агента. Мишенью действия сигнальных молекул АФК могут быть, например, циспетлевые рецепторы, содержащие тиоловые группы на внеклеточном сайте рецепторного белка. В рамках проекта планируется провести дополнительные исследования, уточняющие действие электрохимически активируемой воды на мембранный транспорт при индуцированном апоптозе. С учетом того, что весь аналитический комплекс полностью разработан, эти эксперименты будут посвящены дальнейшему накоплению фактического материала о физиологии яйцеклетки и клетки раннего эмбриона мыши на фоне действия фракций метастабильной воды. Полученные данные позволят прогнозировать биологические эффекты, например католита (аномально низкий окислительно-восстановительный потенциал), в области репродукции млекопитающих и станут основой для разработки новых направлений применения электрохимически активируемой воды в сельском хозяйстве. Второй раздел исследований посвящен разработке лабораторного технического устройства и условий для культивирования микробных биопленок (как модели процесса биообрастания трубопроводов). Был создан рабочий макет в виде рециркуляционной системы воды с возможностью заражения микрофлорой и с возможностью периодического обследования внутренней поверхности труб для микробиологического исследования. Такой макет позволяет моделировать условия контаминации, задавать параметры роста биопленки и контролировать результат обеззараживания. Важно отметить, что образование биопленок – не только один из факторов патогенности микроорганизмов, но и процесс, который ведет к значительному изменению чувствительности к антибактериальным препаратам. Изменчивость и метастабильность процессов, обеспечивающих жизнедеятельность сообщества микроорганизмов в биопленках, требуют адекватного подхода к выбору способов борьбы с подобными проявлениями жизни на микроуровне. Критерием нового подхода к выбору средств борьбы с биопленками должен быть их комплексный меняющийся метастабильный состав с повышенной реакционной способностью, содействующей преодолению биополимерного матрикса и разрушению клетки. При выборе способа обработки контаминированных трубок рециркуляционнной системы применяли слабоминерализованные (менее 0,9 г/л) электрохимически активированные метастабильные растворы (анолит), характеризующиеся высокими положительными значениями ОВП (от + 750 до +1100 мВ) и рН в диапазоне 4-7. Активнодействующим началом растворов служила смесь метастабильных хлоркислородных и гидропероксидных оксидантов. Метастабильная смесь включает хлорноватистую кислоту, гипохлорит-ион, озон, пероксид водорода, диоксид хлора, активные формы кислорода. Наличие роста микроорганизмов на стенках трубки отслеживали с помощью светового микроскопа, после чего проводили морфологический анализ микробных клеток и образованных ими биопленок с помощью сканирующего электронного микроскопа. Учитывая, что адгезивные свойства биопленок, закрепившихся на внутренней поверхности трубопроводов, обусловливают их дополнительную устойчивость к удалению под действием протока воды, а водопроводные коммуникации, в т.ч. на сельскохозяйственных предприятиях, как правило, имеют продолжительную разветвленную структуру, изучали эффективность ЭХА-растворов для удаления биопленок на разных участках трубопроводов. На этапе подготовки к исследованиям следующего года был испытан проточный способ обработки внутренней поверхности трубок рециркуляционной системы.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Основные научные результаты, достигнутые в отчетном 2017 году, связаны с исследованием влияния метастабильных электрохимически активированных (ЭХА) растворов на микроструктуру бактериальных биопленок, сформированных на внутренней поверхности модельного трубопровода в рамках специально разработанного рециркуляционного реактора.На примере смыва с поверхности оборудования (поилка для сельскохозяйственных животных) отработана технология анализа спектра микроорганизмов, образующих биопленки на внутренних поверхностях оборудования и водопроводных коммуникаций сельскохозяйственных предприятий, с применением культурального бактериологического анализа и ПЦР в реальном времени (PCR-RT). Данная технология основана на моделировании роста микробной пленки в условиях водных коммуникаций с применением рециркуляционного реактора. Чистая лабораторная культура кишечной палочки (E.coli) в планктонной форме служила стандартным источником контаминирования. Параллельно с бактериологическим и PCR-RT анализом проведено морфологическое изучение сформированной пленки посредством сканирующей электронной микроскопии (SEM). Таким образом, разработан унифицированный подход для комплексного морфо-микробиологического и генно-молекулярного анализа биопленки на поверхности конструктивных элементов систем водопровода.  