Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Серией последовательных изменений генома плодовой мушки Drosophila melanogaster были созданы линии для визуализации взаимодействия энхансера iab5 с промоторной областью гена Abd-B, отвечающего за формирование задних абдоминальных сегментов эмбриона и принимающего участие в сигнальных путях, определяющих пол. Методом CRISPR был внедрен attp элемент в 5' нетранслируемую область гена Abd-B, затем с помощью attp-attB рекомбинации были введены 24 копии MS2 последовательности. При транскрипции мРНК MS2 образует структуры по типу шпилек, связывающиеся с белком MCP, слитым с GFP, в результате чего можно детектируется флуоресценция на активном гене. Для изучения зависимости образования петли в хроматине между энхансером и промотором последовательность iab5 была инвертирована методом CRISPR. Далее также были введены parS последовательности, взаимодействующие с parB белком, слитым с флуоресцентным белком mCherry и CFP. Использованы 2 различных варианта parS – intA и intB для визуализации двух различных локусов хроматина одновременно. ParB белок связывается с ДНК последовательностью parS, что дает возможность визуализировать расположение двух участков хроматина относительно друг друга вне зависимости от транскрипции. Планируется изучить динамику перемещения двух участков хроматина, меченых в области энхансера и промотора, относительно друг друга и оценить влияние дистанции между ними на уровень экспрессии гена. Кроме того, важно сравнить поведение системы при инвертированной ориентации последовательности iab5, что даст возможность понять механизм сближения участков хроматина и форму петли. Были проведены эксперименты по иммуноокрашиванию и флуоресцентной in situ гибридизации эмбрионов дрозофилы на стадии от 0 до 16 часов после оплодотворения для определения паттерна распределения белка, продукта гена Abd-B, и его мРНК. Выявлены некоторые различия в распределении мРНК у меченых MS2 эмбрионов мух от эмбрионов с нормальным фенотипом. Так как встраивание MS2 приводит к нарушению трансляции образуемых мРНК этого гена, то очевидно, что мутантные эмбрионы являются гетерозиготными по гену Abd-B и вследствие этого возможно некоторое нарушение в правильном распределении мРНК в эмбрионах. Однако образуемый паттерн локализации белка не имеет отличий от нормального фенотипа и эмбрион развивается по обычному сценарию. Проведены первичные эксперименты по визуализации транскрипции гена Abd-B в динамике в развивающемся эмбрионе (прижизненное наблюдение). Так как активная экспрессия гена начинается приблизительно через 260 минут после оплодотворения, в эмбрионе присутствует большое количество клеток, что создает шум, который необходимо убрать при анализе данных. В настоящий момент происходит измерение динамики транскрипции для накопления статистически достоверного материала, обработка данных и подготовка линий мух для визуализации энхансер-промоторных взаимодействий (необходимо первоначально оценить уровень транскрипции). Работа осуществлялась совместно с лабораторией физики жизни под руководством Томаса Грегора в Принстонском университете, США.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1) Показана применимость метода конфокальной микроскопии, а также подобраны флуоресцентные метки и разработан метод мечения геномных локусов для визуализации дальних взаимодействий в эмбрионе дрозофилы. 2) Метод визуализации применен к искусственной системе, содержащей пару инсуляторов Homie-Nhomie. Изучена зависимость частоты взаимодействий инсуляторов от расстояния между ними. Показано, что активация репортерного гена происходит при физическом контакте его промотора с энхансером. Показано, что расстояние между энхансером и репортерным геном влияет на частоту активации гена, но не на длительность единичного импульса активности гена. 3) Созданы улучшенные версии последовательностей parS, используемых для мечения ДНК-локусов. Усовершенствован алгоритм отслеживания и обработки данных отслеживания траекторий флуоресцентных точек при микросъемке. 4) Получены линии мух, несущие метки в генах sxl и Abd-B и соответствующих регуляторных элементах для последующей визуализации активации эндогенных локусов. Для гена sxl рассчитаны кинетические коэффициенты перехода между транскрипционно активным и неактивным состояниями. 5) Произведено функциональное исследование регуляторной области гена Ubx. Исследованы функции вариабельного сайта связывания CTCF и PRE-элемента в активации гена. Показано существование множественных сайтов связывания белкового комплекса LBC в локусе Bithorax и выяснена его важность для формирования дальних контактов. 6) Показано привлечение белка CLAMP на границы Fab-7 и Fab-8 генного комплекса Bithorax, привлечение происходит совместно с белком GAF. Выяснено, что CLAMP входит в состав белкового комплекса LBC, проведено уточнение размера последнего.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1) Получены линии мух с меченым локусом Sxl. Визуализирован процесс транскрипции гена у самцов и самок, детектированы половые различия транскрипции. 2) Найдены отличия транскрипции гена Sxl с двух альтернативных промоторов. 3) Проведен функциональный анализ границы Fub-2 генного комплекса биторакс. Показано существование автономных доменов хроматина, разделенных Fub-2. 4) Обнаружена инсуляторная активность элемента bxd PRE, показана новая функция элемента bxPRE. 5) Показано связывание белкового комплекса LBC с геномными элементами PRE генов engrailed, even-skipped и энхансера iab-7 из генного комплекса bithorax. Связывание зависит от фактора GAF. 6) Обнаружено участие LBC в энхансер-энхансерных и энхансер-промоторных взаимодействиях в локусах генов brk, sna и scr.