Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Протеолитические ферменты, участвующие в осуществлении программированной клеточной смерти (ПКС) у животных и растений, обладают исключительно высокой избирательностью и довольно необычной специфичностью гидролиза своих белковых субстратов. Так, каспазы, цистеиновые протеазы животных, участвующие в апоптозе, вносят единичные разрывы в молекулы ограниченного числа клеточных белков после остатка аспарагиновой кислоты, находящегося в определенном контексте. У растений нет каспаз, но их роль могут играть открытые нами протеазы – фитаспазы (растительные аспартат-специфичные протеазы). Фитаспазы важны для осуществления ПКС у растений, вызванной биотическими и абиотическими стрессами, и обладают сходной с каспазами субстратной специфичностью и высокой избирательностью. При этом фитаспазы по своей структуре совершенно не похожи на каспазы и являются сериновыми субтилизин-подобными протеазами. Высокая избирательность «убивающих» протеаз порождает проблему для исследователей: белков-мишеней этих ферментов мало, и найти их трудно. Недавно мы установили, что фитаспаза растения Arabidopsis thaliana способна гидролизовать in vitro транскрипционный фактор ABI3 – один из центральных регуляторов сигнального пути у растений, индуцируемого фитогормоном абсцизовой кислотой. Абсцизовая кислота отвечает за адаптацию и выживание растений в условиях разнообразных стрессов. Учитывая важность данного сигнального пути, мы хотим выяснить, происходит ли фрагментация транскрипционного фактора ABI3 фитаспазой in vivo, когда и как она происходит, и в чем может заключаться смысл такого процессинга. Поиск ответа на эти вопросы является 1-м направлением наших исследований. Помимо растительных (гомологичных) белков-мишеней, фитаспаза, попадая в организм человека и животных в составе растительной пищи, может иметь возможность гидролизовать белки животных (гетерологичные белки-мишени). Недавно мы показали, что фитаспаза способна in vitro гидролизовать и инактивировать пептидные гормоны человека гастрин и холецистокинин. Инактивация избыточного уровня этих пептидных гормонов востребована при многих патологических состояниях человека. Поэтому мы хотим выяснить, способна ли фитаспаза, поступающая с пищей, гидролизовать эти пептидные гормоны в организме животных и таким образом регулировать их активность. Это является 2-м направлением исследований настоящего проекта. В течение первого года выполнения проекта при исследовании фрагментации транскрипционного фактора ABI3 мы показали, что: - белок ABI3 процессируется фитаспазой не только in vitro, но и в растениях A. thaliana; - гидролиз белка ABI3 фитаспазой не является конститутивным. В созревающих семенах накапливается непроцессированный белок ABI3. Однако при внешних воздействиях (стратификация, стимулирующая прорастание) и формировании проростков растений арабидопсиса дикого типа наблюдается практически полный процессинг белка ABI3 фитаспазой; - об участии фитаспазы в этом процессе свидетельствует тот факт, что в растениях с инактивированным геном фитаспазы транскрипционный фактор ABI3 сохраняет интактность; - получены трансгенные растения A. thaliana, содержащие ген белка EGFP-ABI3, которые будут использованы для исследования фрагментации и локализации белка ABI3. Мы считаем, что обнаружение стадии развития растений и воздействий, запускающих процессинг транскрипционного фактора ABI3 фитаспазой, является нашим главным достижением. Нам удалось найти удобную экспериментальную модель, которую можно будет использовать во всех дальнейших исследованиях. По 2-му направлению, связанному с исследованием возможности протеолиза пептидных пищеварительных гормонов человека и животных фитаспазами, целью работ этапа 2016 г. было выявление видов растений с повышенной активностью этого фермента и характеристика фитаспаз таких растений. Проанализировав примерно 50 видов съедобных растений, мы показали, что: - уровень активности фитаспазы у растений разных видов может отличаться в десятки и сотни раз. Чемпионами по уровню активности фитаспазы являются: из «зелени» - сельдерей (молодые листья), петрушка, кинза и тархун; из овощей – перец; из фруктов – авокадо. Разные сорта одного вида мало различаются по уровню активности фитаспазы; - получены препараты фитаспаз из богатых этим ферментом растений – перца и сельдерея; - охарактеризована субстратная специфичность препаратов фитаспаз перца и сельдерея и найдены оптимальные пептидные субстраты для этих ферментов. Продемонстрирована способность новых фитаспаз