Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение 2016 года основным направлением нашей работы была разработка функциональных экспериментальных моделей, позволяющих воспроизводить in vitro молекулярные и клеточные процессы, протекающие в поврежденном спинном мозге. Для дальнейшей разработки нами были выбраны два типа культур: 1) первичная нейрональная культура, при посадке которой клетки, выделенные из спинного мозга эмбрионов мышей, высеиваются монослоем на соответственно подготовленные стекла и 2) органотипическая культура, при посадке которой, использовались тонкие (до 500 мкм) продольные срезы спинного мозга новорождённых мышей и культивировались на специальных вставках на границе раздела жидкость-воздух. 1. Первичная культура. В ходе отработки методики культивирования клеток спинного мозга в монослое на стеклах Menzel были получены следующие результаты: а) Разработана методика выделения спинного мозга из мышиных эмбрионов в возрасте Е11.5-Е12.5. Подобран состав буфера для выделения и очистки спинного мозга из эмбрионов, а также состав культуральной среды. Подобрано покрытие для стекол, позволяющее культивировать клетки в течение трех недель без образования агрегатов. Показано, что первые отростки у нейрональных клеток появляются уже в первые 24 часа культивирования, а в процессе дальнейшего культивирования происходит формирование разветвленной нейрональной сети. С помощью нейронального маркера Crmp1 показано, что в первую неделю культивирования активно формируются конусы роста. б) Описаны типы клеток, составляющие культуру на разных стадиях ее развития. В частности, показано, что маркер нейронов бета-3-тубулин экспрессируется уже на второй день культивирования клеток. С помощью иммуноцитохимии выявлена разница в экспрессии маркера зрелых астроцитов GFAP в первичной культуре спинного мозга и коры головного мозга мыши. Обнаружено, что в культуре кортикальных нейронов GFAP начинает экспрессироваться раньше, чем в культуре спинальных нейронов, причем в первичной культуре спинного мозга экспрессируется в основном фиброзный тип астроцитов, в то время как в коре головного мозга – протоплазматический. Показано, что в двадцатидневной культуре спинного мозга сохраняются клетки, экспрессирующие нестин. С помощью антител к SMI-32 – специфическому маркёру нейрофиламентов, которые являются наиболее широко представленными структурными белками в моторных нейронах, показано, что в зрелой культуре (более 14 дней культивирования) среди нейронов, экспрессирующих тубулин, около 15+-4% клеток экспрессируют SMI-32, т.е. являются мотонейронами. Количество клеток, экспрессирующих маркер зрелых астроцитов GFAP составляет около 25+-7% от общего количества клеток (Crmp1-положительных клеток + GFAP-положительных клеток). в) Исследована возможность направления роста нейритов в первичной культуре спинного мозга с помощью магнитных наночастиц Fe3O4 с различными модификациями. С помощью сканирующей электронной микроскопии продемонстрировано, что частицы в виде агломератов налипают на тела клеток и отростки. Показано, что помещение трехдневной культуры с магнитными частицами в магнитное поле не приводит к ориентированному (вдоль силовых линий) росту нейритов. По всей видимости, химические сигналы, управляющие ростом отростков на поверхности стекла, доминируют над силой, создаваемой магнитным полем и действующей на частицы, прикрепленные к клеткам. г) Отработана методика нарушения целостности зрелой первичной культуры (более 14 дней культивирования) путем нанесения царапины и исследована возможная индукция белка Agr2 в клетках первичной культуры спинного мозга мышей при повреждении. Продемонстрировано, что через 2-4 дня в зоне повреждения появляются отростки, принадлежащие нейронам, т.к. окрашиваются нейрональным маркером Crmp1 и не окрашиваются маркером астроцитов GFAP. Интенсивная регенерация аксонов в первичной культуре объясняется отсутствием миелина, являющегося одним источников ингибиторов роста аксонов. Показано, что повреждение первичной культуры не приводит к экспресси белка Agr2 ни в нейронах, ни в астроцитах. 