Моделью водной коммуникации, контаминированной бактериями, служил трубопровод рециркуляционного реактора, засеянный  чистой культурой  E.coli или микроорганизмов, характерных для молочного производства, в качестве которых использовали лиофильно высушенный ассоциат молочнокислых бактерий (МКБ) (Lactococcus lactis, Streptococcus thermоphilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii). МКБ, E.coli или их смешанная культура формировали биопленку на внутренних поверхностях трубок из ПВХ, стекла, пластинок из пищевой нержавеющей стали. Условия отдельных этапов санитарной обработки трубопровода (молокопровода) моделировали на экспериментальном стенде. Антимикробные ЭХА растворы,  в отличие от  растворов со стабильным химическим составом, содержат активнодействующие вещества (АДВ) в  неравновесном состоянии, способные вызвать множество необратимых нарушений жизненно важных функций микробных биополимеров на уровне реакций передачи электронов. Для обработки модельных поверхностей  применяли водопроводную воду (контроль),  растворы NaOH, ЭХА растворы, электрохимически синтезированные из водных растворов гидроксида, хлорида и гидрокарбоната натрия:  анолиты; АДВ − нестабильная смесь высокоокисленных гидропероксидных, хлоркислородных, пероксокарбонатных соединений в возбужденном состоянии; ОВП + 800 ÷ +1000 мВ;   католиты; АДВ − высоковосстановленные неустойчивые соединения (свободные гидроксильные группы, другие электрондонорные частицы); ОВП -50 ÷ -930 мВ. Переменными факторами служили  ОВП, концентрация АДВ в растворах, скорость потока, время экспозиции, стационарный или циклический режим. Посредством микроскопического анализа поверхности выявляли наличие или отсутствие остаточных устойчивых микробных клеток или фрагментов матрикса после обработки поверхности. Соскобы биопленок с поверхности трубки анализировали методом ПЦР в реальном времени для получения молекулярной карты, характеризующей качественные изменения в составе биопленочных микроорганизмов. Рельеф поверхности биопленки визуализировали посредством SEM. Морфологический анализ трехмерной структурной организации биопленок, состава клеток и микроструктуры их внеклеточного полимерного матрикса осуществляли, используя сканирующий электронный микроскоп JSM-6390A (JEOL, Япония) с увеличением от 500 до 10000. Специально для исследования поверхностей из различных материалов была скорректирована и отработана методика подготовки препарата. Установлено, что и католит, и анолит оказывают повреждающее действие на клетки и матрикс бактериальной пленки. Наиболее сильные эффекты выявлялись после использования щелочного католита (ОВП -50 ÷ -930мВ), анолита ( 0,05% АДВ, ОВП +800÷ +1000 мВ) и их комбинации. Подтверждена зависимость степени дезинтеграции биопленки от ОВП раствора, концентрации АДВ, продолжительности обработки, температуры. Эффект от применения католита с отрицательным значением ОВП превосходил эффект от применения неактивированного раствора NaOH с ОВП +25÷+30 мВ аналогичной концентрации. Данные микробиологического анализа и SEM подтверждают эффективность использования анолита для удаления с поверхности трубок ПВХ клеток E. coli, МКБ и их смешанной культуры. Эффективность низкоконцентрированного (0,05% АДВ) нейтрального (рН 5,0-6,5) анолита оказалась выше, чем эффективность сильнощелочного (рН 13,5-13,7) раствора NaOH (10% АДВ). Методом SEM установлено, что в трубках ПВХ, на стеклянной и стальной поверхностях с различной интенсивностью происходит как накопление и закрепление биопленок E. coli и МКБ, так и их дезинтеграция.  На примере лабораторной культуры E.coli разработана экспериментальная модель с целью оценки устойчивости условно-патогенной микрофлоры в составе биопленки к действию ЭХА водных растворов. Для наблюдения за реакцией микроорганизмов использовали рециркуляционный реактор, переменным фактором были физико-химические параметры ЭХА растворов, температура, скорость промывания и др.  Кишечную палочку вносили в поток субстрата в виде суспензии (планктонной формы). Скорость роста E.coli в ситуации in vitro была достаточной, чтобы получить количество биомассы, необходимое для PCR-RT анализа. Для оценки in vitro устойчивости биопленки к действию ЭХА водных растворов предложена экспериментальная модель, которая позволяет задавать параметры биопленки и моделировать условия культивирования. Показано, что ЭХА водного раствора влияет на клетки и матрикс пленки, сформированной E.coli в условиях экспериментальной модели.  Экспериментально установлено, что ЭХА растворы, значения ОВП которых имеют противоположный заряд, разрушают клетки и биоматрикс на трубках ПВХ, стеклянной и стальной поверхностях, обладающих различными адгезионными свойствами.  