Аннотация результатов, полученных в 2016 году
- Синтезированы полимеризационно-способные сложные эфиры метакриловой и акриловой кислот и полилактида с мол.массой 1,8х104 Dа. Реакцию проводили в среде хлористого метилена при взаимодействии концевых карбоксильных групп ПЛА с моно(мет)акриловым эфиром этиленгликоля (АЭГ, МЭГ) в толуоле в присутствии пара-толуолсульфокислоты при азеотропной отгонке воды. Контроль полноты протекания реакции осуществляли методом гель-фильтрации. - Было осуществлено фотоотверждение непредельных производных полилактида с получением прозрачных эластичных сшитых систем с хорошими механическими характеристиками. - Дополнительными исследованиями было показано, что в процессе фотоотверждения полученных непредельных производных полилактида роль сшивающих агентов, обеспечивающих получение хорошо сшитых систем, играли ди(мет)акрилаты этиленгликоля - побочные продукты, образующиеся при взаимодействии АЭГ или МЭГ с ПЛА за счет диспропорционирования сложных эфиров этиленгликоля. Таким образом, впервые показано, что побочные продукты реакции этерификации карбоксильных групп полилактида моно(мет)акриловыми эфирами гликолей, могут выступать в роли сшивающих агентов при отверждении таких олигомерных производных ПЛА. - Показано также, что наиболее активными в этих процессах являются акрилатные эфиры гликолей. - Осуществлен синтез производных хитозана содержащих непредельные высшие жирные кислоты в условиях воздействия ультразвука и без него. - Показано, что наличие в сшитом модифицированном хитозане групп OH, NH2 и CO-NH делает возможным инкапсулирование различных соединений, способных образовывать с данными группами ионные (протонирование NH2 с образованием NH3+), водородные и донорно-акцепторные (катионы металлов) связи. - Сформированная система, может быть перспективным сорбентом катионов тяжелых металлов из слабокислых водных растворов; анионных красителей и лекарственных препаратов, содержащих ионогенные кислотные (COOH, SO3H) группы. При фотоиндуцированном формировании пленок из синтезированных производных хитозана показано образование трехмерного полимера (сшивкой) под действием фотоинициатора. - Проведены испытания различных хитозановых пленок и лиофилизированных гелей для определения устойчивости их пребывания в культуральной среде, адгезии и роста на них мультипотентных стромальных клеток (МСК) костного мозга кролика. - Показано, что: i) адгезия клеток была успешной не на всех видах пленок; ii) резорбция пленок при трансплантации их фрагментов под капсулу почки мышей через 2 месяца не наблюдалась; iii) биосовместимость разработанных материалов была удовлетворительной, воспаления вокруг трансплантатов не было; iiii) адгезия МСК получена на аллилхитозановых пленках, стерилизованных УФ облучением; iiiii) лиофильно высушенный гель из хитозана продемонстрировал хорошие адгезивные свойства; адгезированные и делящиеся клетки зафиксированы через несколько часов. - Модель полного поперечного разрыва среднего пучка Ахиллова сухожилия отработана. - Прототип тканеинженерной конструкции разработан. - Проведена серия экспериментов с целью проверки адекватности тканеинженерной конструкции конечным задачам проекта. Выращенные in vitro аутологичные мультипотентные стромальные клетки (МСК) костного мозга, помещенные в губку, заполняли дефект сухожилия кролика. - Морфологическое исследование через 4 месяца показало, что у животных, где викриловая туба была заполнена желатиновой губкой с МСК отмечается регенерация сухожильной ткани. Преобладала зрелая соединительная ткань с параллельными коллагеновыми волокнами и новообразованными сосудами. Это свидетельствует, что основной вклад в регенерацию вносят МСК. - Модель повреждения межпозвонковых дисков создана на кроликах с помощью методических подходов проведения нейрохирургических операций. - Морфологическое исследование дефектов через 4 месяца показывает полное разрушение и эвакуацию ПЯ. Крупные участки некроза видны в ФК. регенерация ткани выражена слабо. Видны небольшие очаги фиброгиалинового хряща. Гиалиновый хрящ отсутствует. - Трансфекция стромальных клеток лентивирусом, несущим GFP выполнена совместно с лабораторией молекулярной биотехнологии ФНИЦ им. Н.Ф.Гамалеи Минздрава России. Трансфецирование МСК проводилось с целью последующего их выявления в пористых биорезорбируемых матрицах. Показано, что МСК успешно подвергаются трансфекции. Однако. в культурах, наряду с клетками, содержащими ген зеленого белка, присутствовали клетки, не подвергшиеся трансфекции.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