2. Органотипическая культура. Первичная культура является удобным объектом исследования, если исследования проводятся с отдельными клетками, однако в организме клетки находятся в ином окружении, нежели в монослое на стекле. В частности, у нервных клеток в первичной культуре нет миелина, для появления которого должна использоваться среда определенного состава, но даже в этом случае возможное время работы с миелинизированными волокнами в первичной культуре сильно ограничено (Thomson et al., 2008). Для того чтобы более точно смоделировать процессы, протекающие в спинном мозге при повреждении, мы разработали органотипическую модель спинного мозга. На первом этапе создания органотипической модели модели была отработана процедура выделения спинного мозга из неонатальных мышей (Р1-Р5) и приготовления продольных срезов из поясничного отдела спинного мозга толщиной 350мкм с помощью чоппера McIlwain. Подобран состав среды для культивирования срезов и отработана процедура нанесения поперечного повреждения срезов после культивирования их на вставках в течение суток. С использованием полученной органотипической культуры (ОТК) спинного мозга были получены следующие результаты: а) Показано, что через 4-6 дней после повреждения срезов в зоне повреждения появляются нейрональные отростки, окрашиваемые нейрональными маркерами бета-3-тубулин либо Crmp1, т.е. происходит спонтанная регенерация. б) Выявлена разница в спонтанной регенерации моторных аксонов в срезах, выделенных из мышей разного возраста. Показано, что в срезах, выделенных из однодневных мышей, в зоне повреждения происходит спонтанная регенерация отростков моторных нейронов, а в срезах из 4-5-дневных мышей спонтанной регенерации нейритов моторных нейронов нет. Вместе с тем, и в однодневных мышах и в 4-5-дневных мышах в зоне повреждения всегда наблюдаются нейриты, окрашенные Crmp1 или бета-3-тубулином. По всей видимости, это нейриты, принадлежащие другим типам нейронов, возможно, комиссуральным. в) Поскольку одной из проблем при регенерации ЦНС является проблема направленного роста аксонов сделана попытка культивирования срезов спинного мозга на ориентированном матриксе из поли-L-лактида с толщиной волокон около 1.7 мкм, изготовленном с помощью технологии наноспининга и покрытом поли-L-лизином (100мкг/мл). Продемонстрирован ориентированный рост моторных аксонов в зоне повреждения на матриксе, однако выживаемость срезов на полилактидных матриксах хуже, чем на коммерческих вставках из политетрафторэтилена. 3. Эксперименты in vivo. Исследована возможная индукция экспрессии белка Agr2 в седалищном нерве мыши после повреждения нерва. Для этого была отработана методика хирургического повреждения нерва (без нарушения целостности миелиновой оболочки), послеоперационого мониторинга экспериментальных животных и отбора проб ткани для гистологического и экспрессионного анализа результатов эксперимента. С помощью ПЦР в реальном времени показано, что РНК Agr2отсутствует в интактном седалищном нерве мыши, а также в интактном спинном мозге, где находятся тела нейронов, у которых аксоны составляют седалищный нерв. Повреждение седалищного нерва осуществлялось пережатием нерва с помощью пинцета в течение 15сек. Выявлено, что через 3-5 дней после повреждения седалищного нерва, не происходит индукции белка Agr2 ни в поврежденном седалищном нерве, ни в спинном мозге оперированной мыши.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Общей задачей данного проекта является исследование молекулярных и клеточных процессов, протекающих в зоне повреждения спинного мозга (СМ), а так же поиск методов управления этими процессами с целью стимуляции регенерации ткани СМ. В отчётном 2017 году основной целью нашей работы была разработка методов стимуляции роста нейритов на основе использования первичной и органотипической нейрональных культур СМ, разработанных в течение 2016 года. На основании серии предварительных экспериментов и анализа имеющихся публикаций в этой области мы остановили свой выбор на четырех способах воздействия на клеточные культуры нейронов и органотипическую модель нейрональной ткани: а) вариации уровня кислорода (гипоксия), б) цитокины нейронального действия, в) ко-культивирование органотипического эквивалента ткани СМ с тканью не нейронального происхождения и г) культивирование