Для удаления биопленки различных видов бактерий требуется различное время обработки и концентрация АДВ. Методом SEM с увеличением в 500÷10000 раз на модели трубопровода показано, что для всех материалов видимый эффект обработки моющими и дезинфицирующими средствами, хотя и приводит к уничтожению живых микробных клеток, не означает реального удаления матрикса биопленки. Степень дезинтеграции биопленок МКБ и E. coli под действием раствора NaOH, католита и анолита отражена на рис. 18.  Изображения на микрофотографиях подтверждают, что биопленки как МКБ, так и E. coli, по-разному разрушаются при различной последовательности применения высокоокисленных или высоковосстановленных ЭХА растворов. Дезинтеграция и удаление клеток и биоматрикса с поверхности трубки ПВХ заметно выше после использовании сначала анолита (раствора хлорноватистой кислоты, гипохлорит-иона в присутствии малых концентраций низкомолекулярных сильных окислителей – пероксида водорода, озона, активных свободнорадикальных и ионизированных форм кислорода и хлора) с ОВП +800 ÷ +900 мВ, а затем щелочного католита c ОВП -50 ÷ -900 мВ, который содержит, помимо NaOH, высокоактивные неустойчивые гидроксильные соединения, придающие раствору выраженные восстановительные свойства, высокую химическую активность, усиливают смачивающую, проникающую, растворяющую способность. Можно предположить, что под воздействием на биоматрикс  анолита между метастабильными оксидантами и биопленкой возникает большая разность (градиент) ОВП, способная индуцировать изменение вещества матрикса вследствие электронодонорных и электроноакцепторных взаимодействий, приводящих к молекулярным перестройкам экзополимеров. Вся сумма воздействий анолита на биопленку, помимо прямых  множественных атак на микробные клетки со стороны разнообразных хлорсодержащих окислителей и активных форм кислорода, сопровождается нарушением электростатического равновесия биопленки, подготавливая ее разрушение и затрудняя формирование резистентности микроорганизмов. Последующее применение католита оказывает на биопленку полярно противоположное электрическое воздействие, в щелочной среде углубляющее разрушение клеток и дезинтеграцию биоматрикса. Сформулирован новый подход к разрушению биопленок как необходимость удаления матрикса и предотвращения его образования и закрепления на поверхности. Новый теоретический подход ставит новые практические задачи: изучение способности к регенерации микробной популяции, морфологически модифицированной действием ЭХА растворов; подбор режимов систематической обработки поверхности в течение длительного времени ЭХА растворами с целью замедления и предотвращения формирования биопленки на сложных поверхностях  полимерного материала (на примере ПВХ), нержавеющей стали.  На примере композиции пробиотических МКБ (описано выше) изучено влияние ЭХА растворов на интенсивность роста и морфологических характеристик микроорганизмов – продуцентов биологически активных веществ на модельных средах. С помощью микробиологического и морфологического анализа клеток получены новые знания об ускорении роста и накоплении биомассы пробиотических бактерий, применяемых в кормовых бактериальных препаратах в среде на основе ЭХА растворов. Показано, что разработанный рециркуляционный реактор эффективен при формировании биопленки и оценке действия ЭХА водного раствора на клетки и матрикс в модельных условиях.  По плану работ проведены дополнительные исследования модифицирующего действия фракции ЭХА воды (католита) на физико-химические свойства физиологического раствора на основе буфера, используемого для клеточных биотехнологий. Уточнены физико-химические параметры, включая pH и ОВП инкубационной среды на основе буфера (раствор Дульбекко, раствор М 16, раствор Тироде). Показано, что антиоксидантная активность католита снижается в составе физиологической среды (буферного раствора).Получены дополнительные данные о механизме действия фракций ЭХА воды (католита) на развитие апоптоза у ооцита и клетки раннего эмбриона мыши. Показано, что, несмотря на антиоксидантный статус, инкубационная среда на  католите не купирует развитие апоптоза у зиготы и двухклеточного эмбриона мыши в условиях экспериментальной модели. В отличие от раннего эмбриона, ооцит мыши остается резистентным к индуцированному апоптозу. На международных конференциях представлено 3 доклада. В научных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (SCOPUS) 2 статьи опубликовано и 1 статья официально принята к публикации; 2 рукописи проходят этапы рецензирования в российских научных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» или «Скопус». В изданиях, учитываемых в базе данных «РИНЦ», вышло 6 публикаций. Зарегистрированные результаты