специфично гидролизовать пептидные гормоны животных гастрин и холецистокинин; - осуществлена идентификация фитаспаз перца. Оказалось, что в препарате фитаспазы перца присутствуют пять близкородственных белков. Все они относятся к субтилизин-подобным протеазам растений. Установленные аминокислотные последовательности вновь выявленных ферментов указывают на аспартатную специфичность этих протеаз; - показано, что низкий уровень активности фитаспазы в растениях томатов связан с низким содержанием фермента, а не с его неспособностью гидролизовать пептидные гормоны. Таким образом, результаты, полученные на этом этапе, выглядят обнадеживающими и позволяют нам двигаться дальше.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Ранее мы обнаружили и охарактеризовали новые растительные протеазы, участвующие в осуществлении программированной клеточной смерти (ПКС), вызываемой биотическими и абиотическими стрессами. Мы назвали эти протеазы, относящиеся к семейству субтилизин-подобных протеаз, фитаспазами, поскольку по своей субстратной специфичности эти протеолитические ферменты очень напоминают каспазы животных. Узнавание фитаспазами в мишени аминокислотного мотива обеспечивает исключительно высокую избирательность протеолиза. Фитаспазы гидролизуют лишь узкий круг белков, внося в них 1-2 разрыва. При поиске белков-мишеней фитаспаз мы обнаружили, что фитаспаза арабидопсиса способна in vitro гидролизовать транскрипционный фактор ABI3 A. thaliana, отщепляя короткий N-концевой фрагмент белка. Белок ABI3 – один из центральных регуляторов сигнального пути у растений, индуцируемого фитогормоном абсцизовой кислотой. Абсцизовая кислота отвечает за адаптацию и выживание растений в условиях разнообразных стрессов. Учитывая важность данного сигнального пути, мы хотим выяснить, происходит ли фрагментация транскрипционного фактора ABI3 фитаспазой in vivo, когда и как она происходит, и в чем может заключаться смысл такого процессинга. Поиск ответа на эти вопросы является 1-м направлением наших исследований. Помимо растительных (гомологичных) белков-мишеней, фитаспаза, попадая в организм человека и животных в составе растительной пищи, может иметь возможность гидролизовать белки животных (гетерологичные белки-мишени). Недавно мы показали, что фитаспаза способна in vitro гидролизовать и инактивировать пептидные гормоны человека гастрин и холецистокинин. Инактивация избыточного уровня этих пептидных гормонов востребована при многих патологических состояниях человека. Поэтому мы хотим выяснить, способна ли фитаспаза, поступающая с пищей, гидролизовать эти пептидные гормоны в организме животных и таким образом регулировать их активность. Это является 2-м направлением исследований настоящего проекта. В течение первого года выполнения проекта при исследовании фрагментации транскрипционного фактора ABI3 мы показали, что белок ABI3 процессируется фитаспазой не только in vitro, но и в растениях A. thaliana. Гидролиз белка ABI3 фитаспазой не является конститутивным. В созревающих семенах накапливается непроцессированный белок ABI3. Однако при в формировании проростков растений арабидопсиса наблюдается процессинг белка ABI3 фитаспазой. Основной вопрос, который мы задавали в этом году: как фермент (фитаспаза) и субстрат (белок ABI3) могут встретиться для осуществления такого гидролиза. Проблема заключается в том, что транскрипционный фактор ABI3 локализован преимущественно в ядре клеток, в то время как фитаспаза секретируется из клеток и в норме накапливается в межклеточной жидкости (апопласте). Мы показали, что в присутствие белка ABI3 фитаспаза перераспределяется внутрь эпидермальных клеток листьев A. thaliana и выявляется в ядре, околоядерной области и цитоплазме. При этом происходит ко-локализация фитаспазы с транскрипционным фактором ABI3, имеющим преимущественно ядерную локализацию. Выяснилось также, что ко-локализация фитаспазы и транскрипционного фактора ABI3 коррелирует с фрагментацией белка ABI3. Более того, мы обнаружили, что фитогормон абсцизовая кислота также вызывает перераспределение фитаспазы по всей эпидермальной клетке, отчасти сходное с локализацией фитаспазы в присутствие транскрипционного фактора ABI3. Интересно, что в устьичных клетках A. thaliana, способных синтезировать абсцизовую кислоту и отвечать на ее воздействие, фитаспаза выявляется как внутриклеточный белок без дополнительных воздействий. На основании полученных результатов у нас сложилось представление, что фитаспаза может быть участником сигнального пути, регулируемого гормоном абсцизовой кислотой. Нам