клеток и тканевых эквивалентов на полимерных матриксах определённой структуры и свойств. Нами были получены следующие результаты: 1) Чтобы оценить, влияет ли гипоксия на скорость роста нейритов в первичной культуре нейронов спинного мозга мыши, клетки помещали в гипоксическую камеру фирмы OkoLab (1% О2, 6ч или 24ч). Было обнаружено, что ни 6-часовое ни 24-часовое воздействие гипоксии не оказывает влияния на скорость роста нейритов в первичной культуре нейронов спинного мозга. Во всех экспериментах (включая и контрольные) длина нейритов за сутки увеличивалась в среднем в 2 раза. 2) В следующей серии экспериментов, проведенных на первичной культуре нейронов спинного мозга мыши, мы оценивали, как меняется количество нестин-положительных клеток с течением времени в первичной культуре, а также как влияет гипоксия на дифференцировку клеток: не будет ли способствовать гипоксия увеличению доли нейронов в первичной культуре. С помощью методов иммунофлуоресценции мы показали, что в процессе культивирования возрастает количество нестин-положительных клеток: в первую неделю в среднем в 3 раза, а через 2 недели в среднем в 4 раза, по сравнению с двухдневной культурой. Влияние гипоксии на нейрональную дифференцировку оценивалось при помощи окрашивания культуры клеток антителами к белкам бета-3-тубулину и GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) с последующим обсчётом результатов. Таким образом, оценивалось соотношение астроциты:астроциты+нейроны. Было показано, что воздействие гипоксии (1% О2) увеличивает соотношение астроциты:астроциты+нейроны до 2.3 раза, т.е. гипоксическое воздействие способствует увеличению доли астроцитов в первичной культуре (либо путем увеличения пролиферации астроцитов, либо путем дифференцировки астроцитов из клеток-предшественников). Тем не менее, гипоксическое воздействие не приводит к увеличению количества нейронов в культуре, т.е. не способствует дифференцировке нестин-положительных клеток в нейроны. 3) Для выявления возможного опосредованного воздействия гипоксии на рост нейритов (через другие типы клеток, отсутствующие в нейрональной монокультуре) воздействию гипоксии (1% О2, 24 часа) подвергалась органотипическая культура СМ мышей на вставках PTFE. После экспозиции гипоксии, ткань СМ фиксировали и окрашивали антителами к бета-3-тубулину (общий нейрональный маркёр) и SMI-32 (маркер моторных нейронов). Для оценки эффекта гипоксии на рост нейритов подсчитывали количество нейритов проросших из среза относительно длины периметра среза. Влияние гипоксии на интенсивность роста нейритов выявлено не было. Не было также обнаружено изменений в экспрессии ростового фактора BDNF (влияющего на рост нейритов). Таким образом, описанный в литературе положительный эффект гипоксии и стабилизации HIF-1a на восстановление моторных функций после гипоксии у мышей и людей нашими экспериментами in vitro подтверждён не был и может быть связан с синтезом in vivo ростовых факторов клетками, которые отсутствуют в культуре, например, мышечными. 4) При повреждениях различных органов важную роль в регенерации играют цитокины, в частности, онкостатин М (ОСМ). Применение ОСМ после травмы СМ значительно уменьшает размер зоны повреждения и способствует восстановлению моторной функции после повреждения. ОСМ также ускоряет рост нейритов в первичной культуре кортикальных нейронов (Slaets et al., 2014). Известно, что родственный ОСМ фактор интерлейкин-6 также ускоряет рост нейронов ЦНС (Leibinger et al., 2013). Основываясь на этих данных, мы предположили, что ил-6 может стимулировать рост нейритов СМ. Для проверки этого предположения интерлейкин-6 добавляли в ростовую среду первичной (100 мкг/мл) и органотипической (200 мкг/мл) культур нейронов спинного мозга. Согласно полученным результатам, ил-6 не влияет на скорость отрастания нейритов ни в первичной, ни в органотипической культуре нейронов спинного мозга. 