Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Были созданы рекомбинантные лентивирусные конструкты, кодирующие мутантные формы онкогенов BRAF(V600E) и NRAS(Q61R), а также соответствующие гены дикого типа. Трансдукция клеток HEK293 конструктами, кодирующими мутантные формы BRAF(V600E) и NRAS(Q61R), приводила к повышению экспрессии мРНК ключевого downstream-эффектора RAS/RAF-каскада циклина D1 (ССND1) в 4-9 раз по сравнению с контрольными линиями (нетрансдуцированные HEK293и HEK293, трансдуцированные лентивирусом, кодирующим GFP), что указывает на пригодность созданных нами лентивирусных систем для in vitro моделирования онкогенных эффектов точечных мутаций в белках RAS/RAF –каскада. Интересно, что трансдукция клеток конструктом, кодирующим BRAF дикого типа, также приводила к сравнимому повышению экспрессии CCND1. Данное наблюдение может быть обусловлено эффектом «дозы гена» и согласуются с литературными данными о возможности немутационной активации BRAF за счет низкоуровневой амплификации гена дикого типа в анеуплоидных опухолях. Таким образом, система на основе лентивирусного конструкта, кодирующего BRAF дикого типа, может быть способом in vitro моделирования неклассической активации RAS/RAF-каскада за счет амплификации генов, кодирующих компоненты этого сигнального пути. На основании детального патогистологического анализа >200 случаев опухолей ЩЖ создана панель FFPE-блоков опухолей и сывороток крови 74 пациентов с опухолями щитовидной железы BRAF/RET-PTC и NRAS-ассоциированных гистофенотипов. Включение в панель только случаев с солитарными опухолями позволяет исключить влияние двух и более различных драйверных онкогенных мутаций на репертуар аутоантигенов и спектр аутоантительных специфичностей в каждом конкретном пациенте, а широкий спектр морфологических типов (8 гистологических категорий, включая 15 случаев опухолей новой (с 2016 года) диагностической категории «неинвазивные фолликулярные опухоли с ядерными изменениями по типу папиллярного рака» - non-invasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features, NIFTP) - связывать идентифицированные паттерны аутоантительной реактивности как с различными мутационными событиями в рамках одного гистотипа, так и с разными гистотипами в рамках одного мутационного события. С использованием in silico подхода к идентификации эктопически-экспрессированных забарьерных аутоантигенов, выявлено 7 кандидатных аутоантигенов (CAMK2A, SSX3, TRIM36, SLIT1, PIWIL1, CPEB и FLJ22184), экспрессируемых преимущественно в иммунопривилегированных тканях и вместе с тем сверхэкспрессированных по меньшей мере в одном (но не более чем в двух) из молекулярных классов опухолей ЩЖ более чем в 10 раз по сравнению с нормальной тканью ЩЖ (рисунок 10 дополнительных материалов). Таким образом, за отчетный год созданы экспериментальные системы для in vitro моделирования онкогенных эффектов активации RAS/RAF–каскада и последующего выявления онкоген-индуцированных иммуномных сигнатур в крови пациентов с опухолями щитовидной железы.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Была создана лентивирусная конструкция, кодирующая последовательность химерного белка, включающую 1 экзон гена CCDC6 и 12-20 экзоны гена RET, образующегося при транслокации RET/PTC1. Трансдукция клеток линии фолликулярного эпителия щитовидной железы (ЩЖ) Nthy-ori 3-1 конструкциями, кодирующими мутантные формы BRAF(V600E) и NRAS(Q61R), и химерный белок CCDC6/RET, приводила к достоверному повышению экспрессии мРНК ключевого эффектора RAS/RAF-каскада, циклина D1 (ССND1), по сравнению с контрольными линиями (нетрансдуцированными клетками и клетками, трансдуцированными пустым лентивирусным вектором). Трансдукция клеток конструкцией, кодирующей BRAF дикого типа, также приводила к сравнимому повышению экспрессии CCND1. Система на основе данной лентивирусной конструкции может служить in vitro моделью неклассической активации RAS/RAF-каскада за счет низкоуровневой амплификации гена BRAF дикого типа в анеуплоидных опухолях. Также трансдукция клеток каждой из четырех конструкций, активирующих экспрессию циклина D1, приводила к подавлению экспрессии генов 3'-фосфоаденозин 5'-фосфосульфат синтетазы 2 (PAPSS2) и фибулина 1 (FBLN1), пониженный уровень которых характерен для опухолей ЩЖ с мутациями BRAF(V600E), NRAS(Q61R) и транслокацией RET/PTC1. Эти данные указывают на