стало ясно, что в присутствие абсцизовой кислоты фитаспаза способна перераспределяться внутрь клетки и ко-локализовываться с транскрипционным фактором ABI3. Наиболее вероятно, что свое действие фитаспаза оказывает через фрагментацию этого транскрипционного фактора. Но каков знак этого воздействия – положительный или отрицательный – нам предстоит выяснить на следующем этапе выполнения проекта. По 2-му направлению, связанному с исследованием возможности протеолиза пептидных пищеварительных гормонов человека и животных фитаспазами, на 1-м году исследований мы установили, что уровень активности фитаспазы в разных съедобных растениях может отличаться в сотни раз. Из растений-чемпионов, перца и сельдерея, мы выделили эти новые ферменты и охарактеризовали их. В частности, мы показали, что препарат нативной фитаспазы перца специфично гидролизуют пептидные гормоны человека гастрин и холецистокинин. Затем мы идентифицировали новые фитаспазы с помощью масс-спектрометрического анализа. Для дальнейших исследований нам требовались значительные количества высокоактивного, хорошо охарактеризованного и, желательно, индивидуального фермента. С этой целью в 2017 г. мы клонировали ген фитаспазы перца и получили большие количества индивидуального протеолитически активного рекомбинантного фермента. Мы выяснили с помощью анализа субстратной специфичности фермента, что он действительно является фитаспазой. Также были определены физико-химические свойства рекомбинантной фитаспазы перца: оптимум рН, устойчивость к действию химических ингибиторов, удельная активность и условия термоинактивации. Затем мы показали, что рекомбинантная фитаспаза перца способна in vitro эффективно и специфично гидролизовать и таким образом инактивировать пептидные гормоны человека и животных гастрин и холецистокинин. Наконец, мы приступили к получению трансгенных растений томата - суперпродуцентов фитаспазы перца. На основании проведенных исследований мы пришли к заключению, что обнаруженная и охарактеризованная нами фитаспаза перца обладает всеми свойствами, необходимыми для исследования влияния фитаспаз на активность гормонов гастрина и холецистокинина при пероральном введении экспериментальным животным.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Ранее мы обнаружили и охарактеризовали новые растительные протеазы, участвующие в осуществлении программированной клеточной смерти, вызываемой биотическими и абиотическими стрессами. Мы назвали эти протеазы, относящиеся к семейству субтилизин-подобных протеаз, фитаспазами, поскольку по своей субстратной специфичности эти протеолитические ферменты очень напоминают каспазы животных. Фитаспазы гидролизуют лишь узкий круг белков, внося в них 1-2 разрыва. При поиске белков-мишеней фитаспаз мы обнаружили, что фитаспаза арабидопсиса способна in vitro гидролизовать транскрипционный фактор ABI3 A. thaliana, отщепляя короткий N-концевой фрагмент белка. Белок ABI3 – один из центральных регуляторов сигнального пути у растений, индуцируемого фитогормоном абсцизовой кислотой. Учитывая важность данного сигнального пути, мы хотели выяснить, происходит ли фрагментация транскрипционного фактора ABI3 фитаспазой in vivo, когда и как она происходит, и в чем может заключаться смысл такого процессинга. Поиск ответа на эти вопросы являлся 1-м направлением наших исследований. Помимо растительных (гомологичных) белков-мишеней, фитаспаза, попадая в организм человека и животных в составе растительной пищи, может иметь возможность гидролизовать белки животных (гетерологичные белки-мишени). Ранее мы показали, что фитаспаза способна in vitro гидролизовать и инактивировать пептидные гормоны человека гастрин и холецистокинин. Инактивация избыточного уровня этих пептидных гормонов востребована при многих патологических состояниях человека. Поэтому мы хотели выяснить, способна ли фитаспаза, поступающая с пищей, гидролизовать эти пептидные гормоны в организме животных и таким образом регулировать их активность. Это являлось 2-м направлением исследований настоящего проекта. В течение первого и второго года выполнения проекта при исследовании фрагментации транскрипционного фактора ABI3 мы показали, что транскрипционный фактор ABI3 подвергается фрагментации фитаспазой арабидопсиса не только in vitro, но и in vivo - в растениях Arabidopsis thaliana. Также выяснилось, что расщепление транскрипционного фактора ABI3 не происходит постоянно. В семенах арабидопсиса, где этот белок накапливается, ABI3 сохраняет интактность. Однако при прорастании семян и формировании молодых