5) В следующей части нашей работы в течение 2017 года мы исследовали взаимодействие нервной ткани и эксплантов аорты, а также возможность использования кровеносных сосудов в качестве «проводников» или «направляющих» при восстановлении повреждённого СМ, используя для этого органотипическую культуру нейрональной ткани. Эксперименты проводились при различном взаимном расположении фрагментов аорты и культивируемого СМ эмбрионов мыши. При этом для совместного культивирования использовалась нейрональная среда, без добавления факторов, поддерживающих миграцию эндотелиальных клеток, а само культивирование проводилось на вставках PTFE, а не в колллагеновом геле, который обычно используют для эксплантов аорты. Таким образом, условия культивирования по определению должны были блокировать спраутинг эндотелия. Однако, при определённом взаиморасположении фрагментов СМ и аорты, был выявлен факт роста нейритов в направлении аорты и плотного «прирастания» к ней среза СМ. Также была выявлена активная эмиграция клеток эндотелия из аорты. Очевидно, выявленные эффекты связаны с секрецией ростовых факторов, например, VEGFA и BDNF, способных стимулировать прорастание нейритов из СМ. Выявленный феномен ранее в мировой литературе описан не был. Дальнейшее исследование выявленного влияния энодотелия на рост нейритов и тканевые перестройки в органотипической культуре СМ может послужить основой разработки новых подходов к стимуляции регенерации ткани СМ. 6) Ранее были получены данные, что альгинатные гидрогели поддерживают рост нейритов в нейрональной культуре in vitro (Palazzolo et al.,2015), и способствуют ориентированному прорастанию аксонов после повреждения спиного мозга in vivo (Prang et al., 2006). Для проверки способности жёстких альгинатных матриксов поддерживать нейрональный рост, нами были получены губки из альгината и из альгината с добавлением коллагена I типа и покрытые поли-L-лизином. Хотя полученные матриксы поддерживали пролиферацию дермальных фибробластов и спраутинг из аорт, нейрональные клетки на них погибали (вне зависимости от количества добавленного коллагена). При этом глиальные клетки сохраняли жизнеспособность на альгинатных матриксах (только в зоне белого вещества). Был сделан вывод о том, что альгинатные материалы не подходят для культивирования срезов СМ. В 2017 году нами были также получены двухслойные биоразлагаемые нетканые матриксы на основе сополимера хитозан:желатин:полилактид (52:13:35). Эти матриксы показали полную биосовместимость и способность поддерживать клеточный рост и дифференцировку в процессе биоинженерии различных тканевых эквивалентов. В сравнении с губками (как коллагеновыми, так и альгинатными), нетканый материал показал повышенную устойчивостью к контракции и меньшую эластичность. Учитывая специфические свойства этих матриксов и возможность получения их вариантов с ориентированным расположением волокон, в дальнейшем мы рассчитываем добиться успеха в разработке функциональных тканевых моделей СМ in vitro.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основной задачей проекта в 2018 году было исследование взаимного влияния ткани центральной/периферической нервной системы и крупных сосудов на примере органотипической культуры поврежденного среза спинного мозга (СМ) либо дорсальных ганглиев (ДРГ), культивируемых совместно с фрагментами аорты или полой вены. Для получения органотипической культуры СМ использовались продольные срезы (толщиной 350 мкм) спинного мозга новорождённых мышей. Срезы культивировались на коммерческих PTFE вставках, покрытых полилизином. Повреждения СМ (для оценки процесса его восстановления) наносились скальпелем (поперечный разрез). В зону повреждения помещали фрагмент аорты или полой вены, взятых из тех же мышей, из которых были получены фрагменты СМ. После 7-9 дней культивирования образцы фиксировали и окрашивали антителами к нейрональному маркеру бета3-тубулину (Tuj1) и к маркеру эндотелиальных клеток - CD31. Использование этой экспериментальной модели позволило получить нижеследующие результаты. 1. Влияние нервной ткани центральной и периферической нервной системы на спраутинг аорты в органотипической культуре. 