- использован новый подход к модификации хитозана (ХТЗ) и его лактидных графт-сополимеров производными (мет)акриловой кислоты и природными монокарбоновыми ненасыщенными высшими жирными кислотами или их триглицеридами (растительными маслами) в процессе разработки новых биодеградируемых матриксов с требуемыми характеристиками на основе хитозана. - получены ацильные производные (сложные эфиры) хитозана с реакционно-способной двойной связью. Синтез осуществляли путем ацилирования гидроксильных групп в гликозидных кольцах взаимодействием с непредельными кислотами (мет)акриловой, кротоновой и олеиновой), а также с соответствующими (хлор)ангидридами и ангидридами. - определен оптимальный метод модификации хитозана и целевой степени ацилирования. - изучена реакционная способность введённых в хитозан кислотных групп, определен выход модифицированного хитозана с помощью его фотосополимеризации с диакрилатным (или диолеатным) олигомером ФЭА (ФЭА - продукт взаимодействия акриловой или олеиновой кислоты с этоксилатом дифенилолпропана) в соотношении 1:1(масс.) Выход ХТЗ, модифицированного акриловой кислотой составил 72%, олеиновой ~20%. - установлены основные физико-химические характеристики модифицированного ХТЗ путем сравнительного исследования реакционной способности двойной связи в полученных гидрофобизованных производных ХТЗ в зависимости от длины углеводородного радикала в реакциях фотополимеризации. - оценена полнота протекания реакции полимеризации модифицированного ХТЗ с помощью гель-проникающей хроматографии, оценена глубина протекания реакции взаимодействия ХТЗ с акриловым (олеиновым) эфиром этиленгликоля и фотоотверждения получаемых олигомерных производных хитозана с помощью термогравиметрического исследования модифицированных олигомерных и сшитых образцов. - показано, что олигомерные производные ХТЗ менее термостойки, чем исходный полисахарид. - наблюдалось существенное замедление скорости потери массы и увеличение коксового остатка для сшитых систем на основе акриловой кислоты, что свидетельствует об образовании после фотоотверждения в системе ХТЗ-полиакриловая кислота (ПАК) плотной сетчатой структуры. Следует отметить, что в случае ХТЗ, модифицированного олеиновой кислотой, в результате фотоотверждения образующаяся сетчатая структура не была плотная как в случае ХТЗ-ПАК, поскольку образующийся при термоокислительной деструкции (ТОД) сшитой системы ХТЗ-ПАК коксовый остаток (22%) более, чем в полтора раза превышал содержание коксового остатка системы ХТЗ (олеиновая кислота с системой хитозан-олеиновая кислоты (~15%). - сформированы трехмерные матриксы с использованием метода однофотонной лазерной стереолитографии, а также силовой матричной сборки ультрафиолетовых диодов с длинной волны 365нм (Epileds). - подобраны параметры фотосшивания (доза излучения, скорость и частота прохода лазера), методики приготовления фоточувствительных композиций и отмывки структурированных матриксов. - показано, что в случае немодифицированного полилактида также происходит формирование фотосшитых матриксов, при этом требуется гораздо более длительное время для их структурирования, чем в случае модифицированного фоточувствительного полимера. - показано методом наноиндентометрии, что матриксы из немодифицированного материала обладают самыми низкими прочностными характеристиками: их модуль упругости оказался в 3,5 раза меньше, чем у матриксов из модифицированного фоточувствительного полимера – 17,1±5,8 и 60,9±26,9 МПа соответственно. Для лазерно-структурированных матриксов было получено промежуточное значение модуля упругости - 34,9±14,8 Мпа. - использовали мультипотентные стромальные клетки (МСК), полученные от человека и кролика для оценки разработанных матриксов с целью их последующего использования в клинике. - получены штаммы МСК костного мозга человека и кролика для сравнительных экспериментов с вновь синтезированными матриксами с целью отбора тех из них, которые способны наиболее успешно воспринимать помещенные в них МСК, а также способствовать последующему размножению и дифференцировке МСК в те виды тканей, куда они помещены в составе тканеинженерных конструкций (ТИК). - исследованы методы обработки костного мозга: энзиматический и механический для оценки возможности увеличения числа выделенных из костного мозга МСК с целью получения на ранних пассажах культивирования достаточного числа клеток для обратной трансплантации. Длительное культивирование МСК in vitro (2 -3 месяца) может вызывать нарушения в хромосомном наборе, присущем нормальным клеткам. Показано, что энзиматический метод обработки костного мозга в 5-10.