КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-14-10346

НазваниеИзучение дальних взаимодействий в геноме методом микроскопии сверхвысокого разрешения

РуководительШидловский Юлий Валерьевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2016 - 2018 

КонкурсКонкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словадальние взаимодействия, энхансер, промотор, регуляция экспрессии генов, дрозофила, эмбриогенез

Код ГРНТИ34.15.25


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Знание механизмов регуляции экспрессии генов эукариот дает ключ к их управлению, следовательно, может найти широкое применение в различных сферах от биотехнологии до генной терапии. Геном эукариот может содержать сотни тысяч и более энхансеров, последовательностей, взаимодействующих с промоторной областью их генов-мишеней и способствующих активной экспрессии. Кроме того, в геноме присутствуют регуляторные последовательности, которые блокируют активность, такие как инсуляторы и сайленсеры. Данные последовательности могут находиться на большом расстоянии от мишени (тысячи и миллионы пар нуклеотидов), подобные взаимодействия получили название «дальние взаимодействия». Дальние взаимодействия в геноме изучаются методами, которые усредняют параметры данных, что не дает возможность оценить динамику процесса взаимодействия. Мы полагаем, что архитектура хроматина и ее пространственно-временные изменения имеют влияние на транскрипционную активность тех или иных генов, сближая и удаляя определенные участки друг от друга. Целью проекта является количественная оценка влияния динамики изменения архитектуры хроматина на работу генома и в частности зависимость дальних взаимодействий от расположения взаимодействующих участков в пространстве и влияние их на транскрипционную активность. В качестве модельного объекта исследования выбраны ранние эмбрионы дрозофил. Взаимодействие регуляторных элементов, таких как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы с промоторной областью гена-мишени и друг с другом будет исследоваться с помощью флуоресцентной микроскопии сверх-высокого разрешения, которая позволит оценить пространственно-временные характеристики. Для визуализации регуляторных последовательностей и их локусов-мишеней, а также уровня транскрипционной активности методами молекулярного клонирования будут созданы генетические конструкции с репортерными системами, включающими флуоресцентные белки. Механизм дальних взаимодействий будет изучен на модели взаимодействий энхансеров IAB5 и T1 с промоторами генов развития дрозофил AbdB и Scr, определяющих сегментацию и правильную дифференцировку эмбриона. Кроме того, будут исследованы локусы ftz, eve, snail shadow, а также инсуляторы Nhomie и Homie. Полученные результаты дадут представление о том, каким образом осуществляются дальние взаимодействия, как энхансер распознает промотор, с которым он должен взаимодействовать, каким образом происходит переключение энхансеров, участие «теневых» («shadow») энхансеров в регуляции экспрессии генов, как это влияет на скорость транскрипции, механизмы инсуляторной активности. Результаты позволят внести вклад в развитие проекта 4D нуклеом. Проект планируется выполнять в рамках имеющегося сотрудничества с Университетом Принстон, США.

Ожидаемые результаты
Применение биохимических и генетических методов, наряду с микроскопией сверх-высокого разрешения позволит изучить тонкие механизмы регуляции экспрессии генов эукариот. Предложен принципиально новый подход к изучению геномных процессов и в частности для исследования дальних взаимодействий – флуоресцентная микроскопия сверх-высокого разрешения, позволяющая осуществлять визуализацию объекта в динамике. Впервые будет определено изменение уровня экспрессии генов при их взаимодействии с регуляторными элементами во времени и при этом в различных ядрах эмбриона одновременно. После расшифровки генома, изучение регуляции его работы стало наиболее важной задачей для молекулярных биологов. Результаты исследований могут быть использованы для развития области генной и клеточной медицины, биотехнологии, фармакологии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Серией последовательных изменений генома плодовой мушки Drosophila melanogaster были созданы линии для визуализации взаимодействия энхансера iab5 с промоторной областью гена Abd-B, отвечающего за формирование задних абдоминальных сегментов эмбриона и принимающего участие в сигнальных путях, определяющих пол. Методом CRISPR был внедрен attp элемент в 5' нетранслируемую область гена Abd-B, затем с помощью attp-attB рекомбинации были введены 24 копии MS2 последовательности. При транскрипции мРНК MS2 образует структуры по типу шпилек, связывающиеся с белком MCP, слитым с GFP, в результате чего можно детектируется флуоресценция на активном гене. Для изучения зависимости образования петли в хроматине между энхансером и промотором последовательность iab5 была инвертирована методом CRISPR. Далее также были введены parS последовательности, взаимодействующие с parB белком, слитым с флуоресцентным белком mCherry и CFP. Использованы 2 различных варианта parS – intA и intB для визуализации двух различных локусов хроматина одновременно. ParB белок связывается с ДНК последовательностью parS, что дает возможность визуализировать расположение двух участков хроматина относительно друг друга вне зависимости от транскрипции. Планируется изучить динамику перемещения двух участков хроматина, меченых в области энхансера и промотора, относительно друг друга и оценить влияние дистанции между ними на уровень экспрессии гена. Кроме того, важно сравнить поведение системы при инвертированной ориентации последовательности iab5, что даст возможность понять механизм сближения участков хроматина и форму петли. Были проведены эксперименты по иммуноокрашиванию и флуоресцентной in situ гибридизации эмбрионов дрозофилы на стадии от 0 до 16 часов после оплодотворения для определения паттерна распределения белка, продукта гена Abd-B, и его мРНК. Выявлены некоторые различия в распределении мРНК у меченых MS2 эмбрионов мух от эмбрионов с нормальным фенотипом. Так как встраивание MS2 приводит к нарушению трансляции образуемых мРНК этого гена, то очевидно, что мутантные эмбрионы являются гетерозиготными по гену Abd-B и вследствие этого возможно некоторое нарушение в правильном распределении мРНК в эмбрионах. Однако образуемый паттерн локализации белка не имеет отличий от нормального фенотипа и эмбрион развивается по обычному сценарию. Проведены первичные эксперименты по визуализации транскрипции гена Abd-B в динамике в развивающемся эмбрионе (прижизненное наблюдение). Так как активная экспрессия гена начинается приблизительно через 260 минут после оплодотворения, в эмбрионе присутствует большое количество клеток, что создает шум, который необходимо убрать при анализе данных. В настоящий момент происходит измерение динамики транскрипции для накопления статистически достоверного материала, обработка данных и подготовка линий мух для визуализации энхансер-промоторных взаимодействий (необходимо первоначально оценить уровень транскрипции). Работа осуществлялась совместно с лабораторией физики жизни под руководством Томаса Грегора в Принстонском университете, США.