пригодность созданных нами лентивирусных систем для in vitro моделирования онкогенных эффектов наиболее распространённых драйверных мутаций рака ЩЖ. Для поиска аутоантигенов в протеомах полученных сублиний клеток Nthy-ori 3-1 были отобраны сыворотки 10 здоровых доноров, 10 пациентов с мутацией BRAF (V600E), 5 пациентов с мутацией NRAS(Q61R), 5 пациентов с транслокацией RET/PTC1 и 2 пациентов с транслокацией RET/PTC3 в опухоли ЩЖ. Были выделены рекомбинантные белки CAMK2A, SSX3, TRIM36, PTTG1, отобранные ранее по результатам биоинформатического поиска потенциальных аутоантигенов при раке ЩЖ, и белки OXCT1 и HSD17B10, ранее идентифицированные нами, как потенциальные аутоантигены, при помощи серологического протеомного анализа. Для белков CAMK2A и PTTG1 аутоантительная реактивность выявлялась со сходной частотой в сыворотках здоровых людей и пациентов с раком ЩЖ, что позволяет исключить эти белки из списка кандидатных аутоантигенов. Для белков SSX3 и TRIM36 аутоантительная реактивность выявлялась преимущественно с сыворотками пациентов с инфильтративным папиллярным раком, а для белков OXCT1 и HSD17B10, с сыворотками пациентов с инкапсулированными опухолями рака ЩЖ фолликулярного строения, что позволяет рассматривать антитела к этим белкам в качестве возможных маркеров данных типов рака. По данным серии DIGE-анализов, нами было выявлено 8 точек, воспроизводимо сверхэкспрессированных в клетках линии Nthy-ori 3-1, трансдуцированных лентивирусом, содержащим мутантый ген NRAS(Q61R). Однако ни одна из выявленных точек не демонстрировала иммунореактивности, ассоциированной с наличием данной мутации в опухолях доноров сыворотки. В то же время, при суммарном анализе иммунореактивности протеомов дериватов Nthy-ori 3-1/NRAS(Q61R) и Nthy-ori 3-1/LeGO-iPuro2, нами было выявлено 17 белковых точек, не демонстрирующих сывороточной реактивности в группе условно-здоровых доноров, но демонстрирующих таковую по меньшей мере в 2 различных пациентах с опухолями ЩЖ.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Обнаружено, что активация мутантной формы NRASQ61R в клетках иммортализованной линии нормального фолликулярного эпителия щитовидной железы человека Nthy-ori 3-1 приводит к дерегуляции экспрессии вовлеченных в процесс эпителиально-мезенхимального перехода транскрипционных факторов TWIST2, SNAI2 (SNAIL2) и SNAI1 (SNAIL1); при этом линия Nthy-ori 3-1-NRASQ61R демонстрирует соответствующие изменения экспрессии генов, отвечающих за модуляцию клеточной морфологии и межклеточных контактов, а также ЭМТ-подобные морфологические изменения клеток и повышенную способность к субстрат-независимому росту. Разработана новая методологическая концепция одновременного дифференциально-протеомного и иммунопротеомного анализа в единой экспериментальной системе DISER (разностный электрофорез 2D-DIGE + серологический протеомный анализ SERPA). Полученная система использована для комплексного протеомного анализа в клеточных системах на основе линии Nthy-ori 3-1, стабильно трансдуцированной онкогенами NRASQ61R, BRAFV600E и RET-PTC1. По результатам проведенных исследований идентифицирован ряд кандидатных аутоантительных (PKM, PGK1, CNN3 и FH) и дифференциально-экспрессионных (NAMPT, GLUD1 и GSTO1) биомаркеров опухолей щитовидной железы. С использованием мета-профилирования реактивности идентифицированных аутоантигенов в системах Nthy-ori 3-1/NRASQ61R, Nthy-ori 3-1/BRAFV600E/RET-PTC1 и клеточных линиях рака щитовидной железы K1 и FTC-133 установлены клинико-морфологические ассоциации серологической реактивности выявленных кандидатных аутоантительных биомаркеров. При помощи мета-анализа опубликованных «shotgun»-протеомных экспериментов показано, что экспрессия ранее идентифицированного в системе FTC-133 аутоантигена HSD17B10 значительно повышена у пациентов со злокачественными опухолями RAS-подобного фенотипа по сравнению с фенотипически сходными доброкачественными опухолями и нормальной щитовидной железой. Показано, что аутоантитела против ключевого эффектора RAS/RAF-каскада - циклина D1 (ССND1) встречаются исключительно у пациентов со злокачественными поражениями ЩЖ. Показано, что аутоантитела, распознающие раково-сетчаточный аутоантиген рековерин, являются перспективным биомаркером опухолей щитовидной железы новой диагностической категории – неинвазивных фолликулярных опухолей с ядрами папиллярного типа (NIFTP).