интеллектуальной деятельности: заявка № 2017130119 от 25.08.2017 о выдаче патента РФ на полезную модель "Устройство для исследования процесса биообрастания", заявка № 2017130117 от 25.08.2017 о выдаче патента РФ на полезную модель "Устройство для изучения процесса воздействия дезинфицирующих средств на биопленки в проточных системах". Получен Диплом 1 степени за участие в конкурсе "Лучшая научная работа" в секции "Сельскохозяйственные науки" по результатам работы международной научно-практической конференции "Тенденции и инновации современной науки" (г. Астана, Казахстан). Получен Диплом 1 степени за участие в конкурсе "Лучшая научная работа" в секции "Сельскохозяйственные науки" по результатам работы международной научно-практической конференции "Современная наука: актуальные вопросы, достижения и инновации" (г. Минск, Белоруссия).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году акцент сделан на работы, посвященные получению наночастиц из природного минерала цеолита с последующим покрытием их фосфолипидами, а также изучению накопления и распределения таких частиц в эпителии тонкой кишки экспериментального животного (мыши NMRI). Для проведения комплексных исследований использовали современные высокотехнологичные методы, включая сканирующую электронную микроскопию (SEM), метод динамического рассеяния света, масс-спектрометрию вторичных ионов (ToF-SIMS), электронно-зондовый микроанализ (X-ray EPMA), спектрофотометрию (кинетика осаждения), высокоразрешающую оптическую микроскопию. Результаты, полученные с помощью указанных подходов, обеспечили знание о способе получения из природного минерала наночастиц цеолита и свойствах этих частиц, а также об их накоплении и распределении в эпителии тонкой кишки мыши. Выбор объекта обусловлен не только научной актуальностью проблемы транспорта наночастиц в слизистом слое, но и ее прикладной значимостью в области обеспечения безопасности и повышения эффективности сельскохозяйственного и пищевых производств.      Разработана технология получения наноразмерных частиц активного компонента цеолита со 100% содержанием клиноптилолита, для чего коммерческий препарат размельчали на планетарной шаровой мельнице. Полученный порошок растирали при низкой температуре (-40ºС) с последующим нагреванием в высоковакуумной камере. Главным отрицательным биологическим эффектом клиноптилолита может быть его токсичность в случае присутствия включений тяжелых металлов (Pb, Cd, Zn и т. д.). Электронно-зондовый микроанализ приготовленного препарата показал наличие характерных для минерала элементов (О, Al, Si) и отсутствие загрязнения. Перед применением водную взвесь клиноптилолитовой пудры диспергировали ультразвуком (44 кГц) с последующим разведением в питьевом растворе до конечной концентрации 500 ppm.      В области нанотехнологий обязательным параметром является наноразмерность изучаемого объекта. С целью непосредственного измерения размера полученных наночастиц сорбента применили сканирующую электронную микроскопию. Соблюдение разработанной технологии “top-down” позволило получить частицы клиноптилолита размером около 100 нм. Сравнение данных электронной микроскопии и метода динамического рассеяния света показывает различие значений на порядок, что объясняется особенностью метода, когда рассеяние света зависит не только от размера, но от формы частицы, качества ее поверхности и материала, из которого она сделана. Метод не позволил получить количественный результат, но с его помощью уверено определяется относительное изменение размера наночастиц клиноптилолита. Известны положительные результаты совместного применения цеолита и фосфолипидов, которые добавляют в корма для повышения питательной ценности, улучшения переваримости и усвоения питательных веществ, нормализации обмен жиров, а также укрепления иммунитета сельскохозяйственных животных. В качестве источника фосфолипидов использовали коммерческий препарат, из которого экстрагированием выделяли лецитин (фосфатидилхолин). Этот класс фосфолипидов играет важную роль в фундаментальном механизме создания мембраны клетки и трансмембранном транспорте веществ. Гипотетически, при смешивании наночастиц сорбента и раствора лецитина создаются условия для сорбции фосфатидилхолина на клиноптилолите. При кажущейся простоте предложенной методики оставалось не ясным, удалось ли инициировать этот процесс? Для ответа на поставленный вопрос использовали гравиметрический подход и масс-спектрометрию вторичных ионов (ToF-SIMS). За счет пористого строения клиноптилолита в результате сорбции лецитина одновременно должны расти плотность и размер наночастиц - факторы, которые ускоряют осаждение. Полученные кинетические кривые подтвердили создание композиции фосфатидилхолина и наночастиц природного клиноптилолита.      