раз увеличивает выделение этих клеток из костного мозга. Это позволяет нарастить достаточное количество клеток в более короткие сроки. - получены также «ослабленные» штаммы МСК, выращенные при ограничении питательных веществ и ростовых факторов в среде культивирования. Это вызвано необходимостью изучения адгезивных, пролиферативных и дифференцировочных потенций таких клеток после их извлечения из стволовой ниши костного мозга, в которой они находились, и эксплантации в культуру ткани. Указанные манипуляции с клетками могут ухудшать некоторые из указанных выше свойств МСК вплоть до потери функциональных способностей. Показано, что пролиферативная активность «ослабленных» МСК снижена в три раза. - создание ТИК предполагает совершенно равноправное взаимодействие клеточного и материаловедческого компонентов. Более 90% ТИК используют в качестве клеточной составляющей МСК, независимо от того какую ткань предполагают восстанавливать – кожу, кость или связки. В тоже время требования к материалам, которые используются в качестве клеточного каркаса постоянно меняются. Если раньше предполагалось, что он должен обладать лишь биосовместимостью и биобезопастностью, то сейчас они значительно расширились и стали жестче. Он должен не только способствовать пролиферации и дифференцировке помещенных в него клеток, но и вступать с специфическое взаимодействие с окружающей его тканью, обладать определенной динамикой биорезорбции и т. д. Именно эти обстоятельства требуют особо пристального внимания к новым синтезируемым носителям. Одним из основных требований является успешная адгезия импрегнированных клеток, и их последующие рост и развитие. Проведенные исследования показали, хорошую и почти равную способность адгезировать клетки для четырех вновь синтезированных скаффолдов на основе армированной гибридной губки, а также хитозана- лиофильно высушенного геля. Это относится к обоим видам используемых клеток – МСК человека и кролика. Рост клеток в этих носителях позволяет оценивать их как успешные для создания ТИК. - «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности вращающегося сосуда и периодически омывается питательной средой. Число клеток, вырастающих на поверхности флакона в роллерной установке почти в 10 раз больше, чем в большом культуральном матрасе. В наших исследованиях было решено апробировать данный метод для более успешного обращивания скаффолдов с помещенными в него клетками, что позволило бы получить дополнительные данные о его свойствах, позволяющих охарактеризовать данный матрикс и оценить степень продуктивности в составе тканеинженерной конструкции. Несмотря на то, что в наших экспериментах роллерные культуры использовались не для обращивания поверхности флаконов, а для культивирования клеток в трехмерной структуре, полученные данные действительно подтвердили наши предположения о возможном более активном росте клеток. Если рост клеток в объеме скаффолда при статичном культивировании в плейтах превысил значения первичной адгезии (4.1х104 клеток) в два с половиной раза -10.6х104, то в роллерных культурах увеличение численности выросших клеток было превышено более семи и составляло 29.0х104 раз. Использование метода роллерного культивирования МСК помещенных в скаффолд позволит оптимизировать условия созданной конструкции и сократить время достижения желаемого результата, т.е. гистотипического восстановления поврежденных органов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Осуществлен поиск экологобезопасных способов ацилирования хитозана смесями тригицеридов ненасыщенных высших жирных кислот (растительными маслами). Показана максимальная эффективность непосредственного взаимодействия хитозана с данными триглицеридами при 140150С в инертной атмосфере. Модифицированный подобным образом хитозан в виде мелкодисперсного порошка не растворим в разбавленных водных растворах одноосновных кислот, а только набухает в них, что может быть связано с сильной гидрофобизацией макромолекул и уменьшением количества свободных аминогрупп по причине их ацилирования. 2. В ИХФ РАН был проведен синтез сложных эфиров хитозана и (мет)акриловой кислот путем этерефикации первичных гидроксильных групп в гликозидных циклах полисахарида. В результате проведенной реакции получены производные хитозана с реакционно-способной двойной связью. Реакцию ацилирования впервые проводили применили в среде сверхкритического диоксида углерода (ск-СО2) с добавлением воды в качестве сорастворителя. Модифицированные хитозаны обладают повышенной по сравнению с хитозаном гидрофобностью и могут взаимодействовать с модифицированным полилактидом. Это позволит создать биосовместимый материал для получения матриксов с хорошей адгезией к клеточным культурам. 