1.1. Направление миграции CD31+ клеток. В 2018 году мы обнаружили, что что эндотелиальные CD31+ клетки, мигрирующие из аорты в зоне повреждения СМ, присутствовали преимущественно в зоне миграции других типов клеток аорты (Рис. 2 А,Б). Очевидно, что большая часть из этих CD31-негативных клеток, способствующих спраутингу эндотелия, является фибробластами. Во-первых, известно, что при культивировании срезов аорты в геле первыми из аорты мигрируют фибробласты и макрофаги (Nicosia, 2009), и, во-вторых, фибробласты секретируют необходимые для ангиогенеза молекулы внеклеточного матрикса и ростовые факторы (Martin et al., 1999; Newman et al., 2011). Эти факты объясняют наличие CD31+ клеток именно в области миграции фибробластов. Особо стоит отметить, что CD31+ клетки мигрировали из аорты только в зону повреждения, свободную от среза СМ и никогда не мигрировали в ткань СМ (Рис. 2А,Б). Таким образом, хотя ткань СМ оказывает стимулирующий эффект на спраутинг, она задаёт негативный вектор направления миграции клеток эндотелия (негативный таксис). 1.2. Влияние ростовых факторов (BDNF, VEGF-A) на спраутинг аорты, культивируемой в зоне повреждения среза СМ. Известно, что про-ангиогенный фактор VEGF-А оказывает значительное влияние на выживаемость, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток. Кроме того, существует мнение, что на эти показатели так же влияют нейротрофические факторы, такие как BDNF и NGF (Kermani and Hempstead, 2007). Использование нашей модели показало, что как BDNF так и VEGF-A (30 нг/мл) не оказывают влияния на интенсивность спраутинга аорты в зоне повреждения СМ. Вместе с тем, VEGF-A, в отличие от BDNF, оказывал значительное положительное влияние на пролиферацию эндотелиальных клеток самого среза СМ (присутствующих в определённом количестве в этой ткани), а также на направление миграции клеток эндотелия аорты (но не на интенсивность этого процесса). Без добавления VEGF-A, в ткани СМ присутствовали только единичные эндотелиальные CD31+ клетки, и далеко не во всех образцах, тогда как в присутствии VEGF-A все срезы СМ были покрыты сетью CD31+ клеток вне зависимости от присутствия фрагментов аорты (Рис. 3Д). Кроме того, в присутствии VEGF-A наблюдалась миграция эндотелиальных клеток аорты в ткань СМ (Рис. 3Е), чего никогда не было отмечено в контрольных экспериментах. Ранее было сделано предположение, что эффекты активности эндогенного VEGF-A в ткани спинного мозга могут блокироваться высоким уровнем экспресси в ней растворимого рецептора к VEGF-A – sFlt1 (Himmels et al., 2017). Мы полагаем, что блокировка миграции эндотелиальных клеток аорты в ткань СМ в наших контрольных экспериментах может быть обусловлена этим же механизмом. Добавление экзогенного VEGF-A может вести к полному связыванию рецептора sFlt1, тогда как избыточный экзогенный VEGF-A оказывает ангиогенный эффект и делает возможным миграцию CD31+ клеток аорты в ткань СМ. 1.3. Культивирование аорты с дорсальными ганглиями. Выявление нами способности ткани центральной нервной системы, а именно ткани СМ, индуцировать спраутинг эндотелия закономерно ставит вопрос о наличие этой способности у ткани периферической нервной системы. Для ответа на этот вопрос фрагмент аорты культивировался между двумя дорсальными ганглиями (ДРГ). В отличие от экспериментов со СМ, наблюдалась миграция CD31+ клеток эндотелия аорты либо в ДРГ, либо в связанный с ним периферический нерв (Рис. 3 Б,В) даже без добавления экзогенного VEGF-A. При этом, так же в отличие от экспериментов со СМ, CD31+ клетки мигрировали исключительно в ткань ганглиев и не были обнаружены рядом с аортой (Рис. 3 Б,Г). Примечательно, что подобный паттерн миграции был характерен не только для CD31+ эндотелиальных клеток, но и для других типов клеток (CD31-), активно мигрирующих из аорты, культивируемой с ДРГ (Рис. 3Г). Это резко контрастировало с присутствием CD31- клеток в зоне повреждения среза СМ (Рис. 2Б). Известно, что в отличие от ткани СМ, ДРГ в постнатальном периоде развития активно экспрессируют целый ряд ростовых факторов (VEGF, BDNF, TGFa - Sondell., 2001; Wetmore and Olsen, 1995; Xian et al., 1999; Grotendorst et al., 1989), что и может быть причиной активной миграции CD31+ клеток в ткань ДРГ даже без добавления экзогенных факторов роста. 