 

Публикации

1. - Доклады на Всероссийском Фестивале Науки Youtube, указаны в п. 1.10. (год публикации - ).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1) Показана применимость метода конфокальной микроскопии, а также подобраны флуоресцентные метки и разработан метод мечения геномных локусов для визуализации дальних взаимодействий в эмбрионе дрозофилы. 2) Метод визуализации применен к искусственной системе, содержащей пару инсуляторов Homie-Nhomie. Изучена зависимость частоты взаимодействий инсуляторов от расстояния между ними. Показано, что активация репортерного гена происходит при физическом контакте его промотора с энхансером. Показано, что расстояние между энхансером и репортерным геном влияет на частоту активации гена, но не на длительность единичного импульса активности гена. 3) Созданы улучшенные версии последовательностей parS, используемых для мечения ДНК-локусов. Усовершенствован алгоритм отслеживания и обработки данных отслеживания траекторий флуоресцентных точек при микросъемке. 4) Получены линии мух, несущие метки в генах sxl и Abd-B и соответствующих регуляторных элементах для последующей визуализации активации эндогенных локусов. Для гена sxl рассчитаны кинетические коэффициенты перехода между транскрипционно активным и неактивным состояниями. 5) Произведено функциональное исследование регуляторной области гена Ubx. Исследованы функции вариабельного сайта связывания CTCF и PRE-элемента в активации гена. Показано существование множественных сайтов связывания белкового комплекса LBC в локусе Bithorax и выяснена его важность для формирования дальних контактов. 6) Показано привлечение белка CLAMP на границы Fab-7 и Fab-8 генного комплекса Bithorax, привлечение происходит совместно с белком GAF. Выяснено, что CLAMP входит в состав белкового комплекса LBC, проведено уточнение размера последнего.

 

Публикации

1. E.G. Kaye, A.Kurbidaeva, D. Wolle, T. Aoki, P. Schedl, E. Larshan Drosophila Dosage Compensation Loci Associate with a Boundary-Forming Insulator Complex Molecular and Cellular Biology, 2017 Oct 13;37(21). pii: e00253-17 (год публикации - 2017).

2. Путляев Е.В., Ибрагимов А.Н., Лебедева Л.А., Георгиев П.Г., Шидловский Ю.В., Структура и функции комплекса Медиатор Биохимия, - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1) Получены линии мух с меченым локусом Sxl. Визуализирован процесс транскрипции гена у самцов и самок, детектированы половые различия транскрипции. 2) Найдены отличия транскрипции гена Sxl с двух альтернативных промоторов. 3) Проведен функциональный анализ границы Fub-2 генного комплекса биторакс. Показано существование автономных доменов хроматина, разделенных Fub-2. 4) Обнаружена инсуляторная активность элемента bxd PRE, показана новая функция элемента bxPRE. 5) Показано связывание белкового комплекса LBC с геномными элементами PRE генов engrailed, even-skipped и энхансера iab-7 из генного комплекса bithorax. Связывание зависит от фактора GAF. 6) Обнаружено участие LBC в энхансер-энхансерных и энхансер-промоторных взаимодействиях в локусах генов brk, sna и scr.

 

Публикации

1. Джастин Барр, София Харания, Рудольф Гильмутдинов, Константин Яковлев, Юлий Шидловский, Пол Шедл The CPEB translational regulator, Orb, functions together with Par proteins to polarize the Drosophila oocyte PLoS Genetics, 15(3): e1008012 (год публикации - 2019).

2. Ибрагимов А.Н., Кырчанова О.В., Шидловский Ю.В., Георгиев П.Г., Шедл П. Study of boundaries of Ultrabithorax gene regulatory domains. FEBS openbio, Volume 8, Supplement 1, p. 99 (год публикации - 2018).

3. Качаев З.М., Лебедева Л.А., Шапошников А.В., Мореско Д.Д., Йейтс Д., Шедл П., Шидловский Ю.В. Paip2 cooperates with Cbp80 at an active promoter and participates in RNA Polymerase II phosphorylation in Drosophila FEBS Letters, - (год публикации - 2019).

4. Курбидаева А.С., Шидловский Ю.В., Шедл П. Multiple roles for insulator complex LBC in regulating chromosome architecture in Drosophila. FEBS openbio, Volume 8, Supplement 1, p. 134 (год публикации - 2018).

5. Лебедева Л.А., Яковлев К.В., Козлов Е.Н., Шедл П., Дешпанд Г., Шидловский Ю.В. Transcriptional quiescence in primordial germ cells Critical Reviews In Biochemistry & Molecular Biology, 3:1-17 (год публикации - 2018).

6. Путляев Е.В., Анисович К.В., Шидловский Ю.В., Шедл П. In vivo visualization of chromatin interactions in an ecdysone-dependent locus of D. melanogaster. FEBS openbio, Volume 8, Supplement 1, p. 140 (год публикации - 2018).


Возможность практического использования результатов
нет