3. Получены образцы производных полилактида, содержащих (мет)акриловые группы для последующего получения сополимеров при взаимодействии с модифицированным хитозаном. (Мет)акрилированный полилактид получали по реакции уретанообразования в среде хлористого метилена. Оказалось, что при использовании избытка моно(мет)акрилата этиленгликоля и изофорондиизоцианата, выход модифицированного полилактида увеличивается с 20 до 90%. 4. Сополимеры хитозана и полилактида (ХТЗ-ПЛА) получали через реакцию этерификации карбоксильных группировок (мет)акрилированного полилактида, модифицированным хитозаном. Этерификацию концевых карбоксильных групп полилактида проводили по методу равновесной конденсации с использованием моно(мет)акрилата этиленгликоля в толуоле в присутствии п-толуолсульфокислоты в качестве катализатора. Для оценки реакционной способности полученных сополимеров проводили реакцию фотополимеризации модифицированного сополимера ХТЗ-ПЛА. 5. Образцы сшитого сополимера ХТЗ-ПЛА представляли собой гибкие прозрачные пленки. Показано, что сополимеры ХТЗ-ПЛА менее термостойки, чем исходный полисахарид. В то же время для сшитых сополимерных систем наблюдалось существенное замедление скорости потери массы и увеличение коксового остатка, что свидетельствует об образовании после фотоотверждения в системе ХТЗ-ПЛА плотной сетчатой структуры. 6. На установке лазерной стереолитографии на основе синтезированных полимеров структурированы трехмерные матрицы в широком диапазоне параметров работы лазерной системы. Подбор параметров осуществляли при скорости лазера от 1 до 5 мм/с, мощности лазера от 50 до 70 мВт, расстояние между проходами луча меняли от 200 до 250 мкм. Разработанная экспериментальная система и подобранные параметры лазерного воздействия позволили избежать перегрев облучаемого материала и сохранить гибкость матрикса, которая свойственна исходному коллагеновому матриксу. Данные СЭМ-микроскопии показали, что пористость исходного матрикса сохранилась после облучения, при этом повысилась стабильность трехмерной структуры при ее нахождении в фосфатно-солевом буфере. 7. Определены локальные механические характеристики сформированных трехмерных структур методом наноиндентирования. Показано, что сформированная матрица обладает анизотропными механическими свойствами: лазерное структурирование привело к 7-кратному увеличению модуля Юнга в сравнении с необработанным материалом. 8. Сформированы волокнистые структуры методом электроспиннинга на установке NANON – 01A, оснащенной стандартной фильерой и барабанным коллектором шириной 100 мм из 15 % масс. раствора капролактона (Sigma-Aldrich) в 1,2-дихлорэтане. Диаметр структурного волокна 10мкм и 150мкм, толщина пластины составляла 1,5мм. 9. Показано, что клетки способны прикрепляться и пролиферировать на созданных матриксах всех типов: капролактоне с разными диаметрами структурного волокна, сколлапсированном и несколапсированном гидрогеле хитозана, армированном коллагене. 10. Все созданные матриксы не цитотоксичны. Наиболее успешными для заселения МСК являлись капролактоны, промежуточное положение занимает армированный коллаген, а наименее подходящими для длительного культивирования клеток являются хитозаны. 11. При трансплантации исследуемых матриксов под капсулу почки, признаков воспаления окружающей ткани не наблюдается. Через месяц после трансплантации объем и форма капролактонов и армированного коллагена оставалась неизменной, а разные виды хитозана уменьшались в объеме от 25% до 35%. 12. Материалы, из которых изготовлены матриксы биологически инертны и могут быть использованы in vivo. 13. Разработанные матриксы обеспечивают адгезию и направленную пролиферацию МСК и могут быть использованы при создании ТИК. 14. Проведена трансплантация ТИК, состоящих их созданных матриксов импрегнированных аутологичными МСК в дефекты ахиллова сухожилия и межпозвоночных дисков (МПД). 15. Проведено гистологическое изучение тканей ахиллова сухожилия и МПД после трансплантации разработанных ТИК. Через 6 месяцев происходит полная регенерация сухожильной ткани. Через 4 месяца в МПД наблюдается развитие регенерационных процессов в пульпозном ядре и фиброзном кольце. 16. По результатам биомеханических испытаний через 8 месяцев после трансплантации, прочность образцов восстановленной ткани среднего пучка ахиллова сухожилия сравнима с интактными сухожилиями. 17. Методы клеточных технологий и созданные ТИК могут быть рекомендованы к использованию в клинике травматологии и ортопедии и спинальной хирургии для восстановления разрывов ахиллова сухожилия и восстановления целостности тканей МПД.