Наличие пленки фосфолипидного покрытия на наночастице регистрировали посредством метода ToF-SIMS, который используют для изучения молекулярного состава тончайшего (~40 нМ) слоя. В части масс-спектрометрии вторичных ионов исследование проводили на оборудовании ЦКП «Анализ химических, биологических систем и природных материалов: масс-спектральная микроскопия и фемтосекундная лазерная микроскопия-спектроскопия» (ИХФ РАН, г. Москва). Учитывая множественность пиков в каждом масс-спектре, для их анализа применили метод РСА (principal component analysis), с которым можно ознакомиться по ссылке http://math-info.hse.ru/f/2015-16/ling-mag-quant/lecture-pca.html. Полученные данные свидетельствуют о том, что фосфолипидное покрытие присутствует на поверхности наночастицы, что должно изменить ее размер. Действительно, метод динамического рассеяния света показал увеличение размера частицы в ~2,5 раза после обработки фосфатидилхолином. Отметим, что результаты сканирующей электронной микроскопии не вполне согласуются с гипотезой  о том, что лецитин взаимодействует с отдельной частицей клиноптилолита. При визуализации препарата видны наноразмерные кластеры (~500 нм), включающие нескольких нчастиц, которые заключенны в фосфолипидную матрицу. Другими словами, эффективный объем сорбированного фосфолипида может в десятки раз превышать объем исходной наночастицы, что указывает на ее значительный потенциал для массопереноса. Поэтому фисфолипидные кластеры следует рассматривать в качестве капсул для адресной доставки непосредственно в область всасывающей мембраны энтероцита веществ, например, жирорастворимых витаминов. Таким образом, была отработана методика и аналитические подходы контроля сорбции фосфотидилхолина наночастицами природного клиноптилолита. Накопление наночастиц в слизистой тонкой кишки и их влияние на морфологию энтерального эпителия изучали после хронического потребления частиц в составе питьевого раствора. Испытания проводили на здоровых самцах лабораторных мышей линии NMRI, достигших двухмесячного возраста к началу эксперимента. За счет латеральной диффузии и накопления наноразмерных тел их мишенью может быть пристеночное пищеварение и функция трансмембранного всасывания. Однако картирование посредством молекулярного анализа и электронно-зондового микроанализа показало отсутствие в компартментах слизистого эпителия алюминия, элемента-маркера, входящего в состав цеолитов. Другими словами, два независимых метода подтвердили отсутствие накопления наночастиц природного клиноптилолита в слизистом слое тонкой кишки экспериментального животного. Этот факт очень важен, так как позволяет значительно увеличить в рационе концентрацию частиц сорбента, что усилит его положительный эффект. Примером может быть животноводство, где цеолит применяют в качестве минеральной кормовой добавка или в комбинации с фосфолипидом для повышения питательной ценности. Полученный опыт может быть воспроизведен для других физико-химических факторов в условиях их хронического контактного действия на энтеральный эпителий. Однослойный слизистый эпителий в основных структурных элементах имитирует биопленку и аналогичен ей по ряду физико-химических свойств. Действительно, энтероциты закреплены на базальной мембране (подложка), а с внешней стороны апикальной мембраны покрыты слоем гликопротеинового секрета – аналог матрикса биопленки. Поэтому основные закономерности транспорта наночастиц в слизистом слое, могут быть аппроксимированы на проблему эффективной доставки антимикробных препаратов внутрь бактериальной пленки. Следует остановиться на особенности энтерального эпителия в ряду других мукозных слоев. Исследование действия наночастиц интенсивно проводят на экспериментальной модели легких. Для этого органа характерно замкнутое внутреннее пространство, что способствует аккумуляции со временем любых частиц. Наоборот, физиология тонкой кишки направлена на активное выведение веществ из объема просвета и, следовательно, основным фактором становится накопления только наночастиц в слизистом слое в результате латеральной диффузии. Гипотетически отдельная частица может диффундировать в межклеточное пространство или посредством фагоцитоза проникать в цитоплазму энтероцита. Исследование морфологии тонкой кишки на уровне световой микроскопии также не показало нанотоксичного эффекта хронического потребления водной взвеси наночастиц клиноптилолита. Противоположное заключение вытекает из эксперимента с длительным потреблением анолита в качестве питьевого раствора. Если исходить из морфологических признаков, то при таком воздействии моделируется ситуация желудочно-кишечного синдрома с характерными нарушениями структуры слизистого эпителия тонкой кишки.