2. Влияние крупных сосудов на рост нейритов в органотипической культуре. Известно, что между сосудами и нервами существует тесная взаимосвязь. Так, уничтожив или перенаправив периферические нервы на поздних стадиях эмбриогенеза мыши, можно нарушить дифференицировку эндотелиальных предшественников в клетки артерий и изменить направление роста сосудов (Mukouyama et al., 2002), а после повреждения СМ аксоны нейронов могут расти вдоль вновь образующихся сосудов (Dray et al., 2009). Для экспериментального подтверждения этих наблюдений и оценки возможности использования сосудов в качестве проводника для роста аксонов, в нашем проекте в зону повреждения культивируемого СМ помещались фрагменты аорты или полой вены. Для визуализации процесса роста сосудов ткани окрашивались антителами к Tuj1. 2.1. Использование аорты и полой вены в качестве проводника для роста аксонов спинальных нейронов. При культивировании аорты в зоне повреждения СМ, на поверхности аорты аксоны не наблюдались (Рис. 1А). Поскольку известно, что рост аксонов направляют эндотелиальные клетки (Grasman et al., 2017), мы поместили в зону повреждения СМ раскрытую аорту эндотелием вверх, чтобы открыть доступ аксонам непосредственно к эндотелиальным клеткам. Но и в этом случае роста аксонов непосредственно по аорте или в сторону её эндотелия отмечено не было. Неожиданно, при культивировании в зоне повреждения СМ фрагментов полой вены были получены другие результаты: на её поверхности был выявлен активный рост нейритов (Рис. 1Б). Таким образом, ткань стенки вены, в отличие от артерии, может быть использована в качестве проводника для роста аксонов. Этот феномен и механизмы выявленных различий требуют дальнейшего изучения. 2.2 Использование аорты в качестве проводника для роста аксонов сенсорных нейронов. Чтобы выяснить, могут ли крупные сосуды, в частности, аорта быть проводниками для сенсорных аксонов, аорту культивировали между дорсальными ганглиями. Через 5-7 дней культивирования на аорте наблюдались Tuj1+ нейриты (Рис. 2Д), что хорошо согласуется с известными в литературе данными о тесной связи сосудов и периферических нервов (Mukouyama et al., 2002). Таким образом, нейриты сенсорных и спинальных нейронов по-разному взаимодействуют с аортой: нейриты сенсорных нейронов активно растут по аорте, в то время как нейриты спинальных нейронов – нет (сравнить рис. 1А и 2Г). 3. Оболочки СМ как проводник для роста аксонов СМ. Поскольку из литературных данных известно, что оболочки головного и спинного мозга являются нишей для нестин+ и даблкортин+ клеток, а также синтезируют целый набор ростовых факторов (Franzen et al., 1999; Decimo, 2011), нами была исследована возможность использования оболочки СМ в качестве проводника для роста спинальных нейритов. Мы показали, что оболочка СМ, культивируемая отдельно от срезов СМ содержит много Tuj1+ клеток, однако не содержит SMI-32+ клеток (Рис. 4А,Б). После культивирования оболочки в зоне повреждения СМ на ней наблюдались SMI-32+ нейриты (Рис. 4В,Г), хотя в контрольных экспериментах без оболочки мы не наблюдали моторных нейритов в зоне повреждения среза СМ. Следовательно, оболочка СМ может использоваться в качестве проводника для регенерации моторных нейритов. В целом, в 2018 году были разработаны две модели, позволяющие изучать в системе ex vivo взаимодействие нервной ткани ЦНС/ПНС с крупными сосудами, а также оценить возможность использования сосудов и оболочки СМ в качестве направляющих проводников для роста нейритов. Используя эти модели, была продемонстрирована возможность использования оболочки СМ в качестве проводника для роста моторных нейритов. Также было показано, что нервная ткань и крупные сосуды оказывают влияние друг на друга. С одной стороны, нейриты клеток периферической и центральной нервной системы по-разному взаимодействуют с крупными сосудами: нейриты сенсорных нейронов активно растут по аорте, в то время как нейриты спинальных нейронов не растут по аорте, однако растут по вене. С другой стороны, нервная ткань как центральной, так и периферической нервной системы индуцирует спраутинг аорты, причем направление миграции CD31+ клеток аорты в значительной степени зависит от типа нервной системы, из которой была взята ткань.В присутствии срезов СМ эндотелиальные клетки аорты мигрируют только в область повреждения, свободную от ткани СМ, и не обнаруживаются непосредственно в ткани СМ, в то время как в присутствии ДРГ эндотелиальные CD31+ клетки мигрируют только внутрь ганглиев.