проростков включается механизм гидролиза этого транскрипционного фактора. Мы также выяснили, как фитаспаза (белок, секретируемый из клетки и в норме накапливающийся в межклеточной жидкости - апопласте), и транскрипционный фактор ABI3 (белок преимущественно ядерный) могут встретиться для осуществления взаимодействия. Оказалось, что обработка абсцизовой кислотой (или продукция в растениях белка ABI3) приводит к частичному перемещению фитаспазы внутрь клеток, тем самым снимая противоречие в различной локализации фермента и его субстрата. Таким образом, мы получили подтверждение взаимосвязи фитаспазы и сигнального пути абсцизовой кислоты на биохимическом и клеточном уровне. В 2018 г. мы хотели проверить наличие такой связи на генетическом уровне. Для этого мы провели полнотранскриптомный анализ двух линий арабидопсиса – линии дикого типа и линии с инактивированным геном фитаспазы. Анализ показал, что в отсутствие обработки абсцизовой кислотой инактивация гена фитаспазы может сказываться на экспрессии генов как положительно, так и отрицательно. Наиболее представленными категориями генов, реагирующими на наличие/отсутствие фитаспазы, оказались гены ответа на стрессовые воздействия и гены сигнальных путей фитогормонов. Анализ транскриптомов растений двух линий, обработанных абсцизовой кислотой, выявил порядка 200 генов, чья экспрессия в двух линиях в ответ на обработку фитогормонов различалась. Среди этих дифференциально экспрессирующихся генов оказалось 10 генов-мишеней транскрипционного фактора ABI3. Для большинства из этих генов фитаспаза выступала как позитивный регулятор экспрессии. В качестве альтернативного подхода мы сравнили влияние фитаспазы на функционирование транскрипционного фактора ABI3 путем конструирования трансгенных растений арабидопсиса (производных от линий дикого типа и линии, нокаутной по гену фитаспазы), содержащих дополнительно введенный ген транскрипционного фактора ABI3 под контролем конститутивного промотора. Мы обнаружили, что наличие фитаспазы существенно усиливает ингибирующее действие транскрипционного фактора ABI3 на развитие растений арабидопсиса, т.е. фитаспаза является положительным регулятором его активности. Наконец, проведенный анализ транскрипционной активности белка ABI3 в зависимости от уровня фитаспазы в растениях с помощью репортерной плазмидной конструкции также указывал на возможность положительного влияния фитаспазы на транскрипционную активность белка ABI3. Исследуя динамичную локализацию фитаспазы, мы выяснили, что перераспределение фитаспазы из апопласта внутрь клеток может происходить не только при индукции программированной клеточной смерти, но и под действием ряда фитогормонов. Следует отметить, что ни для одной из многих десятков субтилаз растений (к которым относится фитаспаза), такого ретроградного транспорта ранее выявлено не было. Помимо этого, мы установили, что ключевую роль в специфичной интернализации фитаспазы, происходящей при индукции программированной клеточной смерти, играет клатрин-зависимый эндоцитоз. По 2-му направлению, связанному с исследованием возможности протеолиза пептидных пищеварительных гормонов человека и животных фитаспазами, в течение первого и второго года выполнения проекта мы установили, что уровень активности фитаспазы в разных съедобных растениях может отличаться в сотни раз. Из растений-чемпионов, перца и сельдерея, мы выделили эти новые ферменты и охарактеризовали их. В частности, мы показали, что препарат нативной фитаспазы перца специфично гидролизуют пептидные гормоны человека гастрин и холецистокинин. Затем мы идентифицировали и клонировали ген фитаспазы перца и получили большие количества индивидуального высокоочищенного протеолитически активного фермента для проведения опытов на экспериментальных животных. Задачей завершающего этапа была оценка влияния фитаспазы, поступающей в организм мышей, на активность пептидных гормонов. Были проведены две серии независимых экспериментов, давших сходные результаты. Мы обнаружили, что фитаспаза перца, вводимая мышам перорально, вызывает дозо-зависимые статистически значимые поведенческие эффекты. Поскольку холецистокинин вызывает паническое состояние и беспокойство у животных, мы ожидали, что прием фитаспазы будет иметь успокаивающее действие. Но оказалось, что эффект прямо противоположен: у животных возрастала тревожность, усиливалась моторная активность и реакция на негативный стимул. Отсутствие эффекта при введении термоинактивированной фитаспазы указывает на важность протеолитической активности фермента для его действия.